專利名稱：癌癥和傳染病治療的組合物及方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及預防或治療癌癥或惡性疾病以及傳染病的新的組合物和方法。特別地，本發(fā)明涉及促進1型免疫應答(如Thl細胞)的誘導和/ 或擾亂調(diào)節(jié)性T (Treg)細胞的一種組合物和方法。本發(fā)明進一步將本發(fā)明 的組合物的應用延伸到了疾病治療中。
背景技術(shù)：
自身免疫系統(tǒng)細胞，尤其是樹突狀細胞(DC),主導原態(tài)CD4+T細胞 分化為功能各異的Thl、 Th2或調(diào)節(jié)性T (Treg)細胞亞型。由保守的 (conserved)微生物分子與病原識別受體(PRR)如Toll樣受體(TLR)和 粘合素等的結(jié)合引起的未成熟DC的激活，伴隨著成熟和向淋巴結(jié)的歸巢， 在淋巴結(jié)中成熟的DC將抗原(Ag)呈遞至原態(tài)T細胞。由病原來源分子 引起的DC的激活對于調(diào)控原態(tài)CD4+ T細胞分化為不同的T細胞亞型起 重要作用。Thl細胞可賦予針對細胞內(nèi)感染和腫瘤的保護作用，但也與炎 癥反應和自身免疫疾病偶聯(lián)，而Th2細胞參與過敏反應。Treg細胞可抑制 Thl和Th2反應。免疫活性個體中的腫瘤發(fā)展可能反映出免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原識別失 敗，或可能由通過調(diào)節(jié)性T細胞的誘導和激活導致的抗腫瘤免疫應答的受 擾亂引起，調(diào)節(jié)性T細胞的誘導和激活可能受到了肺瘤生長環(huán)境的進一步 影響。自身和適應性免疫應答可被誘導來抗腫瘤，保護性效應細胞包括 CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL )、產(chǎn)生IFN-y的CD4+和CD8+ T細胞、 NK細胞和巨噬細胞。雖然T細胞通常含一個結(jié)合于腫瘤位點的主要免疫 細胞群，但它們經(jīng)常對殺死胂瘤無效，有證據(jù)表明這可能由調(diào)節(jié)性T細胞 的功能引起(Woo, E. Y" et al., 2002 ￡wr J/mmw"o/ 32;3267 )。自然CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細胞表達轉(zhuǎn)錄抑制因子Foxp3，作為胸腺來 源的成熟T細胞出現(xiàn)，在維持對自身抗原的耐受和防止自身免疫作用中起 重要作用(Sakaguchi， S. 2000. Ce〃 101:455-458 )。分泌IL-10 (定名為Trl細胞)或TGF - |3 (定名為Th3細胞)的誘導性 的調(diào)節(jié)性T細胞響應病原和自身抗原而在外周區(qū)域產(chǎn)生。在感染過程中， 自然的和誘導性的T細胞可通過防止病原誘導的免疫病癥而對寄主起有益 作用。然而，也有報道稱由病原誘導或激活的調(diào)節(jié)性T細胞可能是擾亂保 護性免疫的一種策略，且顯示CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的損耗提高了特 定感染的存活率(Mills, K.H. and P. McGuirk. 2004. 5fem/" /附附w"o/ 16:107-117)。 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的損耗也可加強抗胂瘤免疫。效應 性和調(diào)節(jié)性T細胞之間的平衡可能也受腫瘤生長環(huán)境的影響，與腫瘤生長 的消散或發(fā)展可能存在相關。因此如果調(diào)節(jié)性T細胞受阻遏，使得效應性 T細胞反應加強，可能會使抗胂瘤疫苗或藥劑更有效。Toll樣受體Toll樣受體(TLR)超家族對入侵病原的識別和免疫應答的啟動起中 心作用。迄今已發(fā)現(xiàn)了 13個人類TLR。每個TLR識別不同的病原相關的 分子模式(PAMP)，導致信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應的激活，然后激活轉(zhuǎn)錄因子 NF- k B及促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、 p38、 c-jun、 N末端激酶(JNK) 和p42/44。 TLR-3和TLR-4也激活另一途徑，在轉(zhuǎn)錄因子、干擾素調(diào)節(jié)因 子3 (IRF3)的激活中效應最大，干擾素調(diào)節(jié)因子3結(jié)合于干擾素敏感效 應元件(ISRE)，誘導包括IFN-P的一系列基因。TLR為一更大的超家族 的成員，稱為白介素-1受體(IL-R) /TLR超家族，其也包含IL-1R1亞 群和含TIR結(jié)構(gòu)域接頭亞群。所有三個亞群都具有細胞質(zhì)Toll/IL-l受體 (TIR)結(jié)構(gòu)域，它對信號轉(zhuǎn)導是重要的。TLR具有胞外富含亮氨酸的重 復序列，而IL-1R1亞群具有胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。接頭分子為細胞質(zhì)定 位的，不含胞外結(jié)構(gòu)域。Toll樣受體(TLR)激動劑已作為腫瘤疫苗的佐劑在臨床試驗中得到 檢驗。此療法是基于TLR激動劑促進1型反應，尤其是激活分泌IFN-y的 Thl細胞、NK細胞和CD8CTL。迄今的結(jié)果已顯示此療法增強了抗腫瘤 免疫應答，但無真實跡象顯示可防止腫瘤生長，雖然在小鼠模型中的數(shù)據(jù) 顯示可能有一定的效果(Micronnel， I., S. et al. 2002. J7mww"o/ M&72")。疫苗抗傳染病疫苗一般通過抗原特異性效應T細胞的產(chǎn)生，賦予機體對傳 染的保護性(預防性)免疫，效應T細胞促進中和抗體的產(chǎn)生及介導抗病 原的細胞免疫。這些反應可在記憶性T和B細胞產(chǎn)生后被召回，在量和質(zhì) 上受疫苗配方中佐劑的影響。佐劑可為加入抗原配方中的外源免疫調(diào)節(jié)劑 或減活或滅活的病毒或細菌疫苗的內(nèi)源組分，它通過與TLR和其它病原識 別受體的相互作用而非特異性地激活自身免疫應答。TLR激動劑包括LPS、 CPG -寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)和PolyIC，和全細菌體，包括百日咳 4干菌(5ordete〃a /7eWwss^)和結(jié)才亥分牙支桿菌(AfycoZj<3cfeWw/M fwZjerci/Zos^), 都具有佐劑活性，可促進效應T細胞和對共注射抗原的抗體反應?？寡仔约毎蜃右种苿┮阎h(huán)氧合酶-2(Cox-2)抑制劑被用作對多種癌癥有一定效果的藥 物。Cox-2是一種由炎癥刺激誘導的酶，可在腫瘤組織內(nèi)誘導前列腺素 E2(PGE2)合成。PGE2是IL-10的有效誘導劑。Cox-2促進血管形成、細胞 增殖，使細胞對細胞凋亡具有抗性，這解釋了 Cox-2的選擇性抑制劑(如 塞來昔布(CELECOXIB)和NS-398)對腫瘤生長的作用。MAP激酶抑制劑對炎癥疾病的作用已得到臨床驗證，且之前ERK和 p38在體外細胞死亡和肺瘤細胞存活中被提到。本發(fā)明的驚人發(fā)現(xiàn)是用免疫系統(tǒng)已知調(diào)節(jié)劑的一種特殊聯(lián)合給藥可 使這些調(diào)節(jié)劑的效價得到協(xié)同提高，這使得發(fā)明人得出了改進的治療組合 物，其通過阻遏可抑制促炎性免疫應答的抗炎性反應，而對治療和/或預防 癌性疾病和傳染病具有作用。已知調(diào)節(jié)性t細月包可表達抗炎性細胞因子如il-10和/或tgf-P，已知 這些細胞因子的表達可阻遏免疫應答。調(diào)節(jié)性T細胞也通過細胞-細胞接 觸阻遏免疫應答。當被阻遏的免疫應答定向為抗腫瘤細胞發(fā)展時，免疫應
答的阻遏可促進腫瘤生長。因此，抗炎性細胞因子如IL-10和/或TGF-卩或 調(diào)節(jié)性T細胞的抑制劑，可對提高抗癌癥治療或傳染病治療的效果，尤其 是疫苗的效果有用。發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種組合物用于治療需要增強Thl介 導的免疫應答的疾病，所述組合物包括(i) 至少一種Toll樣受體(TLR)激動劑，和(ii) 至少一種免疫調(diào)節(jié)劑，其可抑制對免疫應答的阻遏，這種阻遏由對 調(diào)節(jié)性T細胞功能的選擇性抑制引起，或其引起細胞因子表達的調(diào)節(jié)，導 致至少一種抗炎性細胞因子受到阻遏和至少一種促炎性細胞因子上調(diào)。受到阻遏的抗炎性細胞因子可能為IL-10和/或TGF-P。上調(diào)的促炎性 細胞因子可能為IL-12,或任何其它促炎性細胞因子如干擾素Y、 IL-1和 TNF國P。促炎性細胞因子的上調(diào)可促進由效應細胞如Thl細胞和CTL(細胞毒 性T淋巴細胞)介導的炎性反應。免疫調(diào)節(jié)劑是一種抑制性化合物，其阻遏或抑制至少一種參與介導抗 炎免疫應答的分子，或參與介導某種抗炎免疫應答的途徑?？寡追磻奶卣魇羌毎蜃覫L-10的產(chǎn)生和Treg細胞的產(chǎn)生，如Trl 或Th3細月包。對IL-10和/或TGF-P的產(chǎn)生和/或IL-12的上調(diào)的適宜的抑制作用，是 在自身免疫系統(tǒng)細胞如樹突狀細胞中進行調(diào)節(jié)。免疫調(diào)節(jié)劑引起IL-10的產(chǎn)生受到適當阻遏或IL-10的功能受到適當抑 制。免疫調(diào)節(jié)劑可進一步引起TGF-(3的功能受到阻遏或抑制。這種對細胞 因子響應(IL-10和/或TGF-p)的調(diào)節(jié)，尤其是對自身免疫系統(tǒng)細胞的細 胞因子表達譜的調(diào)節(jié)可抑制Treg細胞的誘導，它是具有免疫抑制活性的T 細胞亞群。本發(fā)明的化合物除可調(diào)節(jié)IL-10和TGF-P外，也可調(diào)控更多的
已知可誘導抗炎效果的細胞因子的表達。免疫調(diào)節(jié)化合物可進一步阻遏調(diào)節(jié)性T細胞和免疫系統(tǒng)的其它細胞之 間的細胞-細胞直接接觸，阻止由此機制介導的對促炎免疫應答的阻遏作 用。"調(diào)節(jié)性T細胞功能的選擇性抑制，，意為調(diào)節(jié)性T細胞受到抑制，以 至其不能阻遏促炎性免疫應答或介導抗炎性免疫應答，特別是通過細胞_ 細胞直接接觸的方式。如此處所定義，術(shù)語"上調(diào)"的^f吏用涉及細胞因子產(chǎn)生增加時，意為 其活性或表達強于靜止細胞中所觀察到的。如此處所定義，名詞"阻遏"的使用涉及細胞因子產(chǎn)生減少時，意為 其活性或表達低于靜止細胞中所觀察到的。如此處所定義，名詞"抑制，，的使用涉及細胞因子產(chǎn)生受到抑制時， 意為其活性或表達與靜止細胞中所觀察到的活性或表達水平相比受到抑 制或基本受到抑制。在一實施方案中，至少一種Toll樣受體(TLR)激動劑可為本領域技 術(shù)人員所知的任何合適的TLR激動劑。TLR激動劑具有對TLR的結(jié)合親 和力和特異性，它的結(jié)合可激活TLR并介導下游信號轉(zhuǎn)導。TLR激動劑可對TLR-2、 TLR-3、 TLR-4、 TLR-5、 TLR-6、 TLR-7、 TLR-8和TLR-9中的至少一種具有結(jié)合特異性。適宜的TLR激動劑的特 例包括但不限于Pam3CSK4、酵母多糖、PolyIC、雙鏈RNA、 LPS(月旨多糖)、 單磷酰脂A(MPL)、鞭毛蛋白、CpG-ODN(CPG-寡脫氧核香酸)、咪壹莫 特、R838和R837。此外，全細菌體如百日咳桿菌(萬or&te/to/ emmk ) 和結(jié)核分4支桿菌(鄉(xiāng)co6ac&Www ft^woz/ow; )也可作為TLR激動劑(Toll 激動劑)。此外，上面所列的TLR激動劑的合適的類似物也可被利用，此 處所稱類似物的功能可激活至少一種Toll樣受體。免疫調(diào)節(jié)劑是一種可抑制免疫應答的下游介質(zhì)的功能的合適的化合 物。調(diào)節(jié)效應對靶具有合適的選擇性。抑制劑對靶的活性的抑制具有數(shù)量
號轉(zhuǎn)導和信號調(diào)節(jié)的能力。在更多實施方案中，免疫調(diào)節(jié)劑可包括以下至少 一種物質(zhì)的至少 一種抑制劑MAP激酶蛋白、Cox-2、 ERK、 p38或pl3k。免疫應答是一種抗炎反應或自身免疫應答，可適當促進調(diào)節(jié)性T細胞 的誘導。在一個實施方案中，免疫調(diào)節(jié)劑為MAP激酶蛋白或MAP激酶途 徑的抑制劑，合適地為選擇性抑制劑。MAP激酶(促分裂原活化激酶)是 參與細胞反應、炎癥和生長的蛋白。p38激酶(p38 )是MAP激酶的應激活化蛋白激酶(SAPK)亞群的一 個成員。在哺乳動物細胞中，p38激酶信號轉(zhuǎn)導途徑參與細胞對脅迫的反 應，已知其也對細胞凋亡的上調(diào)具有功能。已知p38激酶的激活可增加使 炎性反應形成的分子如IL-1、 TNF和Cox-2的產(chǎn)生。在一個實施方案中抑制劑為一種p38激酶抑制劑。該抑制劑可抑制至 少一種p38激酶異型體的功能。因而此抑制劑被用于抑制p38信號轉(zhuǎn)導途 徑的功能。優(yōu)選地，p38激酶抑制劑為SB203580或其藥學上可接受的鹽或 溶劑化物或類似物，此類似物具有p38抑制劑活性。選擇性地，抑制劑可 為SB220025或SB239063或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或類似物，此 類似物具有p38激酶抑制劑活性。ERK(胞外調(diào)節(jié)的激酶)是MAP激酶的一個族，可調(diào)控細胞的生長和增殖。在一個實施方案中抑制劑為ERK抑制劑，合適地為選擇性ERK抑制 劑。優(yōu)選地，ERK抑制劑為U0126或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或類 似物，此類似物具有ERK抑制劑活性。選擇性地，抑制劑可為PD98059 或類似物，此類似物具有ERK抑制劑活性。在一另外的實施方案中ERK 抑制劑與p38抑制劑化合物同時提供。在另外的實施方案中免疫調(diào)節(jié)劑可為更多的MAP激酶如MEK1或 MEK2的抑制劑，可能是抑制或封閉Thl信號轉(zhuǎn)導途徑中位于MAP激酶 下游某點的轉(zhuǎn)錄因子的化合物。這種轉(zhuǎn)錄因子的其中一例是c-Fos。在另外一實施方案中，免疫調(diào)節(jié)劑為磷酯酰肌醇激酶-3的抑制劑，
適宜地為選擇性抑制劑。磷酯酰肌醇激酶-3 (pI3K)為一種調(diào)控細胞壽 命的原癌基因。在一實施方案中pBK抑制劑為LY294002,其藥學上可接受的鹽或溶 劑化物或類似物，其類似物具有pI3K抑制劑活性。選擇性地，pI3K抑制 劑可為渡曼青霉素(WMN)。在另外一實施方案中，免疫調(diào)節(jié)劑為Cox-2(環(huán)氧合酶2)抑制劑。合適 的Cox-2抑制劑包括塞來昔布(CELEBREX (NS-398), Pfizer公司)、 BEXTRA (Pfizer公司)、羅非可昔(Rofecoxib) (VIOXX， Merck)或其藥學上 可接受的鹽或溶劑化物或類似物，其類似物具有Cox-2抑制劑活性。合適 的Cox-2抑制劑為選擇性抑制劑。通過抑制能夠生成IL-10或TGF-p的誘導的調(diào)節(jié)性T細胞或表達 Foxp3的天然調(diào)節(jié)性T細胞的誘導，Cox-2抑制劑的給藥使免疫應答向Thl 途徑偏移。依據(jù)本發(fā)明的此方面，Cox-2抑制劑和TLR激動劑的共同給藥 可使天然的和誘導的調(diào)節(jié)性T細胞都受抑制。發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)當與TLR激動劑一起給藥時，Cox-2的抑制可阻遏抗 炎性細胞因子IL-10和TGF-p的產(chǎn)生。此外在受Toll樣受體激動劑刺激后， Cox-2抑制劑也顯示可誘導IL-27 mRNA的產(chǎn)生，進一步也觀察到可增加 由樹突狀細胞產(chǎn)生的IL-12p40和IL-12p35,而同時減少了 IL-10mRNA的 表達。組合物可另含至少一種腫瘤特異性抗原。腫瘤特異性抗原可來源于熱 激蛋白與從癌細胞或癌性疾病個體中分離的抗原性肽之間形成的復合物。在一實施方案中，組合物可另含抑制可增強腫瘤細胞生長的腫瘤細胞 產(chǎn)物的化合物。此化合物可能引起腫瘤存活時間的延長，通過例如賦予耐 藥性或賦予對細胞凋亡的抗性。本領域技術(shù)人員將熟知此類化合物的例 子。如此處所定義的，"需要Thl介導的免疫應答得到加強的疾病"可為癌 癥或惡性疾病，或進一步地，所稱疾病可為傳染病。此種疾病的例子將在 下文描述。 本發(fā)明的另一方面提供了 一種藥物組合物用于加強Thl介導的免疫應 答，此組合物包括至少一種Toll樣受體激動劑和至少一種能夠抑制對免疫 應答的阻遏的免疫調(diào)節(jié)化合物，此處的阻遏作用由對調(diào)節(jié)性T細胞的功能 的選擇性抑制引起，或其導致對細胞因子表達的調(diào)節(jié)，如伴隨藥學上可接 受的賦形劑、稀釋液或載體的使用，使至少一種抗炎性細胞因子受到阻遏 及至少一種促炎性細胞因子上調(diào)。在一實施方案中，免疫調(diào)節(jié)劑選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細胞的功能，導致 其不能阻遏細胞-細胞接觸介導的促炎性免疫應答。在一實施方案中，抗炎性細胞因子IL-10的生成受到調(diào)節(jié)劑的抑制或 阻遏而促炎性細胞因子IL-12的生成得到增強。免疫調(diào)節(jié)劑是能夠抑制免疫應答的下游介質(zhì)的功能的合適的化合物， 且可能為一種特殊的MAP激酶蛋白的抑制劑。抑制劑可能為p38激酶抑 制劑、ERK抑制劑、MEK1或MEK2抑制劑、pI3K抑制劑或Cox-2抑制 劑中的至少一種。合適的TLR激動劑包括但不局限于Pam3CSK4、酵母多糖、PolyIC、 雙鏈RNA、 LPS(月旨多糖)、單磷酰脂A(MPL)、鞭毛蛋白、CpG-ODN(CPG-寡脫氧核苷酸)、咪喹莫特、R838和R837。此外，全細菌體如百日咳桿菌 (^ordefe/Aa / erftwsis )和纟吉才亥分4支桿菌(柳co6acfen'w附/w6e/rw/os/s )也可 作為TLR激動劑(Toll激動劑)。在一實施方案中，Thl免疫應答的增強使得該藥物組合物可被用于治 療或預防癌癥或惡性疾病或傳染病。在一實施方案中，組合物可能另含能夠抑制腫瘤生長和發(fā)育或能夠抑 制或阻遏可促進肺瘤生長的產(chǎn)物或介質(zhì)的功能的調(diào)節(jié)化合物。此調(diào)節(jié)化合 物可能抑制或阻遏任何引起肺瘤存活延長的分子或途徑的功能。例如調(diào)節(jié) 化合物可抑制腫瘤細胞的耐藥性或抑制其對細胞凋亡的抗性。本發(fā)明的另一方面提供了一種治療或預防需要加強Thl介導的免疫應 答的疾病的方法，此方法含以下步驟-用至少一種Toll樣受體激動劑的治療有效量給藥，以及 -用至少 一種能夠抑制對免疫應答阻遏的免疫調(diào)節(jié)劑的治療有效量給藥，此處的阻遏作用由對調(diào)節(jié)性T細胞的功能的選擇性抑制引起，或其 導致對細胞因子表達的調(diào)節(jié)，使至少 一種抗炎性細胞因子受到阻遏及至少 一種促炎性細胞因子上調(diào)。在一實施方案中，抗炎性細胞因子IL-10的生成受到免疫調(diào)節(jié)劑的抑 制或阻遏而促炎性細胞因子IL-12的生成得到增強。免疫調(diào)節(jié)劑引起至少IL-10的功能的阻遏或抑制。調(diào)節(jié)劑可進一步引 起TGF-P的功能的阻遏或抑制。這種對細胞因子響應的調(diào)節(jié)，尤其是對自 身免疫系統(tǒng)細胞的細胞因子表達譜的調(diào)節(jié)可抑制Treg細胞的誘導，其為T 細胞的亞群，具有阻遏活性。除對IL-10和TGF-(3進行調(diào)控外，本發(fā)明的 化合物可能調(diào)控更多的已知可誘導抗炎效果的細胞因子或介質(zhì)的表達。另外，免疫調(diào)節(jié)劑可介導IL-12的表達或功能活性的增強。也可觀察 到更多促炎性細胞因子如IL-1、 TNF-P或IFN-y的上調(diào)。IL-10和/或TGF-卩的產(chǎn)生的適當抑制和/或IL-12的適當?shù)纳险{(diào)是在自 身免疫系統(tǒng)的細胞中受到調(diào)控的，如樹突狀細胞。免疫調(diào)節(jié)劑是一種抑制免疫應答的下游介質(zhì)的功能的適當化合物，可 特別作為一種MAP激酶蛋白抑制劑。抑制劑可能為以下物質(zhì)中的至少一 種p38激酶抑制劑、ERK抑制劑、MEK1或MEK2抑制劑、pI3K抑制 劑或Cox-2抑制劑。合適的TLR激動劑包括但不局限于Pam3CSK4、酵母多糖、PolyIC、 雙鏈RNA、 LPS(月旨多糖)、單磷酰脂A (MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN(CPG-寡脫氧核苷酸)、咪喹莫特、R838和R837。此外，全細菌體如百日咳桿菌 (Sorde/e〃a/^Wmss/s )和纟吉斗玄分才支桿菌(聊co6acte〃'ww ^/Z)ercw/as7.51)也可 作為TLR激動劑(Toll激動劑)。在一個實施方案中，將Toll樣受體激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物對接受者 進行共同給藥。可選地，將Toll樣受體激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物分開或先 后給藥，且在此實施方案中，Toll樣受體激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物的給藥 方法可能不同。
接受者一般為哺乳動物。在另外的實施方案中，接受者為人。 本發(fā)明可用于提供一種治療或預防任何已知類型的癌癥或惡性疾病的方法。癌癥或惡性疾病可包括纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨 肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮 肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、 胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、 汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、嚢腺癌、髓樣癌、支氣管癌、 腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、腎母細胞 瘤、宮頸癌、睪丸癌、肺癌、肺小細胞癌、膀胱癌、上皮癌、膠質(zhì)瘤、星 形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、 聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠i瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經(jīng)母細胞瘤、^L網(wǎng)膜 母細胞瘤、白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、華氏巨球蛋白血癥和重鏈病。本發(fā)明的組合物、藥物組合物和方法用于治療傳染病，傳染病可包含 但不限于以下細菌或病毒引起麻風桿菌、結(jié)核分枝桿菌、利什曼原蟲、 百日咳桿菌、瘧疾、流感病毒、艾滋病病毒、丙型肝炎病毒。本發(fā)明的另 一方面是提供了 一種組合物的應用，它含至少一種Toll樣 受體激動劑和免疫調(diào)節(jié)劑，其可通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細胞的功能或調(diào) 控細胞因子的表達而引起至少一種抗炎性細胞因子受到阻遏及至少一種 促炎性細胞因子上調(diào)而抑制對免疫應答的阻遏，用于治療需要增強Thl介 導的免疫應答的疾病。在一個實施方案中此疾病為惡性或癌性疾病。在另 一個實施方案中此 疾病為傳染病。在一個實施方案中抗炎性細胞因子IL-10的產(chǎn)生受到免疫調(diào)節(jié)劑的抑 制或阻遏，而促炎性細胞因子IL-12的產(chǎn)生得到增強。免疫調(diào)節(jié)劑引起至少IL-10的功能的適當阻遏或抑制。此調(diào)節(jié)劑可能 進一步引起TGF-P的功能的阻遏或抑制。這種對細胞因子響應的調(diào)節(jié)，尤 其是對自身免疫系統(tǒng)細胞的細胞因子表達譜的調(diào)節(jié)可抑制調(diào)節(jié)性T細胞的 誘導，它是T細胞的亞群，具有阻遏活性。除了對IL-10和TGF-卩調(diào)控夕卜,
本發(fā)明的化合物可能調(diào)控更多的已知可誘導抗炎效應的細胞因子或介質(zhì)的表達。此調(diào)節(jié)劑也可能抑制調(diào)節(jié)性T細胞對細胞-細胞接觸的阻遏。另外，此免疫調(diào)節(jié)劑可介導IL-12的表達或功能活性的增強。也可觀 察到更多的促炎性細胞因子如IL-1、 TNF-p或IFN-y的上調(diào)。對IL-10和/或TGF-P的產(chǎn)生的適當抑制和/或IL-12的適當上調(diào)的調(diào)節(jié) 作用是在自身免疫系統(tǒng)細胞中進行的，例如樹突狀細胞。合適的TLR激動劑包括但不局限于Pam3CSK4、酵母多糖、PolyIC、 雙鏈RNA、 LPS(月旨多糖)、單磷酰脂A(MPL)、鞭毛蛋白、CpG-ODN(CPG-寡脫氧核苷酸)、咪喹莫特、R838和R837。此外，全細菌體如百日咳桿菌 (Bordetella pertussis)和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)也可 作為TLR激動劑(Toll激動劑)。免疫調(diào)節(jié)劑是一種適當抑制免疫應答的下游介質(zhì)的功能的化合物，可 特別作為一種MAP激酶蛋白抑制劑。抑制劑可能為p38激酶抑制劑、ERK 抑制劑、MEK1或MEK2抑制劑、pI3K抑制劑或Cox-2抑制劑中的至少 一種。本發(fā)明的另 一方面是提供了至少 一種Toll樣受體激動劑和免疫調(diào)節(jié)劑 的應用，此調(diào)節(jié)劑通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細胞的功能或調(diào)控細胞因子的 表達而引起至少一種抗炎性細胞因子受到阻遏及至少一種促炎性細胞因 子上調(diào)而抑制對免疫應答的阻遏，用于制備治療需要增強Thl介導的或其 它效應的免疫應答的疾病的藥物。在一個實施方案中此疾病為惡性或癌性疾病。在另 一個實施方案中此 疾病為傳染病。免疫調(diào)節(jié)劑是一種適當抑制免疫應答的下游介質(zhì)的功能的化合物，可 特別作為一種MAP激酶蛋白抑制劑。抑制劑可能為p38激酶抑制劑、ERK 抑制劑、MEK1或MEK2抑制劑、pI3K抑制劑或Cox-2抑制劑中的至少 一種。合適的TLR激動劑包括但不局限于Pam3CSK4、酵母多糖、PolyIC、 雙鏈RNA、 LPS(月旨多糖)、單磷酰脂A (MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN(CPG-
寡脫氧核苷酸)、咪會莫特、R838和R837。此外，全細菌體如百日咳桿菌 (5orafefe〃a/ eWwswi)和結(jié)4亥分才支4干菌(iVfycc^acferfKm fw&ercM/osi's)也可 作為TLR激動劑(Toll激動劑)。在另外的特殊實施方案中，本發(fā)明延伸為改進抗癌癥或黑色素瘤疫苗 的效價。發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)一種組合物，其含抗癌疫苗成分(如腫瘤特異性 疫苗)和抑制調(diào)節(jié)性T細胞或IL-10產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)化合物，可作為治療 癌癥和惡性疾病的異常有效的藥物組合物。以非活性物質(zhì)如蛋白接種一般會引起抗體反應和CD4+輔助性T細胞 反應以及Thl或Th2反應。另一方面，以活性物質(zhì)如活病毒或細胞內(nèi)細菌 接種或感染一般會引起CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應。Thl和 CTL反應對針對癌癥、病原性病毒和細胞內(nèi)細菌的保護作用是重要的。Th2 反應對針對細胞外細菌和寄生蟲的保護作用是重要的。相應地，本發(fā)明的更多方面提供了一種治療癌癥或惡性疾病的組合 物，包括(i) 組合物，其包括至少一種可引發(fā)免疫應答的腫瘤特異性抗原，所 述應答對癌癥或惡性疾病特異，(ii) 至少一種Toll樣受體激動劑；和(iii) 免疫調(diào)節(jié)劑，其通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細胞的功能或調(diào)控細 胞因子的表達而引起至少一種抗炎性細胞因子受到抑制及至少一種促炎 性細胞因子上調(diào)而抑制對免疫應答的阻遏。含至少一種腫瘤特異性抗原的組合物為一種合適的癌癥疫苗，或含至 少一種抗原(Ag)的疫苗成分。腫瘤特異抗原可進一步為一種已知的代表 某一特殊類型腫瘤的抗原。合適的TLR激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物已在上文中描述。對細胞因子響應特別是免疫系統(tǒng)細胞的細胞因子表達譜的調(diào)控可抑 制調(diào)節(jié)性T細胞的誘導。這可能由對IL-10的阻遏或抑制而介導。腫瘤疫苗可為任何合適的疫苗或疫苗片l殳，例如全細胞疫苗、DNA疫
苗、亞單位疫苗或肽疫苗。免疫調(diào)節(jié)化合物與抗原一起給藥，IL-10的產(chǎn)生可能進一步上調(diào)細胞 因子IL-12的產(chǎn)生。IL-12可使免疫應答向'Thl，途徑偏移。在另外的情 況中，IL-10抑制劑可能并不特異地誘導IL-12產(chǎn)生，但是這可能由IL-IO 產(chǎn)生的減少而間接引起。Thl免疫應答的誘導一般伴隨著對調(diào)節(jié)性T細胞免疫應答的擾亂。本發(fā)明的另 一 方面提供了 一種藥物組合物，用于治療或預防癌癥或惡 性疾病，此組合物包括至少一種引發(fā)免疫應答的腫瘤特異性抗原，至少一 種TLR激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物以及藥學上可接受的賦形劑、稀釋液或載 體。合適的TLR激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物已在上文中描述。在一個實施方案中，胂瘤特異抗原來源于癌癥疫苗或疫苗成分。本發(fā)明的另一方面提供了一種用于治療癌癥或惡性疾病的方法，此方 法包括以下步驟-用抗癌疫苗或其含至少一種腫瘤特異性抗原的抗原性片段或決定 簇給藥；-用至少一種Toll樣受體激動劑給藥，以及-用治療有效量的至少一種免疫調(diào)節(jié)化合物向需要的接受者給藥，此 化合物可在自身免疫系統(tǒng)的細胞中，通過抑制IL-10和/或TGF-P和/或上 調(diào)IL-12而調(diào)控細胞因子的反應。調(diào)節(jié)劑通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細胞的功能或調(diào)控細胞因子的表達而 引起至少一種抗炎性細胞因子受到阻遏及至少一種促炎性細胞因子上調(diào) 而適當抑制對免疫應答的阻遏。合適的TLR激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物已在上文中描述。接受者一般為哺乳動物。在另外的實施方案中，接受者為人。本發(fā)明還有另一方面是提供了包括至少一種腫瘤特異性抗原、至少一 種Toll樣受體激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物的組合物用于治療癌癥或惡性疾病
的應用，該免疫調(diào)節(jié)化合物可通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細胞的功能或調(diào)控 細胞因子的表達而引起至少一種抗炎性細胞因子受到阻遏及至少一種促 炎性細胞因子上調(diào)而抑制對免疫應答的阻遏。本發(fā)明還有另一方面是提供了包括至少一種腫瘤特異性抗原、至少一 種Toll樣受體激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物的組合物用于制備治療癌癥或惡性 疾病的藥物的應用，該免疫調(diào)節(jié)化合物可通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細胞的 功能或調(diào)控細胞因子的表達而引起至少一種抗炎性細胞因子受到阻遏及 至少一種促炎性細胞因子上調(diào)而抑制對免疫應答的阻遏。合適的TLR激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物已在上文中描述。接受者一般為哺乳動物。在另一實施方案中，接受者為人。另一方面，本發(fā)明延伸為一種疫苗組合物，其包括從癌癥細胞或具有 癌癥疾病的個體中分離的熱激蛋白，且一種抗原性肽與其非共價復合。此 熱激蛋白-抗原性肽復合物(HSP-Ag)可向個體施藥，以誘導抗原性肽定 向的免疫應答。發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)用于抑制免疫系統(tǒng)的免疫介質(zhì)如Cox-2抑 制劑的共同給藥，能夠引起針對復合了 HSP的抗原的免疫應答增強。 HSP-Ag復合體的分離使得抗原可被抗原呈遞細胞呈遞至免疫系統(tǒng)，使在 抗原被識別為非自身物質(zhì)時產(chǎn)生免疫應答。這種HSP-Ag復合物的實例之一為熱激蛋白HSP-70與腫瘤特異性肽 形成的復合體。在此方面，本發(fā)明提供的用于治療癌癥或惡性疾病的組合 物包括(i) 與抗原性肽復合的熱激蛋白；和(ii) 免疫調(diào)節(jié)化合物，其通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細胞的功能或調(diào) 控細胞因子的表達而引起至少一種抗炎性細胞因子受到阻遏及至少一種 促炎性細胞因子上調(diào)而抑制對免疫應答的阻遏。免疫調(diào)節(jié)劑通過自身免疫系統(tǒng)細胞抑制IL-10和/或TGF-卩和/或上調(diào) IL-12而適當調(diào)控細^<因子反應。對自身免疫系統(tǒng)細胞細胞因子反應的調(diào)節(jié)，尤其是對細胞因子表達譜 的調(diào)節(jié)可抑制調(diào)節(jié)性T細胞的誘導。
合適的TLR激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物已在上文中描述。與熱激蛋白復合的抗原為一種合適的腫瘤特異性抗原，且來源于腫瘤 細胞。當免疫調(diào)節(jié)劑為Cox-2抑制劑時，HSP-70-抗原復合物與Cox-2抑制 劑一起給藥可引起樹突狀細胞上CD80表達的增強。在一實施方案中以樹突狀細胞HSP-70疫苗的形式提供了 HSP-60/抗原 復合物。本發(fā)明在此方面進一步延伸為對來源于癌癥細胞或感染了癌性疾病 的寄主的不同熱激蛋白的應用。相應地，熱激蛋白可為HSP-60、 HSP-90 和gp96,但不限于上述的種類，且可能延伸至任何本領域技術(shù)人員所知的 熱激蛋白。本發(fā)明還有另 一方面提供了與腫瘤特異性抗原復合的熱激蛋白與至 少 一種Toll樣受體激動劑和免疫調(diào)節(jié)劑 一起用于治療癌癥或惡性疾病的應 用，這種免疫調(diào)節(jié)劑可通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細胞的功能或調(diào)控細胞因 子的表達而引起至少一種抗炎性細胞因子受到阻遏及至少一種促炎性細 胞因子上調(diào)而抑制對免疫應答的阻遏。本發(fā)明另 一方面延伸為與腫瘤特異性抗原復合的熱激蛋白與至少一 種Toll樣受體激動劑和免疫調(diào)節(jié)劑一起在制備用于治療癌癥或惡性疾病的 藥物中的應用，這種免疫調(diào)節(jié)劑可通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細胞的功能或 調(diào)控細胞因子的表達而引起至少一種抗炎性細胞因子受到阻遏及至少一 種促炎性細胞因子上調(diào)而抑制對免疫應答的阻遏。樹突狀細胞疫苗樹突狀細胞(DC)是高效的抗原呈遞細胞(APC),具有活化對外來 和自身抗原特異的初始T淋巴細胞的獨特能力。樹突狀細胞在骨髓中產(chǎn)生，經(jīng)血流遷移到機體的所有組織。這些細胞 通常發(fā)現(xiàn)于一些結(jié)構(gòu)區(qū)室如胸腺、淋巴結(jié)和脾之類的淋巴器官。然而它們 也^L發(fā)現(xiàn)于血流和機體的其它組織。情況適合時樹突狀細胞俘獲抗原并遷 移到引流淋巴結(jié)，此處啟動免疫應答。
樹突狀細胞通過主要組織相容性復合物(MHC)-肽復合體加工和呈遞 肽至抗原特異性初始T、淋巴細胞。本發(fā)明進一步將本發(fā)明的化合物和方法的使用延伸為誘導成熟樹突 狀細胞的一種特殊亞群的產(chǎn)生，其具有能夠促進由一些細胞類型如Thl和 CTL介導的效應性T細胞反應，并進一步阻遏調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生的表型 和細胞因子表達語。髓系和淋巴樹突狀細胞群在本發(fā)明中都有用途。期望能夠?qū)渫粻罴毎M行調(diào)控，以將其表型修飾為能夠表達可誘導 Thl細胞譜和CTL反應的細胞因子譜。此樹突狀細胞亞群的誘導用于避免 產(chǎn)生半成熟樹突狀細胞，半成熟樹突狀細胞的特征為可產(chǎn)生IL-10和 TGF-P，此種細胞因子語可引起調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生或CD80或CD86的 高表達而CD40低表達。本發(fā)明進一步延伸為樹突狀細胞疫苗。上文定義的組合物可向需要癌 性疾病或傳染病相關治療的個體施藥以向其提供預防性或治療性治療。此 介導抗傳染病免疫應答的疫苗組合物一般是進行預防性施藥以預防個體 的感染。但是當用于傳染病如丙型肝炎和艾滋病病毒，疫苗為進行治療性 施藥時，會有例外情況。然而， 一般由于受治療者的免疫妥協(xié)狀態(tài)， 一般 不將傳染病疫苗以治療方式施藥。當將疫苗向具有癌性疾病的個體施藥時一般是進行治療性施藥，因為 疫苗將包含腫瘤細胞或來源于胂瘤細胞的抗原。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)了樹突狀細胞疫苗與癌性疾病治療有關的用途。另外， 發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)用包括樹突狀細胞、Toll樣受體激動劑和免疫調(diào)節(jié)劑的疫 苗組合物給藥可提高藥物的效價。因此，本發(fā)明的另一發(fā)明延伸為一種用于治療癌性疾病的疫苗組合 物，其包括-樹突狀細胞，-至少一種腫瘤細胞抗原，-至少一種Toll樣受體激動劑，和-免疫調(diào)節(jié)化合物，其通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細胞的功能或調(diào)控細 胞因子的表達而引起至少一種抗炎性細胞因子受到阻遏及至少一種促炎 性細胞因子上調(diào)而抑制對免疫應答的阻遏。合適的TLR激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物已在上文.中描述。合適的樹突狀細胞可通過過繼轉(zhuǎn)移樹突狀細胞提供，其在存在或不存 在Toll樣受體激動劑和可對于抗腫瘤或惡性疾病或傳染病有效的抑制 IL-10及可誘導Thl細胞反應的免疫調(diào)節(jié)化合物時以腫瘤特異性抗原沖激 (pulse)。合適的樹突狀細胞具有半成熟表型。在一實施方案中，至少一種腫瘤抗原可通過用與抗原復合的熱激蛋白 給藥提供。與抗原性蛋白復合的熱激蛋白可來源于癌癥細胞或具有癌性疾 病的個體。本發(fā)明的另一方面提供了一種治療癌癥或惡性疾病的方法，此方法包 括以下步驟-用在腫瘤特異性抗原存在下沖激的樹突狀細胞給藥， -用至少一種Toll樣受體激動劑給藥，和-用至少一種治療有效量的可抑制對免疫應答的阻遏的免疫調(diào)節(jié)化 合物向需要的接受者給藥，該阻遏作用由對調(diào)節(jié)性T細胞的功能的選擇性 抑制引起，或其引起細胞因子表達的調(diào)節(jié)而導致至少一種抗炎性細胞因子 受到阻遏及至少 一種促炎性細胞因子上調(diào)。合適的TLR激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物已在上文中描述。本發(fā)明的另一方面提供了樹突狀細胞、至少一種腫瘤特異性抗原、至 少一種Toll樣受體激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物用于治療癌性疾病的應用，該 化合物通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細胞的功能或引起細胞因子表達的調(diào)節(jié)， 導致至少一種抗炎性細胞因子受到阻遏和至少一種促炎性細胞因子上調(diào) 而抑制對免疫應答的阻遏作用。本發(fā)明的另一方面提供了樹突狀細胞、至少一種腫瘤特異性抗原、至 少一種Toll樣受體激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物在制備用于治療癌性疾病的疫 苗組合物中的應用，該化合物通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細胞的功能或引起 細胞因子表達的調(diào)節(jié)，導致至少一種抗炎性細胞因子受到阻遏和至少一種 促炎性細胞因子上調(diào)而抑制對免疫應答的阻遏作用。發(fā)明者進一步發(fā)現(xiàn)了一種可向個體施藥的樹突狀細胞疫苗，用于癌癥 或惡性疾病的治療，此組合物未提供腫瘤特異性抗原，而提供了被施用疫 苗組合物的個體來源的腫瘤特異性抗原。因此，本發(fā)明的另一方面為提供了一種用于癌性疾病的治療的疫苗組 合物，其包括-樹突狀細胞，-至少一種Toll樣受體激動劑，和-免疫調(diào)節(jié)化合物，其通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細胞的功能或調(diào)控細 胞因子的表達而引起至少一種抗炎性細胞因子受到阻遏及至少一種促炎 性細胞因子上調(diào)而抑制對免疫應答的阻遏。合適的TLR激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物已在上文中描述。本發(fā)明的另一方面提供了一種治療癌癥或惡性疾病的方法，此方法包 括以下步驟-用在腫瘤特異性抗原存在下沖激的樹突狀細胞給藥，和-用至少一種治療有效量的可抑制對免疫應答的阻遏的免疫調(diào)節(jié)化 合物向需要的接受者給藥，該阻遏作用由對調(diào)節(jié)性T細胞的功能的選擇性 抑制引起，或其引起細胞因子表達的調(diào)節(jié)而導致至少一種抗炎性細胞因子 受到阻遏及至少一種促炎性細胞因子上調(diào)。合適的免疫調(diào)節(jié)化合物已在上文中描述。本發(fā)明的另一方面提供了樹突狀細胞、至少一種Toll樣受體激動劑和 免疫調(diào)節(jié)化合物用于治療癌性疾病的應用，該化合物通過選擇性抑制調(diào)節(jié) 性T細胞的功能或引起細胞因子表達的調(diào)節(jié)，導致至少一種抗炎性細胞因 子受到阻遏和至少一種促炎性細胞因子上調(diào)而抑制對免疫應答的阻遏作 用。
本發(fā)明的另一方面提供了樹突狀細胞、至少一種Toll樣受體激動劑和 免疫調(diào)節(jié)化合物在制備用于治療癌性疾病的疫苗組合物中的應用，該化合 物通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細胞的功能或引起細胞因子表達的調(diào)節(jié)，導致 至少一種抗炎性細胞因子受到阻遏和至少一種促炎性細胞因子上調(diào)而抑 制對免疫應答的阻遏作用。因此本發(fā)明的另一方面提供了一種適合治療癌癥或傳染病的在接受 者體內(nèi)誘導Thl反應的方法，此方法包括以下步驟-為使樹突狀細胞達到可促進效應細胞功能的成熟程度，在疫苗和/ 或TLR激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物存在下將分離的樹突狀細胞間接體內(nèi)暴 露于疾病特異性抗原，此化合物可抑制由自身免疫系統(tǒng)細胞產(chǎn)生IL-10和/ 或TGF-P或上調(diào)IL-12產(chǎn)生，-向接受者施用樹突狀細胞，使接受者產(chǎn)生足夠強的免疫應答，來防 止癌癥攻擊或選艮或預防病原性#:生物的感染以預防傳染病。在一個實施方案中，本發(fā)明的此方面的樹突狀細胞為接受者自體的。 在一個實施方案中此樹突狀細胞為成熟樹突狀細胞。疾病特異性抗原為合適的腫瘤特異性抗原。合適的TLR激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物已在上文中描述。本發(fā)明的另一方面涉及到對利用間接體內(nèi)方法暴露于疫苗和/或TLR 激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物的樹突狀細胞在制備治療癌性疾病或傳染病的 藥物中的應用，該化合物抑制對免疫應答的阻遏作用，這種阻遏作用通過 選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細胞的功能或引起細胞因子表達的調(diào)節(jié)，導致至少一 種抗炎性細胞因子受到阻遏和至少一種促炎性細胞因子上調(diào)引起。在可選實施方案中本發(fā)明此方面的樹突狀細胞可被任何其它合適的 抗原呈遞細胞代替。合適的抗原呈遞細胞為巨喧細胞、單核細胞和B細胞。 在另外的實施方案中，通過間接體內(nèi)方法對樹突狀細胞進行了調(diào)變。在優(yōu)選實施例中，再給藥的抗原呈遞細胞、優(yōu)選的樹突狀細胞為接受 者自身固有的。接受者一般為人。
本發(fā)明的另一方面提供了一種組合物用于預防或治療癌癥、惡性疾病或傳染病，所述組合物包括(i) 在可引發(fā)傳染病、癌癥或惡性疾病的特異性免疫應答的疫苗或疫 苗成分存在下沖激的樹突狀細胞，(ii) 佐劑，如Toll樣受體激動劑；和(iii) 可抑制對免疫應答的阻遏作用的化合物，這種阻遏作用通過選 擇性抑制調(diào)節(jié)性T細胞的功能或引起細胞因子表達的調(diào)節(jié)，導致至少一種 抗炎性細胞因子受到阻遏和至少一種促炎性細胞因子上調(diào)引起；以及藥學 上可接受的賦形劑、稀釋液或載體。對IL-10和/或TGF-(3產(chǎn)生的抑制和/或IL-12的上調(diào)是在自身免疫系統(tǒng) 中進行適當調(diào)節(jié)的，例如樹突狀細胞。在一個實施方案中，用全細胞癌癥疫苗如熱激的受輻射的B16腫瘤細 胞與和可作為MAP激酶抑制劑的化合物ERK —起的TLR激動劑CpG共 同處理樹突狀細胞。在另外的實施方案中，ERK抑制劑可能^皮替換為p38 抑制劑、pI3K抑制劑或Cox-2抑制劑。在另外的實施方案中，DC可能受由癌癥細胞或感染了傳染病的細胞 來源的HSP-70沖激，所述DC進一步暴露于可抑制抗炎性細胞因子產(chǎn)生 的化合物， 一個特殊例子為可抑制IL-10和/或抑制天然Treg表達的Cox-2 抑制劑的施藥。
具體實施方式
初始CD4+T細胞可分化為效應Thl或Th2細胞或Treg細胞，這些不 同亞型的選擇性誘導可能由許多因素決定，包括樹突狀細胞(DC)的成熟 程度和自身免疫系統(tǒng)細胞分泌的調(diào)節(jié)性細胞因子。 一些病原來源的免疫調(diào) 節(jié)性分子如TLR配體促進Thl細胞的誘導。別的病原來源的分子，如來 自百日咳桿菌和CT的FHA和Cya，選擇性地或與Th2細胞一起促進Tr 細胞的誘導。Treg細胞與效應T細胞的同時誘導可能是一種寄主保護性策 略，以控制過度的Thl和Th2反應，由此限制病原誘導的炎癥和免疫病理。Thl細胞被TLR配體誘導與它們的功能關聯(lián)，即促進從自身細胞，尤其是 巨噬細胞和DC中產(chǎn)生IL-12和IL-27。然而，也顯示TLR配體可誘導IL-10 從巨噬細胞產(chǎn)生，且顯示促進Th2的TLR-2激動劑Pam3Cys可誘導IL-10 從DC中產(chǎn)生。
本發(fā)明的發(fā)明者最近證明表達IL-IO和TGF-P的CD4+和CD8+ Treg細 胞可能干擾抗腫瘤免疫和促進腫瘤生長。他們證明，T細胞對旁觀者抗原 的反應在CT26腫瘤生長區(qū)域的抗原皮下免疫的小鼠中受到阻遏。生長的 腫瘤中的T細胞表達IL-IO、 TGF-p和Foxp3的mRNA, CD4+和CD8+ T 細胞高頻率浸潤腫瘤，引流'淋巴結(jié)中T細胞分泌IL-10,而分泌IFN-y的 頻率低。分泌IL-10的巨噬細胞和樹突狀細胞也浸潤生長中的腫瘤。CD8+ CTL反應在患有肺轉(zhuǎn)移瘤的小鼠中檢測不到，在皮下注射CT26結(jié)腸癌細 胞后可微量瞬時檢測到，但在抗IL-10和抗TGF-p存在下得到增強。體內(nèi) 使CD4+或CD25+ T細胞損耗后顯著增加了 CD8+ T細胞IFN-y的產(chǎn)生，減 小了皮下腫瘤的體積、減少了肺轉(zhuǎn)移瘤以及提高了存活率。相反，CD8+T 細胞的去除取消了 CTL反應，促進了皮下腫瘤的發(fā)展但減少肺轉(zhuǎn)移癌。這 些發(fā)現(xiàn)表明腫瘤生長使分泌IL-10和TGF-P的CD4+ Treg細胞能夠被誘導 和募集，并阻遏效應CD8+T細胞反應。然而表達IL-IO和TGF-P的008+ Treg細胞也被肺的免疫抑制環(huán)境募集或激活，它們在此處可能阻遏抗腫瘤 免疫的誘導。
本發(fā)明的發(fā)明人此前證明了 TLR激動劑給藥的同時誘導了分泌IL-10 的Treg和Thl細胞。TLR配體誘導分泌IFN-y、 IFN-y和IL-10或僅IL-10 的T細胞。另外，這些不同類群的分泌IL-10的Trl和分泌IL-lO和IFN-y 的Thl樣Treg細胞阻遏Thl細胞產(chǎn)生IFN- y ,表明TLR配體同時誘導不 同類群的調(diào)節(jié)性和效應T細胞。此前報道了自身IL-12和IL-10分別主導 Thl和Tregl細胞的談導。發(fā)明人證明TLR-2、 TLR-4、 TLR-5、 TLR-7、 TLR-8和TLR-9可激活DC的IL-10和IL-12的產(chǎn)生。另外，TLR配體誘 導ERK和p38 MAP激酶的磷酸化，ERK和P38的抑制劑能阻遏TLR配 體誘導的IL-10并促進樹突狀細胞產(chǎn)生IL-12。
本發(fā)明的發(fā)明人不希望受理論的束縛，確信p38抑制劑、pI3K抑制劑、ERK抑制劑和/或Cox-2抑制劑通過阻遏自身細胞(例如樹突狀細胞)產(chǎn) 生IL-10和促進IL-12產(chǎn)生，由此促進Thl和CTL而非Treg細胞的誘導， 從而增強TLR激動劑和/或HSP-70疫苗的效價。此作用限制了與Treg細 胞的誘導和激活相關的抗腫瘤免疫應答的擾亂。定義如此處所用，術(shù)語"T細胞，，包括CD4+ T細胞和CD8+ T細胞。術(shù)語 T細胞也包括1型輔助性T細胞和2型輔助性T細胞和細胞毒性T淋巴細 胞(CTL )。本發(fā)明上下文中的"接受者"包括哺乳動物如人類、靈長類動物和家 畜(例如綿羊、豬、牛、馬、驢)，實驗動物如小鼠、兔、大鼠和豚鼠， 以及伴倡動物如狗和貓。處理/治療此處所用的術(shù)語"治療"指任何對人和非人類動物有益的處理方式。 治療可針對存在的疾病或可為預防性的(預防性治療)。治療可包括治愈、 減輕或預防效果。更特殊的是，此處提及的"治療性，，和"預防性"治療應從其最廣泛 的意義考慮。術(shù)語"治療，，并不一定表示將接受者治療至完全康復。類似 地，"預防"不一定表示接受者最終將不患病。因此，治療性和預防性治療包括對某一特殊疾病癥狀的改善或預防或 減少某種特定疾病發(fā)展的風險。術(shù)語"預防"可看作減少某種特定疾病的 嚴重程度或發(fā)作。"治療"也可減少某一存在疾病的嚴重程度。施藥本發(fā)明所使用的活性成分可分開向同一接受者給藥或作為藥物組合 物共同給藥。藥物組合物一般包括根據(jù)預期的給藥途徑選擇的合適的賦形 劑、稀釋液或載體?；钚猿煞?任選地采取藥物組合物的形式)可通過任何合適的途徑向 需治療的受治療者施藥。準確的劑量依賴于一系列因素，以下將作更詳細 的討論。一種合適的給藥途徑為腸道外給藥(包括例如利用滴注器皮下給藥、 肌肉給藥、靜脈內(nèi)給藥)。其它合適的給藥途徑包括(但不限于)經(jīng)口腔 給藥、直腸給藥、鼻內(nèi)給藥、局部給藥(包括口腔和舌下)、輸注給藥、 陰道給藥、皮層內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、顱骨內(nèi)給藥、鞘內(nèi)給藥和硬腦膜外 給藥或利用霧化器、吸入器通過口或鼻吸入，或通過植入。為進行靜脈內(nèi)注射，活性成分將采取腸道外可接受的液體溶液形式，其無熱原，具有合適的pH、等滲性和穩(wěn)定性。本領域技術(shù)人員能夠利用例 如等滲賦形劑如氯化鈉注射液、林格注射液、乳酸林格氏液制備合適的溶 液。需要時可包括防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖液和抗氧化劑和/或其它添加物。用于口服給藥的藥物組合物可以為片劑、膠嚢、粉劑或液體形式。片 劑可能含固體載體如明膠或佐劑。液體藥物組合物一般含液體載體如水、 石油、動物或植物油、礦物油或合成油。可能包括生理鹽水、葡萄糖或其 它糖類溶液或二醇類如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。此組合物的給藥也可能通過孩i球、脂質(zhì)體、其它樣t粒輸送系統(tǒng)或置于 特定組織包括血液中的持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放載體的合適例子包括可共 享文獻中的形式的半透性高分子基質(zhì)，例如栓劑或微膠嚢?？芍踩氲幕蛭?膠嚢持續(xù)釋放基質(zhì)包括L-谷氨酸的聚乳酸(US專利號3773919或歐洲專 利申請?zhí)?058481 )共聚物和y乙酉旨-L-谷氨酸(Sidman et al， Biopolymers 22(1):547-556，1985)、聚曱基丙烯酸-2-羥基乙酯或乙烯醋酸乙烯酯(Langer et al, J. Biomed. Mater. Res， 15:167-277, 1981, and Langer, Chem. Tech. 12:98-105， 1982 )。以上提到的技術(shù)與操作方法的例子和其它根據(jù)本發(fā)明可能用到的技 術(shù)和才喿作方法可見于《Remington，s Pharmaceutical Sciences》第18版，作 者Gennaro, A.R. ,Lippincott Williams & Wilkins;第20版(December 15,2000 ) ISBN 0-912734-04國3和《Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Dellivery Systems》，作者Ansel，H.C.等,第7版，ISBN 0-683305-72-7,其全部內(nèi)容 因在此以引用的方式并入本文。
藥物組合物如上文所述，本發(fā)明延伸為一種藥物組合物用于癌癥或惡性疾病和/或傳染病的治療，尤其用于Thl免疫應答的誘導和Treg免疫應答的阻遏或 抑制。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物及其使用除包括活性成分外，還可包括藥 學上可接受的賦形劑、載體、緩沖液、穩(wěn)定劑或其它本領域技術(shù)人員熟知 的材料。這些材料應無毒，且不干擾活性成分的效價。載體或其它材料的 具體性質(zhì)取決于給藥途徑，例如可為口腔、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)或通過口腔或鼻 腔吸入。制劑可能為液體，例如生理鹽水，其含pH為6.8-7.6的無磷緩 沖液，或為凍千或冷凍干燥的粉。劑量此組合物優(yōu)選地以"治療有效量"或"期望的劑量"向個體施藥，即 足以顯示對個體有益。如此處所定義，術(shù)語"有效量"意為治療某特定疾病可至少部分獲得 期望的反應，或延遲發(fā)作或阻遏發(fā)展，或完全阻止發(fā)作或發(fā)展所必需的劑 量。劑量可根據(jù)接受治療者的健康和生理狀況、接受治療者所屬類群、所 期望的保護程度、組合物的配方、醫(yī)療形勢的評估和其它有關因素而改變。 期望將劑量定在一個相對較寬的范圍內(nèi)，其可通過常規(guī)試驗確定。治療處方如劑量的確定的責任和決定權(quán)最終屬于一般從業(yè)者、醫(yī)師或 其他醫(yī)學醫(yī)生， 一般需考慮所治療的失調(diào)狀態(tài)、受治療者的個體條件、給 藥方法和從業(yè)者所知的其它因素。優(yōu)化劑量可由醫(yī)師基于一系列參數(shù)確定，包括例如年齡、性別、體重、 所治療疾病的嚴重性、所用活性成分和給藥途徑?？蓱靡惠^寬范圍劑量。例如針對受治療者，可每天用大約O.l亳克 到約1毫克每千克體重藥物。可調(diào)整劑量方案以取得優(yōu)化的治療反應。例 如，可以在每天、星期、月份或其它合適的時間間隔用數(shù)個不同劑量，或 根據(jù)情況需要相應減少劑量。除另有規(guī)定之處外，本發(fā)明所用的所有科學和技術(shù)術(shù)語具有本領域技
術(shù)人員普遍理解的意義。除上下文另有需要外，術(shù)語"含(comprise)"或"包括(include)"或 其變化形式如"comprises"或"comprising" 、 "includes"或"including" 理解為包括申明的整體或群體，但不排除其它任何整體或群體。本發(fā)明將通過參考下文的例子和附圖加以描述，這些例子是作為例證 提供的，不可論釋為本發(fā)明的局限。


圖1示CT26腫瘤細胞抑制T細胞增殖和旁》見者抗原引起的IFN-y產(chǎn)生；圖2示CT26腫瘤細胞體外分泌TGF-|3，體內(nèi)分泌IL-10;圖3示IL-IO、 TGF-P和Foxp3 mRNA在浸潤T細胞的腫瘤中表達增強；圖4示腫瘤位點的CD4+和CD8+ T細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的 IL-10產(chǎn)生；圖5示腫瘤上清誘導Cox-2在樹突狀細胞和巨噬細胞中的表達； 圖6示CpG在DC和腹腔巨噬細胞中誘導Cox-2的表達； 圖7示促Thl的TLR配體也諸導分泌IL-10的T細胞； 圖8示TLR配體促進調(diào)節(jié)性T細胞的誘導； 圖9示TLR配體刺激DC產(chǎn)生IL-10和IL-12;圖10示TLR配體i秀導的DC中IL-10的產(chǎn)生通過ERK和p38 MAP 激酶的激活而介導；圖11示單獨的p38抑制劑單獨或聯(lián)合ERK抑制劑阻遏CpG誘導的 IL-10而增加IL-12產(chǎn)生；圖12示將p38抑制劑單獨或與ERK抑制劑一同加入外源抗原和CpG 刺激的樹突狀細胞可使之誘導Thl的能力增強并阻遏分泌IL-10的T細胞
的誘導；
圖13示將p38、 ERK和Cox-2抑制劑加入外源抗原和CpG刺激的樹 突狀細胞可使之誘導Thl的能力增強并阻遏分泌IL-10的T細胞的誘導；圖14示體內(nèi)Cox-2的抑制可阻遏CpG誘導的IL-10和TGF-p;
圖15示在引流淋巴結(jié)中抑制Cox-2增加了 CpG誘導的IL-27 mRNA 而減少了 IL-10 mRNA;
圖16示Cox-2的抑制阻遏了 DC中CpG誘導的IL-10而增強了 IL-12p40的產(chǎn)生；
圖17示Cox-2的抑制增加了 DC中CpGi秀導的IL-27 mRNA而減少 了了 IL-10 mRNA的表達；
圖18示Cox-2的抑制增加了 DC中CpG誘導的IL-12p35和IL-12p40 mRNA而減少了 IL-10 mRNA的表達；圖19示Cox-2抑制劑和CpG聯(lián)合用藥減弱了腫瘤生長；
圖20示Cox-2抑制劑增強了 CpG對腫瘤生長的治療效果；
圖21示Cox-2抑制劑和CpG聯(lián)合用藥增加了肺瘤攻擊的小鼠的成活率；圖22示Cox-2或ERK抑制劑增強了樹突狀細胞腫瘤疫苗的治療效果；
圖23示Cox-2抑制劑增強了樹突狀細胞HSP-70疫苗的治療效果；
圖24示Cox-2抑制劑和HSP70疫苗聯(lián)合用藥增強了 DC中CD80的 表達；
圖25示ERK的抑制在樹突狀細胞中阻遏TLR激動劑誘導的PGE2;
圖26示Cox-2抑制劑阻遏樹突狀細胞中TLR激動劑誘導的PGEa和 IL-10產(chǎn)生；圖27示p38的抑制減少CpG誘導的PGE2產(chǎn)生；
圖28示p38的抑制阻遏腫瘤疫苗和TLR激動劑刺激的樹突狀細胞中 IL-10產(chǎn)生并增強了 IL-12產(chǎn)生；
圖29示p38的抑制增強了樹突狀細胞疫苗的治療效果；圖30示p38的抑制增強了腫瘤疫苗和CpG沖激的樹突狀細胞的治療 效杲；圖31示在存在p38抑制劑下，腫瘤細胞疫苗沖激的樹突狀細胞的治 療學給藥增加了小鼠的存活率；圖32示用全腫瘤疫苗和CpG沖激的樹突狀細胞治療增加了腫瘤中T 細月包IFN-y產(chǎn)生；圖33示用B16疫苗、CpG和p38抑制劑處理的樹突狀細胞治療增加 了腫瘤塊中CD4+T細胞的頻率但減少了調(diào)節(jié)性T細胞的頻率；圖34示瘤周(pertumoural)注射CpG和p38抑制劑增加成活率；圖35示pI3K抑制劑增強了腫瘤疫苗和CpG沖激的樹突狀細胞的治療 效果；圖36示移植肺瘤疫苗、CpG和pI3激酶抑制劑沖激的樹突狀細胞增加 了患有生長腫瘤的小鼠的成活率；圖37示以CpG為佐劑的p38抑制劑增強了無細胞百日咳疫苗的保護 效果；圖38示p38抑制劑對以CpG為佐劑的無細胞百日咳疫苗的反應增加 了 IFN-y而減少IL-10;圖39示p38抑制劑對以CpG為佐劑的無細胞百日咳疫苗的反應減少 了 IL-10;圖40示在以CpG為佐劑的非細胞性百日咳疫苗中加p38抑制劑增加 小鼠受百日咳桿菌攻擊后的局部IL-l卩；圖41以腫瘤疫苗、TLR激動劑和p38抑制劑對小鼠治療性免疫化后 減少了 B16腫瘤生長，和圖42示在IL-10缺陷型小鼠中腫瘤生長未顯著惡化。
小鼠BALB/c和C57BL/6小鼠購于Harlan UK公司(Bicester, Oxon， U.K.)。 DO.11.10OVAT細胞受體(TCR)轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠于室內(nèi)飼養(yǎng)。所有小 鼠按照愛爾蘭衛(wèi)生部的規(guī)定和指導保持特定的無病原狀態(tài)。腫瘤系CT26結(jié)腸癌來源的細胞系保持于加10%熱滅活的FCS的RPMI 1640 中，皮下注射(s.c.)攻擊時在BALB/c小鼠中形成實體瘤。B16F10腫瘤 細胞系保持于加10%熱滅活的FCS的DMEM中，皮下攻擊時在C57BL/6 小鼠中形成實體瘤。除另有申明外，兩個實驗it型中均向小鼠注射了 2xl05 個肺瘤細月包。腹腔巨噬細胞用5毫升溫暖培養(yǎng)基洗滌腹腔。將細胞置培^中，2小時后移除非 黏附細胞。黏附細胞以106每毫升濃度放置。熱激-輻射的B16腫瘤細月包B16腫瘤細胞于43。C孵育一^J、時。然后于20KGy輻射細胞，后于37 。C孵育4小時。將細胞以1: 1比例加入BMDC。腫瘤對增殖和細胞因子反應對不相關抗原的影響D011.10小鼠于腋下皮下單獨注射200嗎OVA或與2xl()S個CT26細 胞一同注射。7天后以200嗎OVA注射小鼠，14天后制備淋巴結(jié)細胞懸 浮系并于96孔圓底板、37°C、 5%C02、 2xl()6/ml濃度與OVA(50、 100和 500pg/ml)共同培養(yǎng)。3天后移除上清，用雙位點ELISA檢測IFN-y濃度。 4天培養(yǎng)后，每孔加入2pC"H標記的胸苷(Amersham)。 96孔板再孵育 6小時，之后收集細胞(Tomtec Harvester 96 March III M)至Filtermat噴 霧千燥器，用P計數(shù)儀(1450MicroTrilux，Wallac)確定每分鐘閃爍計數(shù)(cpm) 值。疫苗
小鼠皮下注射鑰孔血藍蛋白(KLH; 5嗎)、KLH和CpG-ODN (25 jxg)、 脂多糖(20嗎)、PolylC(25嗎)、滅活的百日咳桿菌(lxlO"或霍亂毒素(CT) (10ng)使之免疫化。間接體內(nèi)細胞因子反應C57BL/6小鼠腋下注射100 pl的CpG(lO嗎)或Cox-2抑制劑 Celecoxib(100嗎)。2小時和6小時后移出引流腹股溝淋巴結(jié)，過篩并重懸 于1 ml PBS。 ELISA法測上清中IL-10和TGF-(3的S/N，從細胞中提取 mRNA，用RT-PCR測IL-10和IL-27p28?？乖禺愋约毎蜃拥漠a(chǎn)生將免疫7天后移出的淋巴結(jié)或脾臟細胞(2xl06/ml )培養(yǎng)于含KLH (50 Hg/ml)、超聲粉碎的百日咳桿菌(5|ig/ml)或僅培養(yǎng)基中。72小時后移出 上清，ELISA方法4企測IL-4、 IL-10和IFN-Y的濃度?？乖禺愋訲細胞系KLH特異性CD4+T細胞系建立自免疫了 KLH和CpG-ODN的小鼠脾 臟或、淋巴結(jié)，脾臟或、淋巴結(jié)通過抗原(10 pg/mlKLH)和抗原呈遞細胞的 刺激而免疫化。特定情形下于培養(yǎng)起始時加抗IFN-y或IL-12和抗IL-IO。 抗原再刺激2-3輪后建立的T細胞系培養(yǎng)于KLH (10 ng/ml)和APC; 3 天后用ELISA測上清中IFN-y、 IL-4和IL-10的濃度。淋巴結(jié)細胞與抗原 (KLH或在一些實驗中為百日咳桿菌抗原)共同培養(yǎng)，6天后用于細胞內(nèi) 染色。阻遏物檢測免疫了 KLH和CpG-ODN的小鼠脾臟細胞培養(yǎng)于加IL-12的KLH，以 產(chǎn)生KLH特異性Thl型T細胞系。通過抗IFN-y存在下進行初代培養(yǎng)， 從自免疫了 KLH和CpG的小鼠中建立分泌IL-10且分泌少量或不分泌 IFN- Y或IL-4的Trl型細胞系。通過培養(yǎng)來自免疫了 KLH、帶抗原的CpG 和APC且未加細胞因子或抗體的小鼠脾臟細胞，建立表達IFN-y和IL-10 的Thl Tr型T細胞系。Thl細胞系(lxloVml)僅與APC (受輻射的脾臟 細胞；2xl09ml)和KLH共培養(yǎng)或在Trl或ThlTr細胞存在下以1: 3、 1:l或3: 1的比例培養(yǎng)。3天后移除上清，ELISA檢測IFN-y濃度。結(jié)果表 示為與對單獨Thl細胞的反應的相對值。DC激活骨髓來源的未成熟DC (BMDC)通過用GM-CSF(40 ng/ml)培養(yǎng)提取 的骨髓細胞10天產(chǎn)生。來自BALB/c或C57BL/6小鼠的BMDC用1 ng/ml -10iig/ml的TLR激動劑、Pam3CSK4、酵母多糖、脂多糖、鞭毛蛋白、 PolyIC、 CpG-ODN或僅培養(yǎng)基孵育。在抑制試驗中，活化的細胞用或未用 MEK1/2(ERK)抑制劑U0126(1.25-5 ^M)、 Cox-2抑制劑NS-398 (0.1-10 ^M) 或p38抑制劑SB203580(0.1-10nM)預處理(1小時)。也用各種濃度的B16 上清(S/N)處理BMDC 24小時。通過培養(yǎng)5xl05 B16細胞/ml —周并移 除消耗的培養(yǎng)基制備B16S/N。 6或24小時后移出上清，用ELISA檢測細 胞因子濃度，或勻漿化細胞，RT-PCR分析所得mRNA。DC轉(zhuǎn)化實驗活化的C57BL/6小鼠BMDC用CpG(5嗎)和KLH(5嗎)孵育，用 Cox-2(NS-398:5 pM)、 p38 ( SB203580: 1 一)和ERK(U0126: 5 pM)的抑 制劑組合預處理。將2.5xl()S個處理的細胞注射到每足墊中。5天后移出胭 窩淋巴結(jié)和脾臟，單細胞懸液用KLH(2、 10、 50 pg/ml)再刺激。3天后移 出S/N， ELISA測等份試樣的IFN-y和IL-10。為進行腫瘤實驗，用2.5xl(^個B16腫瘤細胞皮下注射攻擊C57BL/6 小鼠，從第三天開始，以一周為間隔向腫瘤位點皮下注射3次處理的 BMDC(l-5x105)。用加CpG(5 pg/ml)或Cox-2抑制劑Celecoxib(5 nM)和 ERK抑制劑U0126(5 nM)之一的熱激的-輻射的B16腫瘤細胞加載到 BMDC中24小時。小鼠進行常規(guī)管理以生長肺瘤。受調(diào)節(jié)的DC對T細胞的體外激活來自BALB/c的DC用OVA CLASS II肽(5昭)孵育。細胞兼用CpG(10 嗎)或p38抑制劑SB203580(1或5 ^M)之一和ERK抑制劑U0126(5 pM)刺 激24小時。然后將D011.10VA-TCRT細胞加入BMDC中(10: 1)。 3天 和11天后移出上清，ELISA才企測等份試樣的IL-10和IFN-y。
腫瘤直接治療用2xl()S個腫瘤細胞皮下注射攻擊C57BL/6小鼠，在第3、 5、 7天時 用CpG(lO或20 pg)、 Cox-2抑制劑Celecoxib(100或500嗎)或兩者的組合 皮下注射腫瘤位點。小鼠進行常少見管理以生長腫瘤和^f吏之存活。用卡尺測 量腫瘤的二維尺寸并用以下公式計算大小(寬、長)x兀/6,此處寬指較小 測量值。當腫瘤的測量長度大于15mm時將小鼠殺死。Western印跡分析DC于lxl06/ml濃度與TLR配體一起培養(yǎng)15分鐘至8小時。在特定 實驗中，于TLR配體前1小時加入ERK或p38抑制劑。細胞裂解物用 SDS-PAGE重新溶解，轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜并用磷酸化p38 (pp38; Cell Signal Technology,MA， USA)或石粦酸化ERK (pERK; Santa Cruz Biotechnologies, USA)的特異性抗體和連接辣根過氧化物酶的二抗印跡。剝離硝酸纖維素并 用總p38或總ERK特異性的抗體為探針雜交。利用磁性細胞分選純化T細胞從淋巴結(jié)、肺或手術(shù)移出的腫瘤制備細胞懸浮系。用培養(yǎng)基洗滌組織 樣品，用解剖刀片充分切碎，在加0.1 。/。膠原酶D (Sigma)的Hanks平衡 液中于37。C孵育30分鐘。細胞懸浮物通過70 urn細胞濾網(wǎng)裂解紅細胞。 將細胞洗滌、計數(shù)后重懸于加10 pl抗CD4或抗CD8磁珠(Miltenyi Biotech) 的90 ^ MACS緩沖液中，于4 - 8'C孵育15分鐘。將MACS緩沖液(2 ml) 加入每個樣品中，然后于300xg離心10分鐘。然后將每個樣品重懸于500 pi的MACS緩沖液中，利用AutoMacs(Miltenyi Biotech)分選。流式細胞儀分析和細胞內(nèi)細胞因子染色自淋巴結(jié)、肺或腫瘤制備單細胞懸浮系。在加0.1 。/o膠原酶D( Sigma) 的Hanks平衡液中消化肺或腫瘤。用PMA(10 ng/ml)和離子霉素(1 pg/ml) 刺激細胞1小時，然后加入布雷菲德菌素A (10 pg/ml),于37°C4小時。 用CD4 (Caltag )、 CD8(BD Pharmingen)、 CDllc(BD Pharmingen)或F4/80 (Caltag )特異性抗體重懸細胞。然后用50^1固定培養(yǎng)基A( Fix&Perm細 胞滲透試劑盒，Caltag Laboratories)固定細胞。用50 pi固定培養(yǎng)基B (Fix&Perm細月包透4匕試劑盒，Caltag Laboratories )和5 (il抗IL-10或抗 IFN-y抗體(BD Pharmingen)孵育細胞，并在FACScalibur 上用 CELLQuestTM軟件(Becton-Dickson, San Jose， CA)進行免疫熒光分析。反轉(zhuǎn)錄酶-PCR利用TriReagent(SigmaAldrich)從脾、肺、淋巴結(jié)或腫瘤細胞或純化的 CD4+和CD8+ T細胞中提取RNA，用Superscript II RT(Invitrogen)和 01igodT(n-i8)引物(Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄。利用鼠TGF-(3(有義AGACGGAATACAGGGCTTTCGATTCA CTTGGGCTTGCGACCCACGTAGTA) 、 CTGGACAACATACTGCTAACCGAC , TTCATTCATGGCCTTGTAGACACC) 、 CAGCTGCCTACAGTGCCCCTA，反義反 義IL-IO( 有 義反 義Foxp3( 有 義Cox誦2( 有 反. IP畫IO(反義 義有 義 義CATTTGCCAGCAGTGGGTAG) 、 GTATCAGAACCGCATTGCCTCTGA CGGCTTCCAGTATTGAGGAGAACAGAT) CGCACCTCCACATAGCTTACAG CCTATCCTGCCCACGTGTTGAG) 、 IL-23pl9( 有 義TCTCGGAATATATGCATGC，反義CTGGAGGAGTTGGCTGAGTQ 、 IL-15( 有 義CATATGGAATCCAACTGGATAGATGTAAGATA， 反 義CATATGCTCGAGGGACGTGTTGATGAACAT)和肌動蛋白(有義 GGACTCCTATGTGGGTGACGGG，反義TGCCAATAGTGATGACTTGGC)特異性引物與2嗎樣品cDNA，以及Taq 聚合酶(Promega)和Peltier熱循環(huán)儀擴增。熱激蛋白(HSP)涉及較多產(chǎn)自蛋白降解過程的細胞肽。任何細胞(例 如腫瘤細胞)來源的HSP制備物都含該細胞的一個肽謙系。用HSP肽復 合物接種可產(chǎn)生抗此肽的T細胞反應。
HSP70-肺瘤肽復合體的純化將B16月中瘤細胞(lx106)注射到C57BL/6小鼠中，14天后將小鼠殺 死，移出腫瘤。在4倍體積低滲緩沖液(2 mM NaHC03， PMSF pH 7.1 )中 勻漿化腫瘤，于100，000g離心后回收上清。將樣品轉(zhuǎn)移到PD10柱中的緩 沖液D中(20 mM Tris-乙酸，20 mM NaCl， 15 mM P-巰基乙醇，3 mM MgCl2, 0.5 mM PMSF, pH 7.5 )。將樣品直接上樣于緩沖液D平衡的ADP-瓊脂糖柱 (5ml)。用含0.5MNaCl的緩沖液D洗柱，之后單獨用緩沖液D洗，直 到用蛋白分析檢測不到蛋白為止。最后用含3mMADP的緩沖液D于室溫 下孵育柱子30分鐘，之后用相同緩沖液(25 ml)洗脫。用Bradford蛋白 才企測方法對HSP70定量。制備物的純度用銀染膠估測，其特異性用Western 印跡和特異性抗體檢測。實施例1-CT26腫瘤生長抑制T細胞對無關抗體的響應 才才料和方法用OVA (200昭)單獨或與2x 105個CT26細胞皮下注射DO.11.10 小鼠。7天后注射200 p g OVA且14天后用OVA再刺激淋巴結(jié)細胞，4天 后檢查增殖情況(圖1A),并在3天后測定移出的上清液中的IFN-y的濃 度(圖1B)。結(jié)果為每組5只小鼠的平均值土SD且一式三份進行化驗。 OVA對比OVA + CT26 ,方差分析"PO.Ol, ***P<0.001。結(jié)果為了測驗這種可能性，即在腫瘤生長期間不能生成有效的獲得性免疫 應答可能是由于腫瘤生長產(chǎn)生了免疫抑制性環(huán)境，我們檢查了生長著的胂 瘤對T細胞應答無關抗原的影響。OVA-TCRTg小鼠在存在或不存在CT26 細胞時于皮下注射OVA，且在7天后，給小鼠注射OVA,并在14天后殺 死小鼠。移出引流淋巴結(jié)并檢驗OVA特異的T細胞增殖和IFN-y的產(chǎn)量。 與僅用OVA注射的小鼠比較，用CT26細胞和OVA攻擊的小鼠中OVA特 異性T細胞增殖顯著減少(圖1A)。與CT-26細胞的聯(lián)合給藥也顯著減少 了淋巴結(jié)中ova-特異性IFN-y的產(chǎn)量(圖ib ),證實生長著的ct26胂瘤
阻遏對其它抗原的免疫應答，特別是在注射的位點。實施例2-生長著的腫瘤誘導的免疫抑制性細胞因子的產(chǎn)生 才才泮+和方法從培養(yǎng)的CT-26細胞提取RNA,用對IL-IO、 TGF-卩、IL-23pl9、 IL-15 和IP-10特異的引物進行RT-PCR (圖2A )。培養(yǎng)的CT26細胞的上清液中 的TGF-P蛋白質(zhì)用ELISA定量(圖2B )。從體外培養(yǎng)的CT26細胞或者從 攜帶皮下CT26腫瘤的小鼠上切下的實體CT26腫瘤的勻漿中提取RNA(集 合5只小鼠的RNA),用對IL-10和(3-肌動蛋白特異性引物進行RT-PCR (圖2C )。結(jié)果代表3次試驗。用CT26細胞靜脈(圖3A)或者皮下(圖3B )注射BALB/c小鼠(每 組5只)。腫瘤攻擊后14天，從原態(tài)(N)和荷瘤小鼠(T)中取得淋巴結(jié) (LN)和皮下腫瘤塊(T)或肺。用》茲性細胞分選法分離CD4+和CD8+細 胞，用IL-10和TGF-p特異性引物進行RT-PCR。結(jié)果為了檢測在胂瘤生長過程中免疫抑制的可能介質(zhì)，我們測定了體外培 養(yǎng)的腫瘤和間接體內(nèi)生長著的腫瘤中的促進和抗炎性細胞因子的mRNA 的表達。對培養(yǎng)的CT26腫瘤細胞中細胞因子mRNA表達的檢測證實了抗 炎性細胞因子、TGF-(3的mRNA的表達(圖2A)。而且，在生長著的腫瘤 上清液中檢測到TGF-p蛋白質(zhì)(圖2B)。在CT26細胞中也有Cox-2、 IL-23pl9、 IL-15和IP-10 mRNA的表達(圖2A )，但我們沒能檢測到IL-ip、 IL-2、 IL-5、 IL-6、 IL畫IO、 IL-12p35、 IL-12p40、 IL-13、 IL畫18、 IL-27p28、 IL-27EB13、 TNF-a和IFN々的mRNA的表達(數(shù)據(jù)未顯示)。雖然在體外 培養(yǎng)的腫瘤中不能檢測到IL-10 mRNA (圖2A),甚至在用PMA刺激細胞 后也不能(數(shù)據(jù)未顯示)，但是在間接體內(nèi)的腫瘤細胞塊中探測到(圖2C )， 表明細I包體內(nèi)浸潤腫瘤的細月包分泌IL-IO。于是我們用RT-PCR法檢測了腫瘤細胞塊、肺中和引流淋巴結(jié)中的T 細胞IL-10和TGF-P mRNA的表達。從CT26肺轉(zhuǎn)移小鼠的肺和頸淋巴結(jié)及皮下注射CT26細胞小鼠的實體瘤和腹股溝淋巴結(jié)中純化CD4+和CD8+ T細胞。與原態(tài)小鼠的淋巴結(jié)相比，肺CD4+T細胞中IL-10mRNA的組成 性表達高。與原態(tài)小鼠的肺T細胞中發(fā)現(xiàn)的相比，荷瘤小鼠的肺的004+ 和CD8+T細胞兩者中IL-10的表達都大量的提高了 ，但是在肺轉(zhuǎn)移小鼠的 頸淋巴結(jié)中IL-10 mRNA表達變化小(圖3A)。此外，與原態(tài)小鼠相比， 從CT26肺轉(zhuǎn)移瘤攜帶的小鼠的肺純化出的CD4+和CD8+T細胞中TGF-(3 mRNA的表達都急劇增高，淋巴結(jié)變化小(圖3C)。從皮下注射CT26的 小鼠的實體瘤純化出的CD4+和CD8+中都檢測到高的IL-10的表達(圖 3B )。用CD26細胞皮下攻擊14天后的小鼠的腹股溝淋巴結(jié)的CD4+T細胞 中IL-10 mRNA表達和CD8+T細胞中TGF-|3 mRNA表達都有少量增加(圖 3B)。然而，在腹股溝淋巴結(jié)中TGF-P表達為高的組成性表達。這些結(jié)果 表明CT26腫瘤的生長增強了肺中已具免疫抑制性的環(huán)境和促進表達IL-IO 和TGF-P的CD4+和CD8+T細月包對腫瘤位點的浸潤。實施例3- CD26腫瘤塊內(nèi)CD4+T細胞中Foxp3的表達增強 才才料和方法BALB/c小鼠(每組5只)靜脈(i.v.)(圖3A)或皮下(s.c.)(圖3B ) 注射CT26細胞。腫瘤攻擊后14天從原態(tài)(N)和荷瘤小鼠(T)中取得 淋巴結(jié)(LN)和皮下腫瘤塊(T)或肺。用磁性細胞分選法分離CD4+和 CD8+T細胞，分離RNA且用Foxp3特異性引物進行RT-PCR。結(jié)果已證實生長期間T細胞表達IL-10和TGF-p在生長胂瘤中積累后，我 們檢測了天然Treg細胞募集到腫瘤位點的可能性。CD4+和CD8+T細胞從 皮下模型的腹股溝淋巴結(jié)及實體瘤和肺轉(zhuǎn)移模型的腹股溝淋巴結(jié)及肺中 純化出來，且用Foxp3特異性引物進行RT-PCR。與原態(tài)小鼠的相同組織 相比，在肺轉(zhuǎn)移模型中，從荷瘤小鼠的肺和引流淋巴結(jié)純化出的CD4+T細 胞中Foxp3的表達急劇增加(圖3A)。在浸潤的皮下腫塊的CD4+T細胞中 也檢測到Foxp3的表達(圖3B)。與肺模型不一樣，F(xiàn)oxp3的表達在具皮下肺瘤的小鼠的引流淋巴結(jié)中未增強。在來自原態(tài)或者荷瘤小鼠的任何組織的CD8+T細胞中未檢測到Foxp3的表達。實施例4-高頻率的分泌IL-10的CD4和CD8 T細胞和低頻率的分泌IFN-y 的T細胞"浸潤生長腫瘤材料與方法分別用2 x 105或3 x 105個CT26結(jié)腸癌細胞皮下或靜脈注射BALB/c 小鼠。按指示的天數(shù)切除實體皮下腫瘤或肺。用PMA和離子霉素刺激細 胞且用表面CD4、 CD8和細胞內(nèi)IL-10和IFN-Y特異性抗體標記，然后進 行了免疫熒光分析(圖4A)。結(jié)果已證實了在生長著的腫瘤中存在分泌IL-10和Foxp3+的T細胞后， 我們運用細胞內(nèi)細胞因子染色法檢測腫瘤生長期間效應T細胞和募集到肺 或胂瘤塊的調(diào)節(jié)性T細胞的相對頻率。用CT26細胞皮下或靜脈攻擊小鼠， 在3或14天后取下腫瘤，且進行細胞內(nèi)細胞因子染色以檢測標記了表面 CD4或CD8的T細胞上的IL-10和IFN-y。在荷CT26轉(zhuǎn)移的小鼠的肺和 皮下注射CT26細胞的小鼠的腫瘤塊中探測到分泌IL-10的CD4+和CD8+ T 細胞為高頻率(24-37%)(圖4A)。相比之下，僅有6-7%CD4+ T細胞和 9-27%的CD8+ T細胞分泌IFN-y (圖4A )。實施例5-分泌IL-10的巨噬細胞和DC浸潤生長肺瘤 材料和方法用3 x 105個CT26結(jié)腸癌細胞靜脈注射BALB/c小鼠，取下原態(tài)小鼠 (第0天)或者腫瘤攻擊后3和14天的小鼠的肺。用表面CDllc及F4/80 和細胞內(nèi)IL-10特異性抗體標記細胞并進行免疫熒光分析(圖4B)。結(jié)果已才艮道巨噬細胞和DC分泌的天然的IL-10,在來自外周原態(tài)T細胞 的可誘導Treg細胞的分化中起關鍵作用。已證實在CT-26轉(zhuǎn)移瘤發(fā)展過程 中，分泌IL-10 T細胞募集到肺，于是我們檢驗了這可能涉及募集和肺中 產(chǎn)生IL-10的巨噬細胞或DC的激活的可能性。用CT26細胞靜脈攻擊小鼠， 且在3或14天后取下肺和頸淋巴結(jié)，并對用表面CDllc或F4/80標記的 細胞進行細胞內(nèi)細胞因子染色。肺中CT26腫瘤的發(fā)育與巨噬細胞和DC 到肺上的募集相關，且這些天然細胞中有高比例的細胞分泌IL-IO(圖4B)。 在腫瘤攻擊3天和14天后，原態(tài)小鼠的肺中CDllc+細胞的百分率從11% 分別增加到17%和34%,而在腫瘤攻擊14天后，原態(tài)小鼠的肺中F4/80+ 細胞的百分率從原態(tài)小鼠的12%增加到27%。并且腫瘤攻擊后14天，79% 的浸潤巨噬細胞和38%的浸潤DC分泌IL-IO。相比之下，肺瘤攻擊后3 和14天，淋巴結(jié)中CDllc+和F4/80+細胞的百分率低于原態(tài)對照小鼠。而 且，這些細胞分泌IL-10的頻率很低且在腫瘤攻擊后不發(fā)生顯著改變。實施例6-B16腫瘤誘導樹突狀細胞和巨噬細胞中Cox-2的表達 材料和方法骨髓來源的樹突狀細胞或C57BL/6小鼠的腹膜巨噬細胞與多種B16 上清液的稀釋液溫育24小時。勻漿細胞，用Cox-2特異性引物RT-PCR分 析生成的mRNA，并與J3-肌動蛋白表勤目比。通過培養(yǎng)5 x 105個B16細 胞/ml—個星期，制備B16上清液，然后去掉消耗的培養(yǎng)基。結(jié)果Cox-2抑制劑多次成功地用于治療癌癥。已表明Cox-2和Cox-2誘導 的PGE2可促ii^達Foxp-3的調(diào)節(jié)性T細胞。我們已經(jīng)顯示CT26腫瘤表 達Cox-2mRNA。在此我們用B16腫瘤細胞系檢驗了腫瘤細胞也可能誘導 Cox-2在巨噬細胞和樹突狀細胞中的表達的可能性。用來自生長著的B16 細胞的上清液刺激骨髓來源的DC或腹膜巨噬細胞，誘導DC和巨嗟細胞 中Cox-2 mRNA表達(圖5 )。因此腫瘤細胞不^J^達Cox-2，也誘導Cox-2 在先天性免疫系統(tǒng)的細胞中的表達。
實施例7-CpG-ODN誘導樹突狀細胞和巨噬細胞中Cox-2的表達 材料和方法C57BL/6小鼠的骨髓來源的DC和IIJ^巨噬細胞與多種濃度的CpG溫 育24小時。勻漿細胞，用Cox-2特異性引物進行RT-PCR分析生成的 mRNA，并與(3-肌動蛋白表達對比。結(jié)果CpG-ODG作為胂瘤的治療物和傳染性疾病疫苗的佐劑而被測試。它 們的潛力基于它們能增強先天性免疫應答，特別是IL-12和通過在先天性 免疫細胞如樹突狀細胞和巨噬細胞中與TLR9相互作用，從而得到的獲得 性免疫力。然而TLR信號轉(zhuǎn)導不局限于炎性細胞因子的誘導，如IL-12的 產(chǎn)生，其它介質(zhì)也被激活。我們檢測了在先天性免疫細胞中CpG對Cox-2 誘導的影響。在樹突狀細胞和巨噬細胞中，CpG劑量依賴性誘導樹突狀細 胞和巨噬細胞中Cox-2 mRNA的表達(圖6 )。既然Cox-2可能有助于血管 生成和抗炎反應，這是腫瘤治療或者作為癌癥或傳染性疾病疫苗的佐劑時 需要避免的。實施例8-TLR配體謙導具調(diào)節(jié)活性的分泌IL-10 T細胞，也誘導分泌IFN-y 的Thl細胞^材料和方法用僅PBS、 KLH ( 5嗎)或KLH和CpG-ODN ( 25 pg)、 LPS(1嗎)、 PloylC(25 )Lig)、滅活的百日咳桿菌全細胞疫苗(Pw)或CT (10ng)免 疫BALB/c小鼠。7天后用KLH ( 50 pg/ml)和IFN-y刺激小鼠引流淋巴結(jié) 細胞，3天后ELISA法測定IL-4和IL-10濃度(圖7 )。CD4+ T細胞系通過KLH免疫小鼠建立，且CpG-ODN用KLH (10 pg/ml)和APC剌激(圖8A )。在存在抗-IFN-y時，林系6和7最初用抗 原刺激，其在模擬培養(yǎng)時加入(在多個重培養(yǎng)步驟中通過沖洗取得)以防 止分泌IFN-y T細胞的過度生長。檢測T細胞系中通過用抗原和APC刺激 產(chǎn)生的IFN國y和IL-10 (圖8a )。 PBS (對照)或KLH和CpG-ODN免疫的小鼠的淋巴結(jié)細胞用KLH (50ng/ml)刺激，6天后用PMA和離子霉素再刺激6小時(圖8B)。最 后4小時加入布雷菲德菌素A ( 10 pg/ml)。對CD4+細胞門控后進行免疫 焚光分4斤測定細月包內(nèi)IL-10和IFN-y (圖8B )。在存在IL-12和抗IL-10時，通過培養(yǎng)T細胞，從KLH和CpG-ODN 免疫的小鼠建立了分泌高濃度IFN-y和低或無IL-4和IL-10的Thl細胞系 (圖8C)。在存在抗-IFN-y時，通過初始培養(yǎng)建立一種Trl型細胞系，其 分泌IL-10且低水平或不分泌IFN-y或IL-4，且在不加細胞因子或抗體時， 通過與抗原和APC培養(yǎng)建立混合分泌IFNi和IL-10的T細胞系(稱為 ThlTr)。 Thl細胞系與APC和單獨的抗原或在存在比率為1: 3、 1: l或 3: 1的Trl或Thl細胞時培養(yǎng)。3天后移去上清液，ELISA法測定IFN-丫 的濃度(圖8C)。結(jié)果以相對于單獨Thl細胞的反應表示。結(jié)果已有大量的報道認為TLR配體，如CpG或LPS選擇性誘導Thl應答， 或者在有某些TLR-2激動劑的情況下，誘導Th2應答。我們測定了 TLR 配體在指導T細胞對模型旁觀抗原KLH的應答時的作用。單獨用KLH免 疫產(chǎn)生分泌IL-10和低濃度的IL-4但無IFN-y的T細胞。聯(lián)合應用TLR配 體、CpG-ODN、 LPS或PolyIC,產(chǎn)生分泌高濃度IFN個但分泌低或檢測 不到IL-4的T細胞，細胞因子表達鐠與Thl細胞誘導的一致(圖7 )。然而，除了 IFN-y,在存在TLR配體時，從來自KLH免疫小鼠的抗 原刺激的淋巴結(jié)細胞的上清液中，在也檢測到顯著的IL-10 (但不是IL-4) (圖6 )。滅活的百日咳桿菌和百日咳全細胞疫苗具有有效的佐劑活性。在 此我們發(fā)現(xiàn)滅活的百日咳桿菌促進了抗原特異性T細胞的謙導，其分泌 IL-10和IFN-y到聯(lián)合應用的抗原KLH上。相比之下，我們先前已經(jīng)顯示 了 ，用CT免疫誘導Trl和Th2細胞，增強KLH-特異性IL4和IL-10的產(chǎn) 生。KLH特異性CD4+ T細胞系從免疫小鼠產(chǎn)生，表明用KLH和CpG-ODN (圖8A)免疫產(chǎn)生僅分泌IFN-y或IFN-y和IL-10的T細胞。當T細胞系 產(chǎn)生自用抗原和CpG-ODN或者百日咳桿菌免疫的小鼠，在存在抗-IFN-y (其后來通過多個清洗步驟和再培養(yǎng)步驟取得)時，通過體外初始培養(yǎng)淋巴細胞產(chǎn)生，這些T細胞分泌IL-10,但不分泌IFN-7和IL-4 (圖8A)。 這些結(jié)果表明促進Thl佐劑也產(chǎn)生分泌IL-10的Trl型T細胞和分泌IL-10 和IFN-Y的T細胞，其叫4故Thl Tr細胞。對來自KLH和CpG-ODN免疫 的小鼠的CD4+ T細胞上進4亍細胞內(nèi)細胞因子染色，也顯示有明顯的單獨 分泌IFN-y或IL-10或分泌IFN-y和IL-10的細胞群(圖8B ),證實這種 TLR激動劑促進Thl及Trl細胞和分泌兩種細胞因子的獨特細胞群的誘 導。接著我們檢測了由KLH和CpG-ODN免疫誘導的抗原特異的IL-10或 分泌IL-10和IFN-y的T細胞對建立的KLH特異性CD4+ Thl細胞系的阻 遏功能。這種Thl細胞系從KLH和CpG-ODN免疫小鼠上建立且在當應 答抗原和APC刺激時，分泌高濃度的IFN-y。在存在中和抗-IFN-y抗體時， 通過初始培養(yǎng)，也從KLH和CpG-ODN免疫的小鼠的脾細胞，擴增分泌 IL-IO，但不分泌IFN-y或IL-4的Trl細胞。以3: 1、 1: 1和1: 3的比率， 這些Trl細胞顯著的阻遏Thl細胞中IFN-y產(chǎn)生，在Trl細胞數(shù)量最高時 觀察到的阻遏最高(圖8C)。 Thl 'Tr細胞，其分泌IFlSPy和IL-10,也阻 遏IFN-y的分泌，但僅在l: l和3: 1的比率。這些結(jié)果表明除了誘導效 應IFN-y分泌型細胞，CpG-ODG憑其抑制活性可同時促進T細胞的誘導。實施例9-TLR配體通過激活ERK和p38誘導DC IL-10產(chǎn)生 材泮+和方法將DC與1 n/ml-10 pg/ml Pam3CSK4( Pam3 )、酵母多糖(Zym )、 PolyIC、 LPS、鞭毛蛋白(Flag)、 CpG-ODN或僅培養(yǎng)基溫育。24小時后，移去上 清液，用ELISA法測定IL-IO、 IL-12p40和IL-12p70的濃度。NT表示未 才全測(圖9 )。將DC與MEK 1/2抑制劑(U0126)預溫育1小時，然后〗又與培養(yǎng)基 或與Pam3Cys、酵母多糖、LPS、鞭毛蛋白或CpG-ODN (1或5 pg/ml) 溫育15分鐘。裂解細胞并用pERKl和pERK2特異性抗體進行Western雜
交(圖IOA)。僅用培養(yǎng)基(0)或與LPS ( 100ng/ml) —起刺激DC0.5、 1、 2、 4、 8或12小時。用pERK或p38特異性抗體進行Western雜交(圖 IOB)。雜交洗脫后用總ERK或p38特異性抗體再檢測。在加入CpG-ODN(5 pg/ml )、 LPS (100 ng/ml)或4義培養(yǎng)基之前，DC僅與培養(yǎng)基(對照)、 U0126C 1.25-5 pM)(圖10C)或p38抑制劑、SB203580 ( SB; 0.1-10 一)(圖10D)預溫育1小時，24小時后，用ELISA法測定IL-10濃度。用 DMSO處理的細胞用作陰性對照。來自BALB/c小鼠的骨髓來源的DC單獨與CpG (10 pg)或與p38抑 制劑SB203580 (Io: 1 pM， hi: 5 )，或與ERK抑制劑U0126 (5 nM) 溫育24小時。移去上清液，等分液用ELISA測定IL-IO、 IL-12p70和IL-6 (圖11)。結(jié)果已證實TLR配體和滅活的百日咳桿菌，其包含TLR配體，誘導Tr細 胞和Thl細胞后，我們檢測了這表明DC同時誘導IL-10和IL-12的可能 性。我們發(fā)現(xiàn)每種檢測的TLR配體Pam3CSK4( TLR-2 )、酵母聚糖(TLR-2 )、 PolyIC( TLR-3 )、 LPS( TLR-4 )、鞭毛蛋白和CpG-ODN( TLR-9 )誘導IL-10 的產(chǎn)生，也誘導IL-12p40和IL-12p70從不成熟的骨髓來源的DC產(chǎn)生(圖 9)。 IL-10和IL-12的誘導分別與ERK和p38的信號傳導相關，于是我們 檢測了這些MAP激酶在TLR誘導的細胞因子產(chǎn)生中的作用。我們發(fā)現(xiàn)每 種測定的TLR配體誘導DC中ERK的磷酸化(圖10A )。 LPS-誘導的ERK 在第30分鐘最高，但在共8小時內(nèi)仍然顯著(圖IOB)。與MEKl/2抑制 劑U0126預溫育后，抑制IL-10從CpG-ODN-或LPS-刺激的DC的產(chǎn)生(圖 IOC)， U0126抑制TLR-配體誘導的ERK磷酸化(圖IOA)。 MEK 1/2抑 制劑增強IL-12p70的產(chǎn)生且這一效應在來自IL-10+小鼠的DC中保留，表 明它對于IL-10產(chǎn)生的減少不是次要的(數(shù)據(jù)未顯示)。TLR配體也誘導 DC中p38的磷酸化。DC與p38特異性抑制劑SB203580預溫育，在對于 LPS或CpG-ODN反應時，抑制IL-10且增強IL-12p70產(chǎn)生(圖10D和圖 11 )。我們也發(fā)現(xiàn)p38和ERK抑制劑的結(jié)合進一步抑制CpG誘導的IL-10 的產(chǎn)生且增強IL-12p35,但對IL-6沒有影響(圖11)。以前曾推測ERK 和p38可能差異性的調(diào)節(jié)IL-10和IL-12產(chǎn)生，ERK促進IL-10而p38促 進IL-12。然而我們的發(fā)現(xiàn)，與近來的運用可探測IRF-5的小鼠(Takaoka， A., H. Yanai， S. Kondo, G. Duncan, H. Negishi， T. Mizutani， S丄Kano, K. Honda, Y. Ohaba， T. W. Mak，和T. Taniguchi. 2005. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Atowe)和 NF-k抑制劑(Kabashima， K.， T. Honda, Y. Nunokawa,和Y Miyachi. 2004. A new NF-kappaB inhibitor attenuates a THl type immune response in a murine model. 578: 36-40)的報道結(jié)合，表明TLR配體通過MAP激酶、ERK和p38激活IL-10,而IL-12p70利用IRF-5和NF-k B途徑。實施例10-加入p38、 ERK和Cox-2抑制劑到用外源抗原和CpG刺激的樹 突狀細胞增強它們誘導Thl的能力且阻遏分泌IL-10的T細胞的誘導材料和方法來自BALB/c的骨髓來源的DC與OVAII型肽(5昭)溫育。同時， 細胞或單獨用CpG (lOpg)，或與p38抑制劑SB203580 (Io: 1 jjM， hi: 5pM)或P38抑制劑和ERK抑制劑UO-126 (5pM) —起溫育24小時。 來自D011.10 OVA-TCR Tg小鼠的純化的CD4+ T細胞用DC (10: 1)刺 激，且在抗原刺激3天后移去上清液且用ELISA法對IL-10和IFN-y定量 (圖12)。來自C57BL/6小鼠的骨髓來源的DC與僅培養(yǎng)基(-)、KLH (5嗎) 和CpG ( 5嗎)和標明的Cox-2抑制劑(NS-398: 5 )、 p38 ( SB203580: 1 和ERK (UO-126: 5 |nM)的混合物溫育。將2.5 x 10 5個處理的細 胞注射到57BL-6小鼠的每只爪墊。在5天后取下腦窩淋巴結(jié)和脾，且單 個細胞懸浮液用KLH再刺激(2、 10、 50ng/ml)。 3天后移去上清液，ELISA 法對IFN-y和IL-10的濃度定量(圖13 )。結(jié)果TLR配體增強IL-10和IL-12從樹突狀細胞和巨謹細胞的產(chǎn)生。而且， 從先天性免疫細胞中產(chǎn)生的IL-12和IL-10分別促進Thl和Treg細胞的誘
導。這解釋了將TLR激動劑作為佐劑時，同時誘導了 Thl和Treg細胞。 在此我們顯示了 p38或ERK抑制劑或兩者的組合物與CpG共同作用，增 強Thl和阻遏Tr對外源抗原的體外和體內(nèi)誘導。DC用單獨的OVA肽或 與CpG —起或在存在p38抑制劑或p38和ERK抑制劑時用CpG刺激，接 著用于刺激從DO11.10OVA-T細胞受體(TCR)轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠的脾純 化出的CD4+T細胞。在用抗原進行一輪或兩輪刺激后，檢測T細胞細胞 因子的產(chǎn)生。結(jié)果表明在存在CpG時，OVA沖激DC誘導分泌IL-10和IFN-Y T細胞，這與體內(nèi)誘導Thl和Treg細胞一致(圖12 )。加入p38抑制劑阻 遏分泌IL-10的T細胞的誘導且增加分泌IFN-y的T細胞。這在加入ERK 抑制劑后進一步增強。我們接著4企測了 p38、ERK和Cox-2抑制劑對CpG-激活的樹突狀細胞 體內(nèi)誘導T細胞應答的能力。骨髓來源的DC用單獨的KLH或單獨的CpG 或p38、 ERK和Cox-2抑制劑的組合物一起刺激，然后皮下注射到小鼠中。 5天后取下引流淋巴結(jié)和脾，用抗原(KLH)刺激細胞且評估細胞因子產(chǎn) 生。數(shù)據(jù)顯示，在存在CpG時用抗原沖激的DC在體內(nèi)誘導分泌IL-10和 IFN-Y的T細胞(圖13)。在注射入小鼠前，用CpG和抗原刺激時，加入 p38或Cox-2抑制劑到DC增強DC誘導分泌IFN-y的T細胞的能力，而 阻遏分泌IL-10的T細胞。ERK抑制劑阻遏分泌IL-10的T細胞的誘導， 但也阻遏Thl細胞。ERK、p38和Cox-2抑制劑的組合物完全阻遏產(chǎn)生IL-10 的T細胞，但也減少分泌IFN-y的T細胞。這一發(fā)現(xiàn)證實，將TLR激動 劑作為佐劑時，p38和Cox-2抑制劑增強Thl和阻遏Treg細胞對外源抗原 的感應。ERK抑制劑也阻遏產(chǎn)生IL-10的T細胞。實施例ll-Cox-2抑制劑阻遏TLR激動劑誘導的IL-10和TGF-P的產(chǎn)生且 增強內(nèi)源IL-12和IL-27的產(chǎn)生材料和方法用CpG (10嗎)或用CpG和CoxJ抑制劑塞來昔布(100嗎)側(cè)腹 注射C57BL/6小鼠。2和6小時后，取下引流區(qū)腹股溝淋巴結(jié)，過篩并在 1 ml的PBS中重懸。移取細胞，且用ELISA法對上清液中的IL-10和TGF-卩 的濃度進行定量(圖14)。用單獨的CpG (10嗎)或用不同濃度的Cox-2抑制劑塞來昔布(5、 50或500嗎)側(cè)腹注射C57BL/6小鼠。6小時后，取下引流區(qū)腹股溝淋巴 結(jié)，制備單個細胞的懸浮液。勻漿細胞，且生成的mRNA通過RT-PCR分 析IL-27和IL-10的表達，且與p-肌動蛋白表勤目比較(圖15 )。來自C57BL/6小鼠的骨髓來源的DC與具不同濃度Cox-2抑制劑 NS-398的CpG( 10嗎)溫育24小時。移去上清液且用ELISA法測定IL-10 和IL-12p40的濃度(圖16)。來自C57BL/6小鼠的骨髓來源的DC與具不同濃度的Cox-2抑制劑 NS-398的CpG ( 10 pg)溫育24小時。勻漿細胞，且用IL-10和IL-27p38 特異性引物進行RT-PCR分析生成的mRNA，且與P-肌動蛋白表W目對比 (圖17)。來自C57BL/6小鼠的骨髓來源的DC與CpG(10嗎)或與1或10 的Cox-2抑制劑NS-398的溫育24小時。勻漿細胞，且用IL-10、 IL-12p35 或IL-12p40特異性引物進行RT-PCR分析生成的mRNA,且與|3-肌動蛋白 表勤目對比(圖18)。結(jié)果因為發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞表達Cox-2且胂瘤上清液和CpG誘導Cox-2在先天 性免疫細胞中的表達，所以我們檢測了 Cox-2抑制劑對樹突狀細胞中TLR 激動劑誘導的細胞因子體內(nèi)或體外的表達的影響。用單獨的CpG或在存在 Cox-2抑制劑時皮下注射小鼠，6小時后取下淋巴結(jié)且評估細胞因子的產(chǎn) 生。注射CpG誘導IL-10和TGF-p的產(chǎn)生，其在與Cox-2抑制劑共同給藥 時被阻遏(圖14)。 CpG-誘導的小鼠中IL-10 mRNA的表達也被與Cox-2 抑制劑的共同給藥所阻遏，而IL-27 mRNA的表達被增強(圖15)。 CpG 體外刺激DC誘導IL-10和IL-12p40的產(chǎn)生。加入一種Cox-2抑制劑到培 養(yǎng)基中阻遏IL-10且增強IL-12產(chǎn)生(圖16)。 CpG也誘導IL-12pG40、 IL-12p35和IL-27p28 mRNA的表達，其在加入Cox-2抑制劑時4皮增強(圖 17和18)。相比之下，CpG誘導的IL-10 mRNA的表達被此Cox-2抑制劑
阻遏。這些發(fā)現(xiàn)證實兩種不同的Cox-2抑制劑在增強引導Thl細胞誘導的 調(diào)節(jié)性細胞因子時，具有阻遏抗炎性和Treg促進細胞因子的作用。因此 TLR激動劑和Cox-2抑制劑的組合物為有效的啟動體內(nèi)對外源和腫瘤抗原 的天然和獲得性效應應答的方法。實施例12-用Cox-2抑制劑和CpG的組合物治療阻遏腫瘤生長 材料和方法C57BL/6小鼠用2x 1()S個B16肺瘤細胞皮下攻擊，且在第3、 5和7 天，用CpG (10嗎)、Cox-2抑制劑塞來昔布(100嗎)或兩者的組合物在 腫瘤位點皮下注射。常規(guī)性的監(jiān)測小鼠腫瘤的生長(圖19)。C57BL/6小鼠用2 x 105個B16腫瘤細胞皮下激發(fā)，且在第3、 5和7 天，用CpG ( 20嗎)、Cox-2抑制劑塞來昔布(500 jxg)或兩者的組合物在 腫瘤位點皮下注射。常規(guī)性的監(jiān)測小鼠腫瘤的生長(圖20)。C57BL/6小鼠用2x 105個腫瘤細胞皮下攻擊，且在第3、 5和7天， 用CpG ( 20嗎)、Cox-2抑制劑塞來昔布(500嗎)或兩者的組合物在腫瘤 位點皮下注射。常規(guī)性的監(jiān)測小鼠腫瘤和存活情況(圖21)。結(jié)果我們用鼠科腫瘤模型評價與Cox-2抑制劑結(jié)合的TLR激動劑的治療療 效。用B16肺瘤皮下攻擊小鼠，在第3、 5和7天不處理或通過在腫瘤位 點皮下注射CpG(10嗎)，與或不與Cox-2抑制劑(塞來昔布100嗎)，或 僅以Cox-2抑制劑處理小鼠。用單獨的Cox-2抑制劑處理增強了腫瘤的生 長而單獨的CpG效果很小(圖19)。然而CpG和Cox-2抑制劑的組合導 致腫瘤生長完全降低。用高劑量的CpG ( 20嗎)和Cox-2抑制劑(500嗎) 重復了這些研究。高劑量的CpG確實降低腫瘤的生長，但是當與Cox-2 抑制劑組合治療時保護療效顯著的增強(圖20)。 CpG和Cox-2抑制劑超 過單獨CpG或單獨的Cox-2抑制劑的保護效果，在幸存曲線和無瘤小鼠的 數(shù)量上也非常顯著(圖21 )。所有的未處理的小鼠在45天內(nèi)死亡，而所有 的CpG處理的小鼠僅在55天內(nèi)死亡。20%的用Cox-2抑制劑處理的小鼠
幸存，而用CpG和Cox-2抑制劑處理的小鼠，有40%存活。實施例13-Cox-2或ERK抑制劑增強樹突狀細胞接種疫苗對腫瘤的治療療 效材料和方法C57BL/6小鼠用2x 1()S個B16腫瘤細胞皮下攻擊，且用處理的DC( 1-5 x 105)在第3天開始每隔一周皮下注射到腫瘤位點處理小鼠3次。用熱激 /輻射的B16腫瘤細胞和單獨的CpG (5 ng/ml)或與Cox-2抑制劑塞萊昔 布(5^M)或ERK抑制劑U0126 (5mM)沖激DC24小時。常規(guī)性的監(jiān) 測小鼠腫瘤的生長(圖22)。 11只C57BL/6小鼠組用2xl()4個B16腫瘤 細胞皮下攻擊，且在腫瘤攻擊后第3、 10和17天，用處理的DC( l-5x 105) 注射小鼠3次(皮下注射到腫瘤位點)。DC單獨與或與具Cox-2抑制劑 NS398 (5 pM)的HSP-70 (5pg/ml)溫育24小時。常規(guī)性的監(jiān)測小鼠腫 瘤生長和存活情況。括號中的數(shù)字為卡方(log rank)檢驗的顯著性值(圖 23 )。骨髓來源的DC與僅培養(yǎng)基(對照)、HSP70疫苗(5 mg/ml )、 Cox-2 抑制劑NS398 ( 5 mM )、 HSP70和Cox-2抑制劑或LPS ( 10 ng/ml)溫育。 24小時后細胞用抗CD80和CD11C抗體標記，且進行細胞熒光分析。結(jié) 果以CDllc+的DC群體細胞上的平均熒光強度(MFI)顯示(圖24)。結(jié)果除了潛在的治療癌的療效外，TLR激動劑也具有佐劑特性且增強病原 體或腫瘤抗原誘導的免疫應答。已顯示TLR激動劑CpG可增強天然細胞 中IL-10的產(chǎn)生且由此誘導Treg細胞，其可對癌或傳染性疾病疫苗不利。 本發(fā)明驚人地顯示，通過與Cox-2或ERK抑制劑聯(lián)合應用，他們可增強 腫瘤疫苗的療效。我們的方式是在存在CpG和有或無抑制劑時，使用抗原 沖激的樹突狀細胞，而不是用腫瘤抗原和佐劑直接免疫，其會被腫瘤的免 疫抑制性環(huán)境影響(如圖1顯示)。我們運用熱激的和輻射的B16細胞作 為全細胞瘤疫苗，其在存在或無Cox-2或ERK抑制劑時與DC和CpG溫
育。在存在CpG時，用腫瘤抗原沖激的樹突狀細胞治療性免疫，不影響腫 瘤生長(圖22 )。然而在存在Cox-2或ERK抑制劑時，用B16抗原和CpG 沖激的DC免疫，顯著減緩了腫瘤生長速率。我們也檢測了 Cox-2抑制劑對用熱激蛋白疫(HSP) -70疫苗治療性免 疫的療效。HSP-70疫苗通過從B16腫瘤純化制備，已顯示對小鼠B16腫 瘤具預防性免疫的療效，但當將其治療用給藥于具生長著的腫瘤的小鼠 時，效果甚孩i。在此，在存在或不存在Cox-2抑制劑時，我們用HSP-70 疫苗沖激樹突狀細胞，然后在B16腫瘤攻擊后3、 10和17天，將細胞轉(zhuǎn) 移。Cox-2抑制劑沖激的DC單獨給藥，無保護效果(圖23)。而且，相比 用未沖激的DC給藥觀察到的結(jié)果，單獨用HSP-70疫苗沖激的DC免疫不 增強存活率或無瘤小鼠的數(shù)量。然而，在存在Cox-2抑制劑時用HSP-70 疫苗沖激的DC治療性免疫小鼠，使我們觀察到最多數(shù)量的無瘤小鼠(77%) 和最高百分率的幸存率(77%)。這些發(fā)現(xiàn)證實，相比于單獨用一種治療， 聯(lián)合應用Cox-2抑制劑和HSP-70疫苗具有驚人的增強治療癌的療效。對Cox-2和HSP70對DC活化的效果的枱r驗揭示，單獨用Cox-2或 HSP70不能增強CD80的表達，然而聯(lián)合應用顯著增強CD80平均熒光強 度，達到用LPS的水平(圖24 )。這些結(jié)果表明聯(lián)合用HSP70和Cox-2抑 制劑使樹突狀細胞成熟，此影響在單獨用一種分子時不能觀察到。實施例14-ERK、 Cox-2或p38的抑制阻遏樹突狀細胞中TLR激動劑誘導 的PGE2材料和方法在體外用CpG (5嗎)或ERK抑制劑、U0126 (5 pM)，或兩者一起 刺激骨髓來源的樹突狀細胞(DC) 24小時。移去上清液且用ELISA法測 定PGE2的濃度。方差分析"PO.Ol, CpG + p38對比CpG (圖25)。單獨用CpG (5嗎)或與Cox-2抑制劑NS-398 —起存在時，刺激骨 髓來源的DC。 24小時后移去上清IE用ELISA法測定PGE2的濃度(圖 26(a))。方差分析承P〈0.05， CpG + p38對比CpG。 用熱激的或輻射的B16肺瘤細胞處理骨髓來源的DC 4小時，然后用 CpG(5嗎)、p38抑制劑SB 203580 (5 mM),或兩者一起刺激24小時。 移去上清液且用ELISA法測定PGE2的濃度。方差分析* <0.05， CpG + p38 對比CpG (圖27)。結(jié)果圖25顯示對ERK活化的阻遏逆轉(zhuǎn)CpG誘導的樹突狀細胞中PGE2的 產(chǎn)生。圖26 (a)顯示對Cox-2的產(chǎn)生的阻遏逆轉(zhuǎn)CpG誘導的樹突狀細胞中 PGE2的產(chǎn)生。圖27顯示對p38 MAP激酶活化的阻遏逆轉(zhuǎn)CpG誘導的樹突狀細胞中 PGE2的產(chǎn)生。實施例15-Cox-2抑制劑阻遏TLR激動劑誘導的樹突狀細胞中IL-10的產(chǎn) 生才才料和方法單獨用CpG (5嗎)或與Cox-2抑制劑NS-398 —起存在時，刺激骨 髓來源的DC。 24小時后移去上清液且用ELISA法測定IL-IO的濃度(圖 26(b))。方差分析承P〈0.05， CpG + p38對比CpG。方差分析*卩<0.05， CpG 十p38對比CpG。結(jié)果圖26( b )顯示對Cox-2產(chǎn)生的阻遏逆轉(zhuǎn)CpG誘導的樹突狀細胞中IL-10 的產(chǎn)生。實施例16-對p38的抑制在腫瘤疫苗和TLR激動劑刺激的樹突狀細胞中阻 遏IL-10且增強IL-12的產(chǎn)生材料和方法將骨髓來源的DC與熱激過的B16肺瘤細胞一起孵育4小時，與輻射 過的B16腫瘤細胞孵育4小時，然后用CpG( 5 jig )、 p38抑制劑SB 203580 (5^M)或兩者刺激。24小時后移去上清液，且采用ELISA法測定IL-IO、 IL-12p40、 IL-12p70和IL-23的濃度。方差分析承P0.05， ***P<0.0001, CpG 十p38對比CpG。結(jié)果圖28顯示對p38 MAP激酶活化的阻遏逆轉(zhuǎn)CpG誘導的樹突細胞中的 IL-10,而增強IL-12的產(chǎn)生。IL-23的產(chǎn)生不被p38抑制劑影響。實施例17-對p38的抑制增強樹突狀細胞疫苗和用腫瘤疫苗和CpG沖激的 樹突狀細胞的治療效果材料和方法將骨髓來源的DC與熱激過的B16胂瘤細胞處理4小時，和輻射過的 B16腫瘤細胞處理4小時，然后用僅培養(yǎng)基或p38抑制劑SB 203580( 5 ) 刺激24小時。用2 x 105個B16腫瘤細胞皮下(s.c.)攻擊C57BL/6小鼠且 在攻擊后3、 10和17天通過注射5xl()S個DC到腫瘤位點進行處理。常 規(guī)性的監(jiān)測腫瘤生長。結(jié)果以單個小鼠的肺瘤體積表示(圖29)。將骨髓來源的dc用熱激過的b16腫瘤細胞處理4小時，和輻射過的 B16腫瘤細胞處理4小時，然后用單獨的CpG (5嗎)或在存在p38抑制 劑sb 203580 ( 5 mM )時刺激24小時。用2 x 105個b16腫瘤細胞皮下攻 擊C57BL/6小鼠且在攻擊后3、 10和17天通過注射5 x 105個DC到肺瘤 位點進行處理。常規(guī)性的監(jiān)測腫瘤生長。結(jié)果以單個小鼠的腫瘤體積表示 (圖30)。將骨髓來源的DC與熱'^L/輻射的B16腫瘤細胞處理4小時，然后用僅 培養(yǎng)基、CpG ( 5 pg )、 CpG和p38抑制劑SB 203580 ( 5 yM)或僅p38抑 制劑刺激24小時。用2x 1()S個B16胂瘤細胞皮下攻擊C57BL/6小鼠且在 攻擊后3、 10和17天通過注射5 x 105個DC到腫瘤位點進行處理。常規(guī) 性的監(jiān)測小鼠的存活率。括號中的數(shù)字表示相對對照組具統(tǒng)計學差異(圖 31)。
結(jié)果圖29顯示p38抑制劑增強腫瘤疫苗的保護效果，該疫苗包含滅活的 全瘤細胞激活的樹突狀細胞。圖30顯示p38抑制劑增強腫瘤疫苗的保護效果，該疫苗包含在存在 TLR激動劑CpG時滅活的全瘤細胞激活的樹突狀細胞。圖31顯示在用包含用單獨的滅活的全瘤細胞或在存在TLR激動劑 CpG時激活的樹突狀細胞的疫苗給藥治療后，p38抑制劑增強小鼠的存活 率。實施例18-用全瘤疫苗和CpG沖激的樹突狀細胞治療增加腫瘤中T細胞 IFN-y的產(chǎn)生材料和方法骨髓來源的DC用與熱^t/輻射的B16腫瘤細胞處理4小時，然后用僅 培養(yǎng)基或CpG (5 jig)刺激24小時。用2x 1()S個B16腫瘤細胞皮下攻擊 C57BL/6小鼠且在攻擊后3和10天通過注射5 x 105個DC到腫瘤位點進 行處理。在第15天提取腫瘤，CD4+和CD8+細胞內(nèi)的IL-17和IFN-y用FACS 通過免疫熒光方法測定。結(jié)果圖32顯示將用滅活的肺瘤細胞和CpG沖激的樹突狀細胞給藥，治療 具皮下腫瘤的小鼠，增加生長著的腫瘤中CD4+和CD8+ T細胞產(chǎn)生IFN-y 的頻率。實施例19-用B16疫苗、CpG和p38抑制劑處理過的樹突狀細胞治療增加 CD4+細胞的頻率，但是減小肺瘤塊中調(diào)節(jié)性T細胞的頻率材料和方法將骨髓來源的DC與熱'^L/輻射的B16腫瘤細胞處理4小時，然后用僅
培養(yǎng)基、CpG ( 5 jxg )、 CpG和p38抑制劑SB 203580 ( 5 |iM)或僅p38抑 制劑刺激24小時。用2x 1()S個B16腫瘤細胞皮下攻擊C57BL/6小鼠，且 在攻擊后3和10天通過注射5 x 105個DC到腫瘤位點進行處理。在第15 天提取腫瘤，腫瘤塊中CD4+細胞(A)和CD4+CD25+Foxp3+細胞(B) 的百分率用FACS通過特異性抗體免疫熒光方法測定。結(jié)果圖33顯示用滅活的胂瘤細胞和CpG沖激的樹突狀細胞給藥，治療具 皮下肺瘤的小鼠，增強CD4+ T細胞到生長著的腫瘤的募集且阻遏表達 Foxp3的調(diào)節(jié)性T細胞的募集。實施例20-瘤體注射CpG和p38抑制劑增加存活率 材料和方法用2x 1(^個B16肺瘤細胞皮下攻擊C57BL/6小鼠且在攻擊后3、 5和 7天通過將CpG ( 25嗎)、p38抑制劑SB204580 ( 50昭)或兩者同時注射 到腫瘤位點進行處理。常規(guī)性的監(jiān)測小鼠存活率。結(jié)果圖34顯示相比單獨用CpG或p38抑制劑治療后觀察到的情況，在存 在p38抑制劑時將CpG治療性給藥，能增加具皮下B16腫瘤的小鼠的存 活率。實施例21-pl3K抑制劑增強腫瘤疫苗和CpG沖激過的樹突狀細胞的治療效 果，增加具生長腫瘤的小鼠的存活率材料和方法骨髓來源的DC首先體外用熱激和輻射過的B16腫瘤細胞沖激4小時， 然后單獨用CpG (5 pg/ml)或與pl3K抑制劑渥曼青霉素(2.5 ^M)刺激 24小時。用2 x 105個B16腫瘤細胞皮下攻擊C57BL/6小鼠，且在攻擊后 3、 10和17天，通過將2x 1()S個處理過的DC注射到腫瘤位點進行處理。
常規(guī)性的監(jiān)測肺瘤生長且將每組的平均值繪制成圖(圖35)。骨髓來源的DC首先體外用熱激和輻射過的B16腫瘤細胞沖激4小時， 然后單獨用CpG ( 5 pg/ml)或與p13激酶(pl3K)抑制劑渥曼青霉素(2.5 pM)刺激24小時。用2 x 105個B16肺瘤細胞皮下攻擊C57BL/6小鼠， 且在攻擊后3、 10和17天，通過將5xl()S個處理過的DC注射到腫瘤位 點進行處理。常規(guī)性的監(jiān)測腫瘤生長以得到生存率(圖36)。結(jié)果結(jié)果顯示在存在p13激酶時，用滅活的腫瘤細胞和CpG沖激的DC治 療性給藥比用腫瘤細胞和單獨的CpG或pl3K抑制劑沖激過的DC具更好 的治療效果(圖35)。而且，在存在p13激酶抑制劑時，用滅活的腫瘤細 胞和CpG沖激的DC治療性給藥，相比用腫瘤細胞和單獨的CpG或pl3K 抑制劑沖激過的DC治療后觀察到的情況，增加了具皮下B16腫瘤小鼠的 存活率(圖36)。實施例22- CpG作為佐劑時用p38抑制劑增加了無細胞百日咳疫苗的保護 效果材料和方法單獨用0.02人用量的無細胞百日咳疫苗(JNIH-3，包括FHA和脫毒 百曰咳毒素)或在存在CpG( 5嗎)或CpG和p38抑制劑SB20358(K 50 mM ) 時腹腔(i. p.)免疫小鼠兩次(0和4周)。2周后，用百日咳桿菌氣霧攻 擊小鼠。經(jīng)過百日咳桿菌感染后，在攻擊后的0、 3、 7、 14和21天，對 來自四個為一組的小鼠肺上的CFU (菌落形成單位)進行計數(shù)。在無菌條 件下取下肺并于冰上在1 ml的含1%的酪蛋白的無菌生理鹽水中勻漿。未 稀釋的和連續(xù)稀釋的來自個體的肺的勻漿(100 nl) —式三份的點涂布在 Bordet-Gengou瓊脂糖平板上，于37。C溫育5天后計算CFU數(shù)。適合的檢 出限制為每個肺0.6 log1()CFU。結(jié)果圖37顯示低劑量的無細胞百日咳疫苗，甚至加有CpG作為佐劑時，
對小鼠的保護弱，但是與p38抑制劑共同給藥顯著增強保護效果。在存在 CpG和p38抑制劑時，用疫苗免疫過的小鼠肺中百日咳桿菌CFU數(shù)顯著 低一些。
實施例23-對加有CpG作為佐劑的無細胞百日咳疫苗的應答時，p38抑制 劑增強IFN-y且減少IL-10
材料和方法
單獨用0.02人用量的無細胞百日咳疫苗(JNIH-3包括FHA和脫毒的 百日咳毒素)或在存在CpG ( 5嗎)或CpG和p38抑制劑SB203580 ( 50 )腸外免疫小鼠兩次(0和4周)。2周后小鼠用百日咳桿菌氣霧攻擊小 鼠。在攻擊前或攻擊后取得脾單核細胞(2x 106/ml)，于37。C在5% C02 中培養(yǎng)，其含從百日咳桿菌純化的絲狀血凝素(FHA )或含PMA( 250 ng/ml， Sigma)和抗鼠CD3 (1 pg/ml; Pharmingen，圣地亞哥，美國)或僅培養(yǎng) 基作為陰性對照。72小時后移去上清且通過雙位點ELISA法測定IL-10和 IFN-y的濃度(圖38)。
單獨用無細胞百日咳疫苗(JNIH-3包括FHA和脫毒的百日咳毒素) 或在存在CpG ( 5嗎)或CpG和p38抑制劑SB203580 ( 50 一 )時腹腔免 疫小鼠兩次(0和4周)。2周后小鼠用百日咳桿菌氣霧攻擊小鼠。在攻擊 后14天取得脾單核細胞(2x l06/ml)，在存在布雷菲德菌素A時，于37 。C在5。/。C02中培養(yǎng)，其含PMA( 250 ng/ml, Sigma)和離子霉素(1 pg/ml) 或僅培養(yǎng)基作為陰性對照。4小時后用特異性抗體通過免疫熒光分析測定 且用FACS分析細胞內(nèi)IL-10 (圖39 )。
結(jié)果
結(jié)果表明用CpG作為佐劑的無細胞百日咳疫苗免疫后，p38抑制劑增 強IFN-y且減少IL-10的響應(圖38和圖39 )。
實施例24-在用百日咳桿菌攻擊小鼠后，加入p38抑制劑到CpG作為佐劑 的無細力包百日咳疫苗增加局部的IL-ip
才才料禾口方法
單獨用無細胞百日咳疫苗(JNIH-3包括FHA和脫毒的百日咳毒素) 或在存在CpG ( 5嗎)或CpG和p38抑制劑SB203580 ( 50 pM)時腹腔免 疫小鼠兩次(0和4周)。2周后小鼠用百曰咳桿菌氣霧攻擊小鼠。在攻擊 4小時后取下肺，勻漿，且用ELISA法測定IL-(3的濃度。
結(jié)果
圖40顯示在接種疫苗時，用百日咳桿菌攻擊免疫過的小鼠后，p38抑 制劑增強局部炎癥反應。在百日咳桿菌攻擊后，加p38抑制劑到CpG作為 佐劑的無細胞百日咳疫苗中，增加肺中局部的IL-ip。
實施例25-用肺瘤疫苗、TLR激動劑和p38抑制劑治療性免疫能減小小鼠 中B16腫瘤的生長
用2 x 105個B16腫瘤細胞皮下攻擊C57BL/6小鼠，且在攻擊后3、 5 和7天，將僅賦形劑(未處理的)熱激和輻射過的B16腫瘤細胞(1 x 106) 單獨注射或與CpG (10嗎)或與CpG和p38抑制劑SB203580 (50嗎) 一起注射到小鼠腫瘤位點。常規(guī)性地監(jiān)測腫瘤的生長。
結(jié)果
結(jié)果(圖41)顯示相比單獨用B16腫瘤或B16疫苗和CpG治療后觀 察到的情況，在存在p38抑制劑時將CpG作為佐劑用滅活的腫瘤疫苗治療 性免疫增加了具皮下B16腫瘤的小鼠的存活率。
實施例26-在IL-10缺陷的小鼠中腫瘤生長未顯著性的加劇
用2x 105個B16胂瘤細胞皮下攻擊C57BL/6或IL-10缺陷的小鼠且 17天后估計腫瘤的大小。結(jié)果為5只一組的小鼠的平均腫瘤體積。
結(jié)果
結(jié)果(圖42)顯示在IL-10缺陷的小鼠中，胂瘤生長未顯著性的加劇。 因此顯示IL-10不是介導抗炎反應的唯一介質(zhì)。
涉及本說明書的所有的文獻在此引為參考。對本發(fā)明所描述的實施例 的各種修飾和變化不偏離本發(fā)明的范圍，對本領域的技術(shù)人員來說容易理
解。雖然本發(fā)明連同特殊的優(yōu)選的實施例已被描述，應了解被要求;t又利的 本發(fā)明不受到這些特殊的實施例的不適當?shù)南拗?。實際上，對本領域的技 術(shù)人員來說，顯而易見地本發(fā)明涵蓋本發(fā)明
具體實施例方式
權(quán)利要求
1. 一種用于治療需要增強Th1介導的免疫應答的疾病的組合物，所述的組合物包括:(i)至少一種Toll樣受體(TLR)激動劑；和(ii)至少一種免疫調(diào)節(jié)劑，其抑制對免疫應答的阻遏，其中所述阻遏源于選擇性的抑制調(diào)節(jié)性T細胞的功能或源于對細胞因子表達的調(diào)節(jié)以致至少一種抗炎性細胞因子被阻遏且至少一種促炎細胞因子被上調(diào)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑抑制免疫應 答的下游介質(zhì)的功能，其中所述下游介質(zhì)選自包括下列組成的組肌醇磷 脂3激酶、環(huán)氧合酶2、 p38、 ERK、 MEK1或MEK2。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑為肌醇磷脂3 激酶抑制劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述肌醇磷脂3激酶抑制劑為 LY294002或渥曼青霉素(WMN)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑為環(huán)氧合酶2 抑制劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述環(huán)氧合酶2抑制劑為塞來 昔布(NS-398)或羅非可昔。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑抑制MAP 激酶蛋白的功能。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自包括下列 組成的組p38激酶抑制劑、ERK抑制劑、MEK 1抑制劑和MEK 2抑制 劑。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所迷的組合物，其中所述p38激酶抑制劑選自包括 下列組成的組SB203580、 SB220025或SB239063。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述ERK (胞外調(diào)節(jié)激酶) 抑制劑為U0126或PD98059。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述肌醇磷脂3激酶抑制劑 為LY294002或渥曼青霉素(WMN)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中的任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述 免疫調(diào)節(jié)劑抑制IL-10和/或TGF-P的產(chǎn)生和/或上調(diào)IL-12的產(chǎn)生。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1至12中的任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述 Toll樣受體激動劑選自包括下列組成的組Pam3CSK4、酵母聚糖、PolyIC、 dsRNA、 LPS(脂多糖)、單磷酰脂質(zhì)A( MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN( CpG-寡聚脫氧核苷酸)、咪查莫特、R838、 R83、百日咳桿菌和結(jié)核分枝桿菌。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一權(quán)利要求所述的組合物，其進一步包 括至少 一種腫瘤特異性抗原。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一權(quán)利要求所述的組合物，其進一步包 括調(diào)節(jié)性化合物，其抑制具有增強腫瘤細胞存活功能的腫瘤細胞產(chǎn)物。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其中該調(diào)節(jié)性化合物為腫瘤生長 抑制性產(chǎn)物。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述調(diào)節(jié)性的組合物促進凋 亡發(fā)生。
18. —種用于治療需要增強Thl-介導的免疫應答的疾病的藥物組合 物，其中該組合物包4舌-至少一種Toll樣受體激動劑，和-至少一種免疫調(diào)節(jié)化合物，及藥物可接受的賦形劑、稀釋劑或載體， 所述免疫調(diào)節(jié)化合物抑制免疫應答的阻遏，其中所述阻遏源于對調(diào)節(jié)性T 細胞功能的選擇性抑制或源于調(diào)節(jié)細胞因子表達以致至少 一種抗炎性細 胞因子被阻遏且至少一種促炎細胞因子被上調(diào)。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的藥物組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑抑制免 疫應答下游介質(zhì)的功能。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其中所述下游介質(zhì)選自包括 下列組成的組肌醇^粦脂3激酶、環(huán)氧合酶2、 p38、 ERK、 MEK 1或MEK 2。
21. 根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中 所述Toll樣受體激動劑選自包括下列組成的組Pam3CSK4、酵母聚糖、 PolyIC、 dsRNA、 LPS(脂多糖)、單磷酰脂質(zhì)A( MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN(GPG-寡聚脫氧核苷酸)、咪喹莫特、R838、 R83、百日咳桿菌和結(jié)核分 枝桿菌。
22. —種用于治療或預防需要增強Thl介導的免疫應答的疾病的方 法，該方法包括以下步驟-將治療有用量的至少一種Toll樣受體激動劑給藥；和-給藥治療有用量的至少 一種免疫調(diào)節(jié)劑，其抑制對免疫應答的阻遏， 其中所述阻遏源于對調(diào)節(jié)性T細胞功能的選擇性抑制或源于細胞因子表達 的調(diào)節(jié)，以致至少一種抗炎性細胞因子被阻遏且至少一種促炎細胞因子被 上調(diào)。
23. 至少一種Toll樣受體激動劑和免疫調(diào)節(jié)劑在治療需要增強Thl介 導的免疫應答的疾病中的應用，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑抑制對免疫應答的阻 遏，該阻遏通過對調(diào)節(jié)性T細胞的功能的選擇性抑制或源于對細胞因子表 達的調(diào)節(jié)以致至少一種抗炎性細胞因子被阻遏且至少一種促炎細胞因子 被上調(diào)。
24. 至少一種Toll樣受體激動劑和免疫調(diào)節(jié)劑在制備用于治療需要增 強Thl介導或其他效應因子的免疫應答疾病的藥物中的應用，其中所述免 疫調(diào)節(jié)劑抑制對免疫應答的阻遏，該阻遏通過對調(diào)節(jié)性T細胞的功能的選 擇性抑制或源于對細胞因子表達的調(diào)節(jié)，以致至少 一種抗炎性細胞因子被 阻遏且至少 一種促炎細胞因子被上調(diào)。
25. —種用于治療癌癥和惡性疾病的組合物，其包括(i )包括至少一種可引發(fā)免疫應答的腫瘤特異性抗原的組合物，所 述的應答對所述癌癥或惡性疾病特異，(ii )至少一種Toll樣受體激動劑；和(iii)免疫調(diào)節(jié)劑，其抑制對免疫應答的阻遏，該阻遏通過對調(diào)節(jié)性 T細胞的功能選擇性抑制或源于對細胞因子表達的調(diào)節(jié)，以致至少一種抗 炎性細胞因子被阻遏且至少一種促炎細胞因子被上調(diào)。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述腫瘤特異性的抗原來源 于熱激蛋白與來自癌細胞或患癌性疾病個體的抗原性肽的復合體。
27. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑抑制免疫應 答下游介質(zhì)的功能。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述下游介質(zhì)選自包括下列 組成的組肌醇磷脂3激酶、環(huán)氧合酶2、 p38、 ERK、 MEK1或MEK2。
29. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自包括下 列組成的組肌醇磷脂3激酶抑制劑、環(huán)氧合酶2抑制劑、p38激酶抑制 劑、ERK抑制劑、MEK 1抑制劑或MEK2抑制劑。
30. 根據(jù)權(quán)利要求25至29中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述 免疫調(diào)節(jié)劑抑制IL-10和/或TGF-P的產(chǎn)生和/或上調(diào)IL-12的產(chǎn)生。
31. 根據(jù)權(quán)利要求25至30中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述 Toll樣受體激動劑選自包括下列組成的組Pam3CSK4、酵母聚糖、PolyIC、 dsRNA、 LPS(脂多糖)、單磷酰脂質(zhì)A( MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN( GPG-寡聚脫氧核苷酸)、咪喹莫特、R838、 R83、百日咳桿菌和結(jié)核分枝桿菌。
32. 根據(jù)權(quán)利要求25至31中任一權(quán)利要求所述的組合物，其進一步 包括調(diào)節(jié)性化合物，其抑制有效增強腫瘤細胞存活的腫瘤細胞的產(chǎn)物。
33. —種治療癌癥或惡性疾病的方法，所述方法包括以下步驟-將抗癌疫苗或包括至少一種腫瘤特異性抗原的其抗原部分或抗原決 定簇給藥；-將至少一種Toll樣受體激動劑給藥，且-將治療有用量的免疫調(diào)節(jié)劑給藥于需要它的受治療者，所述調(diào)節(jié)劑抑 制對免疫應答的阻遏，該阻遏通過對調(diào)節(jié)性T細胞功能的選擇性抑制或源于細胞因子表達的調(diào)節(jié)，以致至少一種抗炎性細胞因子被阻遏且至少一種促炎細胞因子^:上調(diào)。
34. 包括至少一種腫瘤特異性抗原、至少一種Toll樣受體激動劑和免 疫調(diào)節(jié)化合物的組合物在制備用于治療癌癥或惡性疾病的藥物中的應用， 其中所述免疫調(diào)節(jié)化合物抑制對免疫應答阻遏，該阻遏通過選擇性抑制調(diào) 節(jié)性T細胞的功能或源于細胞因子表達的調(diào)節(jié)，以致至少 一種抗炎性細胞 因子被阻遏且至少一種促炎細胞因子被上調(diào)。
35. —種用于治療癌性疾病的疫苗組合物，其包括 -樹突狀細胞，-至少一種肺瘤細胞抗原， -至少一種Toll樣受體激動劑，和-免疫調(diào)節(jié)化合物，其抑制對免疫應答的阻遏，該阻遏通過選擇性抑制 調(diào)節(jié)性T細胞的功能或源于調(diào)節(jié)細胞因子的表達，以致至少一種抗炎性細 胞因子被阻遏且至少一種促炎細胞因子被上調(diào)。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的組合物，其中該免疫調(diào)節(jié)劑抑制免疫應答 的下游介質(zhì)的功能。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的組合物，其中該下游介質(zhì)選自包括下列組 成的組肌醇磷脂3激酶、環(huán)氧合酶2、 p38、 ERK、 MEK1或MEK2。
38. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的組合物，其中該免疫調(diào)節(jié)劑選自包括下列 組成的組肌醇磷脂3激酶抑制劑、環(huán)氧合酶2抑制劑、p38激酶抑制劑、 ERK抑制劑、MEK1抑制劑或MEK2抑制劑。
39. 根據(jù)權(quán)利要求35至38中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中該免 疫調(diào)節(jié)劑抑制IL-10和/或TGF-j3的產(chǎn)生和/或上調(diào)IL-12的產(chǎn)生。
40. 根據(jù)權(quán)利要求35至39中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中該Toll 樣受體激動劑選自包括下列組成的組Pam3CSK4、酵母聚糖、PolyIC、 dsRNA、 LPS(脂多糖)、單磷酰脂質(zhì)A( MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN( GPG-寡聚脫氧核苷酸)、咪喹莫特、R838、 R83、百日咳桿菌和結(jié)核分枝桿菌。
41. 根據(jù)權(quán)利要求35至40中任一權(quán)利要求所述的組合物，其進一步 包括調(diào)節(jié)性化合物，該化合物抑制有效增強腫瘤細胞存活的腫瘤細胞的產(chǎn) 物。
42. 樹突狀細胞、至少一種腫瘤特異性抗原、至少一種Toll樣受體激 動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物在治療癌性疾病中的應用，其中所述免疫調(diào)節(jié)化合 物抑制對免疫應答阻遏，該阻遏通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細胞的功能或源 于細胞因子表達的調(diào)節(jié)，以致至少一種抗炎性細胞因子被阻遏且至少一種 促炎細胞因子被上調(diào)。
43. 樹突狀細胞、至少一種腫瘤特異性抗原、至少一種Toll樣受體激 動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物在制備用于治療癌性疾病的疫苗組合物中的應用， 其中所述免疫調(diào)節(jié)化合物抑制對免疫應答阻遏，該阻遏通過選擇性抑制調(diào) 節(jié)性T細胞的功能或源于細胞因子表達的調(diào)節(jié)，以致至少一種抗炎性細胞 因子被阻遏且至少一種促炎細胞因子被上調(diào)。
44. 一種用于治療癌性疾病的疫苗組合物，其包括 -樹突狀細胞，-至少一種Toll樣受體激動劑，和-免疫調(diào)節(jié)化合物，其抑制對免疫應答的阻遏，該阻遏通iM"調(diào)節(jié)性T 細胞的功能的選擇性抑制或源于調(diào)節(jié)細胞因子表達，以致至少 一種抗炎性 細胞因子被阻遏且至少一種促炎細胞因子被上調(diào)。
45. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的組合物，其中該免疫調(diào)節(jié)劑抑制免疫應答 的下游介質(zhì)的功能。
46. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的組合物，其中該下游介質(zhì)選自包括下列組 成的組肌醇磷脂3激酶、環(huán)氧合酶2、 p38、 ERK、 MEK1或MEK2。
47. 根絕權(quán)利要求45所述的組合物，其中該免疫調(diào)節(jié)劑選自包括下列 組成的組肌醇磷脂3激酶抑制劑、環(huán)氧合酶2抑制劑、p38激酶抑制劑、 ERK抑制劑、MEK 1抑制劑或MEK 2抑制劑。
48. 根據(jù)權(quán)利要求44至47中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中該免疫調(diào)節(jié)劑抑制IL-10和/或TGF-p的產(chǎn)生和/或上調(diào)IL-12的產(chǎn)生。
49. 根據(jù)權(quán)利要求44至48中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中該Toll 樣受體激動劑選自包括下列組成的組Pam3CSK4、酵母聚糖、PolyIC、 dsRNA、 LPS(脂多糖)、單磷酰脂質(zhì)A( MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN( GPG-寡聚脫氧核苷酸)、咪喹莫特、R838、 R83、百日咳桿菌和結(jié)核分枝桿菌。
50. 根據(jù)權(quán)利要求44至49中任一權(quán)利要求所述的組合物，其進一步 包括調(diào)節(jié)性化合物，其抑制有效增強腫瘤細胞存活的腫瘤細胞的產(chǎn)物。
51. 樹突狀細胞、至少一種Toll樣受體激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物在治 療癌性疾病中的應用，其中所述免疫調(diào)節(jié)化合物抑制對免疫應答的阻遏， 該阻遏通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細胞的功能或源于調(diào)節(jié)細胞因子表達，以 致至少 一種抗炎性細胞因子^皮抑制和至少 一種促炎細胞因子被上調(diào)。
52. 樹突狀細胞、至少一種Toll樣受體激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物在制 備用于治療癌性疾病的疫苗組合物中的應用，其中所述免疫調(diào)節(jié)化合物抑 制對免疫應答的阻遏，該阻遏通過選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細胞的功能或源于 對細胞因子表達的調(diào)節(jié)，以致至少一種抗炎性細胞因子被阻遏且至少一種 促炎細胞因子被上調(diào)。
53. —種誘導受治療者中的Thl應答以治療癌癥或傳染性疾病的方 法，該方法包括以下步驟-在疫苗或TLR激動劑和免疫調(diào)節(jié)化合物存在下，其中該免疫調(diào)節(jié)化 合物抑制先天性免疫系統(tǒng)的細胞中IL-10和/或TGF-P的產(chǎn)生和/或上調(diào) IL-12的產(chǎn)生，使分離的樹突狀細胞間接體內(nèi)暴露于疾病特異性抗原，以 便使所述樹突狀細胞成熟為促進效應細胞功能的表型，-將所述樹突狀細胞給藥到受治療者，由此在受治療者中產(chǎn)生的免疫應 答足以阻止癌癥的發(fā)病或發(fā)展，或阻止病原微生物的感染且由此阻止傳染 寸生疾病。
全文摘要
本發(fā)明通過施用一種組合物，提供了一種調(diào)節(jié)免疫應答的方法，該組合物包括Toll樣受體激動劑和能夠下調(diào)抗炎性細胞因子IL-10的表達和上調(diào)促炎性細胞因子IL-12的表達的免疫介質(zhì)。此方法可用于提供癌性疾病和傳染病的治療性治療。
文檔編號A61K39/39GK101394865SQ200680051686
公開日2009年3月25日 申請日期2006年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月1日
發(fā)明者安德魯·亞尼克, 迪爾德麗·托米, 金斯敦·米爾斯 申請人:都柏林伊麗莎白女皇神學院院長、研究員及專家協(xié)會