專利名稱：用于癌癥治療的新組合物和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及應用Stat3通路抑制劑和癌干細胞抑制劑組合治療癌癥及其他紊亂 的組合物和方法。
背景技術：
癌干細胞(CSC)近年來，一種新的腫瘤發(fā)生模型得到了廣泛認可，其中提出假說，在全部腫瘤物質 中僅一小部分負責腫瘤內的致瘤活性，而老的模型或者說克隆遺傳模型卻假定所有突變的 腫瘤細胞均等同地貢獻于此致瘤活性。根據新模型，這小部分腫瘤發(fā)生細胞是具有干細胞 樣性能的轉化細胞，并稱為“癌干細胞”(CSC)。在20世紀90年代，Bonnet和Dick首先在 體內證明了急性髓性白血病(AML)中CSC的存在。他們的數據表明，僅小亞群的人AML細胞 在移植到免疫缺陷小鼠中時具有轉移AML的能力，而其他AML細胞不能夠誘發(fā)白血病。后 來，證明這些CSC具有與原始造血干細胞相同的細胞標志⑶347⑶38_[1]。從那以后，研究 人員已經確鑿地在多種類型的腫瘤(包括腦、乳腺、皮膚、前列腺等的腫瘤)中發(fā)現CSC。腫瘤發(fā)生的CSC模型能夠解釋為什么為了確立腫瘤移植物，需要將幾萬或幾十萬 的腫瘤細胞注射到試驗動物體內。在人AML中，這些CSC細胞的頻率低于萬分之一 [2]。盡 管CSC在一個給定的腫瘤細胞群體中是稀少的，但有增加的證據表明此類細胞存在于幾乎 所有腫瘤類型中。然而，由于癌細胞系是從特異地適應于在組織培養(yǎng)中生長的癌細胞亞群 中選擇的，所以癌細胞系的生物學及功能特性可能經歷顯著的變化。因此，并非所有的癌細 胞系都含有CSC。癌干細胞與正常干細胞享有許多相似的性狀。例如，CSC具有自我更新能力，即產 生其他的腫瘤發(fā)生癌干細胞的能力，一般速率比其他分裂腫瘤細胞低，但非有限次數的分 裂。CSC還具有分化成多種細胞類型的能力，這就解釋了如下組織學現象一許多腫瘤不 僅含有多種對宿主器官而言天然的細胞類型，而且腫瘤轉移中常常保持異質性。已經證明 CSC根本性地負責腫瘤發(fā)生、癌癥轉移和癌癥復發(fā)。CSC也稱為腫瘤起始細胞、癌干細胞樣 細胞、干細胞樣癌細胞、高致瘤性細胞、腫瘤干細胞、實體瘤干細胞或超級惡性細胞。癌干細胞的存在對于未來的癌癥治療和療法具有根本性的意義。目前癌癥治療的 功效在檢驗的初始階段往往以腫瘤大小的縮減來衡量，即去掉的腫瘤物質的量。由于CSC 構成腫瘤的一個極小部分，且具有與其更為分化的子代顯著不同的生物學特征，所以對腫 瘤質量的測量可能不一定能夠選擇出特異地作用于此干細胞的藥物。事實上，癌干細胞呈 現出抵抗放療(XRT)，并且對化療劑和靶向藥物也表現出頑固性[3-5]。正常的體干細胞天 然地對化療劑具有耐藥性——他們具有將藥物泵出的多種泵(例如MDR)以及有效的DNA修復機制。而且，他們還具有緩慢的細胞更新速率，而化療劑靶向快速復制的細胞。癌干細胞 為正常干細胞的突變對應物，可能也具有類似的機制使之幸免于藥物治療和放射治療。換 言之，傳統的化療法和放療法殺死不能再生腫瘤的分化了的或分化中的細胞，這些細胞構 成腫瘤的大部分。另一方面，產生所述分化了的或分化中的細胞的癌干細胞群可能保持原 樣并引起疾病復發(fā)。傳統抗癌療法的另一危險在于所述治療(例如化療)可能導致僅僅留 下耐受化療的癌干細胞，由此使得繼發(fā)的復發(fā)腫瘤很可能也是化療耐受的。由于存活的癌干細胞能夠使腫瘤重新建殖故而造成復發(fā)，所以在抗癌療法中納入 抗CSC策略是絕對必要的(見


圖1)。這就類似于斬草需除根[6]。通過選擇性地靶向癌干 細胞，可以治療患有侵襲性不可切除腫瘤和頑固性或復發(fā)性癌癥的患者，以及防止腫瘤轉 移和復發(fā)。因此，開發(fā)靶向癌干細胞的特異性療法為癌癥患者、尤其是轉移性癌癥患者的存 活和改善生活質量提供了希望。開啟這股未被利用的潛力的關鍵在于鑒定和驗證對于癌干 細胞自我更新和存活具有選擇的重要性的通路。雖然在過去已闡述過位于胚胎干細胞或成 體干細胞的自我更新或癌癥的腫瘤發(fā)生背后的多個通路，但是尚未鑒定和驗證用于癌干細 胞自我更新和存活的通路。也有許多鑒定和分離癌干細胞的研究。所用的方法主要是利用CSC外排藥物的能 力，或是基于癌干細胞相關表面標志的表達。例如，由于CSC對許多化療劑具有耐藥性，那么CSC幾乎普遍地過表達藥物外排泵 如ABCG2(BCRP-1) [7-11]及其他ATP結合盒(ABC)超家族成員[12，13]，就不足為奇。從 而，也采用最初用來富集造血和白血病干細胞的側群(side population, SP)技術來鑒定和 分離CSC[14]。這種技術首先由Goodell等人描述，利用熒光染料如Hoechst 33342的差異 性ABC轉運蛋白依賴性外排來確定和分離富含CSC的細胞群[10，15]。具體而言，通過用戊 脈安(verapamil)阻斷藥物外排來揭示該SP，此時染料不再能夠泵出該SP。研究人員還集中于尋找使癌干細胞區(qū)別于大部分腫瘤的特異性標志。最常表達的 CSC表面標志包括⑶44、⑶133和⑶166 [16-24]。通過主要基于這些表面標志的差異表達 來分選腫瘤細胞，已經導致了迄今描述的高致瘤性CSC的大多數。因此，對于從癌細胞系和 大塊腫瘤組織中鑒定和分離癌干細胞而言，這些表面標志是被充分驗證了的。Stat3 通路哺乳動物或人癌細胞中有許多不同的遺傳缺陷，且有許多已被研究以尋求治愈癌 癥。例如，已經發(fā)現p53腫瘤阻遏蛋白在半數以上的人類癌癥中是缺陷型的或者全然無存。 STAT (信號轉導及轉錄活化因子)蛋白家族是潛伏的轉錄因子，響應細胞因子/生長因子而 被激活以促進增殖、存活及其他生物過程。其中，Stat3通過由生長因子受體酪氨酸激酶、 Janus激酶或Src家族激酶等介導的關鍵酪氨酸殘基磷酸化而激活。這些激酶包括但不限 于 EGFR、JAK、Abl、KDR、c_Met、Src 和 Her2[25]。一旦酪氨酸磷酸化，Stat3 形成同源二聚 體，轉位至細胞核，結合靶基因啟動子區(qū)中的特異性DNA效應元件，誘導基因表達[26](見 圖2)。在正常細胞中，Stat3激活是瞬時的，受到嚴密的調控，持續(xù)30分鐘至數小時。然 而，發(fā)現Stat3在廣泛種類的人類癌癥(包括所有主要的癌癥以及一些血液腫瘤)中異常 激活。Stat3在癌癥進展中起多種作用。作為一種有力的轉錄調控因子，它靶向參與許多重 要細胞功能的基因，例如Bcl-Xl、c-Myc、細胞周期蛋白Dl、Vegf、MMP-2和生存素[27-32]。它也是腫瘤免疫監(jiān)視和免疫細胞募集的關鍵負調控因子[33-35]。通過反義、siRNA、顯性失活形式的Stat3和/或阻斷酪氨酸激酶，消除Stat3信 號傳遞，在體外和/或體內可以抑制某些癌細胞系或腫瘤[26，28，36，37]。但是尚未經驗 性地提供Stat3和癌干細胞功能之間的清楚關聯。研究人員也尚未發(fā)現有效的Stat3通路 抑制劑以開發(fā)針對已經發(fā)現含有癌干細胞的癌癥的潛在治療應用。如早先所說明的那樣， 最近已經證明癌干細胞(CSC)根本性地負責腫瘤發(fā)生、癌癥轉移和癌癥復發(fā)，故而在設計 靶向已知具有這些細胞的腫瘤的任何治愈性療法時，不論CSC可能占該腫瘤物質的多小比 例，都應將其考慮在內。在除癌癥以外的疾病中，已經在許多自身免疫疾病和炎性疾病中證明了多種細胞 因子如白介素6(IL6)對Stat3的過度激活[38]。最近已經揭示，Stat3通路還通過其在產 生TH17T細胞應答中的基本作用而促進病理性免疫反應[39]。另外，已經發(fā)現IL6-Stat3 通路介導的炎癥是動脈粥樣硬化、外周血管疾病、冠狀動脈疾病、高血壓、骨質疏松癥、2型 糖尿病和癡呆的共同病因。發(fā)明概述本發(fā)明部分地基于本文提供的經驗性證據，即，Stat3在廣譜癌癥中對癌干細胞 (CSC)的存活和自我更新能力均起著關鍵作用。本發(fā)明還提供數據確認了某些化合物可以 起Stat3通路抑制劑作用，并且它們在體外和體內均有效地抑制CSC。從而，本發(fā)明的第一方面提供了治療患有異常Stat3通路活性相關紊亂的受試 者的方法，該方法包括步驟(a)向受試者施用第一量的第一藥劑，以抑制至少一些異常 Stat3通路活性；和(b)向受試者施用第二量的、包含信號轉導抑制劑的第二藥劑。第一藥劑可以通過至少一種如下的作用抑制Stat3通路活性基本上抑制 Stat3蛋白的磷酸化、基本上抑制Stat3蛋白的二聚化、基本上抑制Stat3蛋白的核轉位 (translocation)、基本上抑制Stat3蛋白的DNA結合活性、和基本上抑制Stat3蛋白的轉 錄活性。在一個實施方案中，第一藥劑選自2-(1_羥乙基)_萘并[2，3_b]呋喃-4，9-二 酮、2-乙?；?7-氯-萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙?；鵢7_氟-萘并[2，3_b]呋 喃_4，9-二酮、2-乙?；敛2,3-b]呋喃_4，9-二酮、2-乙基-萘并[2，3_b]呋喃-4， 9_ 二酮、其對映異構體、非對映異構體、互變異構體、鹽或溶劑化物(下文稱作“本發(fā)明的化 合物”)。能夠通過本發(fā)明第一方面的方法治療的非癌癥紊亂包括但不限于自身免疫性疾 病、炎性疾病、炎性腸病、關節(jié)炎、哮喘、和系統性紅斑狼瘡、自身免疫性脫髓鞘疾病、阿爾茨 海默病、中風、缺血再灌注損傷和多發(fā)性硬化癥。能夠通過該方法治療的癌癥包括但不限 于乳腺癌、頭頸部癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、結直腸癌、前列腺癌、腎細胞癌、黑素瘤、肝細 胞癌、宮頸癌、肉瘤、腦瘤、胃癌、多發(fā)性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。已知這些非癌和癌的紊亂 與異常的Stat3通路活性相關。在一個特征中，第二藥劑是靶向劑，其可為生長因子受體靶向劑、激酶靶向劑或血 管生成抑制劑。第二方面，本發(fā)明提供了治療患有異常Stat3通路活性相關癌癥的受試者的方 法，所述方法包括步驟(a)向受試者施用第一量的第一藥劑，以抑制至少一些異常Stat3
13通路活性；和(b)向受試者施用第二量的第二抗癌藥劑。有關第一藥劑的特征可類似于就本發(fā)明第一方面描述的那些特征，而第二抗癌藥 劑可為細胞毒性劑或化療劑。在一個實施方案中，第二藥劑是用于至少一種癌癥的標準一 線治療。在一個特征中，該抗癌藥劑是DNA損傷劑、抗有絲分裂劑和/或抗代謝物。例如， DNA損傷劑可為烷化劑、拓撲異構酶抑制劑或DNA嵌入劑。在一個實施方案中，第二藥劑是 卡鉬、多柔比星、吉西他濱、多烯紫衫醇(docetaxel)或依托泊苷之一。能夠通過本發(fā)明第二方面的方法治療的癌癥包括已知與異常Stat3通路活性相 關的那些，在上文已經列出，不在此重復。由于癌干細胞一般抵抗放療和傳統化療，因此靶向癌干細胞的藥物在與其他抗癌 療法組合應用時應具有協同效應。因此，根據本發(fā)明的第三方面，治療受試者癌癥的方法包 括步驟(a)向受試者施用第一量的第一抗癌藥劑，以抑制癌干細胞(CSC)群；和(b)向受 試者施用第二量的第二抗癌藥劑，以抑制多數的普通癌細胞。在多個實施方案中，該方法的步驟(a)抑制至少一種CSC自我更新，和/或殺死 至少一種CSC。在一實施方案中，第一量的第一抗癌藥劑也殺死多數的普通癌細胞。在一 實施方案中，步驟(a)抑制癌干細胞中的至少一些Stat3通路活性。第一抗癌藥劑可以與 根據本發(fā)明第一方面的方法中的第一藥劑享有相同的特征和特點，因為本發(fā)明已經提供了 Stat3通路抑制劑能夠有效抑制CSC的證據。共享的特征可以包括，例如，本文所述的第一 抗癌藥劑能夠靶向的多個Stat3通路步驟。在多個實施方案中，第一抗癌藥劑可為小分子 Stat3抑制劑、針對Stat3的RNAi藥劑、針對Stat3的反義藥劑、肽模擬物Stat3抑制劑、或 G四聯體寡脫氧核苷酸Stat3抑制劑。能夠通過該方法治療的癌癥優(yōu)選是已知或確認含有CSC的那些，包括但不限于 乳腺癌、頭頸部癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、結直腸癌、前列腺癌、黑素瘤、卡波 西肉瘤、尤文氏肉瘤、肝癌、胃癌、成神經管細胞瘤、腦瘤和白血病。根據本發(fā)明第三方面的方法中的“第二抗癌藥劑”可與根據本發(fā)明第二方面的方 法中的“第二抗癌藥劑”相同，故所有共享的特征不在此重復。在一個實施方案中，第二藥劑是用于至少一種癌癥的標準一線治療。第二藥劑可 為細胞毒性劑。在一個特征中，該抗癌藥劑為DNA損傷劑、抗有絲分裂劑和/或抗代謝物。 例如，DNA損傷劑可為烷化劑、拓撲異構酶抑制劑或DNA嵌入劑。在一個實施方案中，第二 藥劑是卡鉬、多柔比星、吉西他濱、多烯紫衫醇或依托泊苷之一。根據本發(fā)明的第四方面，提供了治療受試者癌癥的方法，包括步驟(a)向受試者 施用第一量的第一癌干細胞抑制劑，以抑制Stat3通路活性；和(b)向受試者施用第二量的 第二癌干細胞抑制劑，以抑制不同通路的活性。在一實施方案中，第二癌干細胞抑制劑是拉帕替尼(lapatinib)。在一些實施方案 中，第二量的第二抗癌藥劑本身對癌干細胞群不是治療有效的。能夠通過此方法治療的癌 癥優(yōu)選是已知或確認含有CSC的那些，上文列出了一些實例。在多個實施方案中，癌癥是轉 移性的、標準一線癌癥治療頑固性的或復發(fā)性的。根據本發(fā)明的第五方面，提供了治療受試者癌癥的方法，包括步驟(a)向受試者 施用治療有效量的第一抗癌藥劑，其選自下組化合物2-(1_羥乙基)_萘并[2，3_b]呋
14喃-4，9- 二酮、2-乙?；?7-氯-萘并[2，3-b]呋喃-4，9- 二酮、2-乙?；?7-氟-萘并 [2,3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙?；敛2，3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙基-萘并[2, 3-b] 呋喃-4，9-二酮、其可藥用鹽或溶劑化物；和(b)施用并非選自該相同組的第二抗癌藥劑。第二抗癌藥劑可為在本發(fā)明其他方面描述的任何藥劑，包括任何細胞毒性劑或化 療劑及任何靶向劑。第六方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，包含治療有效量的第一抗癌藥劑，其選自下 組化合物2-(1_羥乙基)-萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙?；?7-氯-萘并[2,3-b] 呋喃-4，9- 二酮、2-乙酰基-7-氟-萘并[2，3-b]呋喃-4，9- 二酮、2-乙?；敛2，3-b] 呋喃_4，9-二酮、2-乙基-萘并[2，3-b]呋喃_4，9-二酮、其可藥用鹽或溶劑化物；和第二 抗癌治療，其選自細胞毒性劑、靶向劑、放療劑、生物藥(biologic agent)、激素藥、HDAC 抑制劑、視黃醇類藥(retinoidagent)、檢查點激活物(checkpoint activator)、蛋白酶體 ？齊11、_齊11 (adjuvant agent)(adjunctive agent)。在一實施方案中，組合物還包含可藥用的賦形劑、載體或稀釋劑。本發(fā)明的其他方面(包括與本文所述方法相關的所有組合物和試劑盒)和實施方 案在如下發(fā)明詳述中闡釋，或將會因其變得顯而易見。附圖的簡短說明
圖1圖示了癌干細胞特異性癌癥療法和傳統癌癥療法之間的差異。圖2顯示了癌中的Stat3通路。圖3A顯示了 Stat3在Hoechst側群細胞中組成型地激活。圖3B顯示了 Stat3在CD133+細胞中組成型地激活。圖4A和4B顯示了癌干細胞中的Stat3敲低(knockdown)誘導凋亡。圖5顯示了癌干細胞中的Stat3敲低抑制癌干細胞球體形成。圖6顯示了化合物401抑制Stat3的轉錄激活活性。圖7A顯示了化合物401抑制核提取物中Stat3的DNA結合活性。圖7B顯示了化合物401、416和418抑制核提取物中Stat3的DNA結合活性。圖8A顯示了化合物401抑制異種移植腫瘤組織中Stat3的DNA結合活性。圖8B顯示了化合物401抑制異種移植腫瘤組織中Stat3的下游效應子的表達水 平。圖9A顯示了 Hoechst側群的分選和分析。圖9B顯示了 Hoechst側群對化合物401與非側群一樣敏感。
圖10A顯示了化合物401使Hoechst側群細胞凋亡。
圖10B顯示了化合物401使⑶133+細胞凋亡。
圖11顯示了化合物401阻斷⑶44high球體形成。
圖12顯示了體內化合物401處理降低異種移植腫瘤細胞的球體形成。
圖13顯示了化合物401在ISMS模型中抑制轉移。
圖14顯示了化合物401在A549人肺癌細胞中與索拉非尼(sorafenib)具有協同 效應。
圖15顯示了化合物401在A549人肺癌細胞中與厄洛替尼(erlotinib)具有協同效應。
圖16顯示了化合物401在A549人肺癌細胞中與拉帕替尼具有協同效應。
圖17顯示了化合物401在A549人肺癌細胞中與索坦(sutent)具有協同效應。
圖18顯示了化合物401在Paca-2人胰腺異種移植模型中與吉西他濱具有協同效應。發(fā)明詳述如本文所用，單數形式的“一”、“一個”和“該”包括復數引述，除非上下文另有清 楚說明。例如，術語“細胞”包括多個細胞，包括其混合物。如本文所用的術語“分離的”或“純化的”是指物質實質上或基本上不含在其天然 狀態(tài)下與其正常相伴的成分。純度和均質性一般可以利用分析化學技術來確定，例如聚丙 烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜。如本文所用，術語“癌干細胞”和“CSC”可互換。CSC是哺乳動物的，并且在優(yōu)選的 實施方案中，這些CSC是人類來源的，但它們并非旨在限于此。癌干細胞定義為、并在功能 上表征為源于實體瘤的細胞群，其(1)具有廣泛的增殖能力；2)能夠進行不對稱細胞分 裂，生成一種或多種類型具有減小的增殖或發(fā)育潛力的分化子代；和(3)能夠進行對稱細 胞分裂用于自我更新或自我維持。其他表征CSC的常見方法包括形態(tài)學和檢查細胞表面標 志、轉錄譜、和藥物反應。CSC在研究文獻中也稱作腫瘤/癌癥起始細胞、癌干細胞樣細胞、 干細胞樣癌細胞、高致瘤細胞、腫瘤干細胞、實體瘤干細胞、藥物存活細胞(DSC)、耐藥性細 胞(DRC)或超級惡性細胞。如本文所用，術語“自我更新”是指癌干細胞產生新的致瘤性癌干細胞以補充或增 加其數量的能力。如本文所用，術語"癌癥"和"癌變的"是指或者描述的是，哺乳動物中一群細 胞以失控的細胞生長為特征的生理狀況。如本文所用的“癌細胞”和“腫瘤細胞”是指源于 腫瘤的總細胞群，既包括構成腫瘤細胞群體的大部分的非腫瘤發(fā)生性細胞，又包括腫瘤發(fā) 生性干細胞(癌干細胞)。癌癥的實例包括但不限于癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚細胞瘤、 肉瘤和白血病。此類癌癥更具體的實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺 癌、肺鱗癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱 癌、肝瘤、乳腺癌、結腸癌、結直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、涎腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、 外陰癌、甲狀腺癌、肝癌和各種類型的頭頸部癌。如本文所用的“腫瘤”是指由于過度細胞生長或增值而產生的任何組織塊，或良性 (非癌變)或惡性的(癌變)，包括癌前病變。如本文所用的“轉移”(metastasis)是指癌癥由起源位點擴散或轉移到身體其他 區(qū)域、在新位置上形成類似的癌性病變的過程?！稗D移性”或“轉移”細胞是喪失與鄰近細胞 的粘附接觸、并借助血流或淋巴由疾病的原發(fā)部位遷移而浸潤鄰近身體結構的細胞。如本文所用，術語“受試者”是指任何將作為特定治療的接受者的動物(例如，哺 乳動物)，包括但不限于人、非人靈長類動物、嚙齒類動物等。一般，術語“受試者”和“患者” 就人類受試者而言在本文可互換使用。如本文所用的諸如“治療”或“緩解”等術語既指1)治愈、減緩、減輕所診斷病情 (condition)或紊亂的癥狀，和/或中斷其進展的治療性措施，又指2)防止或減緩所靶向病 情或紊亂的發(fā)展的防范性或預防性措施。因而，需要治療的包括已經患有紊亂的那些；易于患有紊亂的那些；以及欲預防紊亂的那些。如果患者顯示出如下一種或多種狀況，則該受試 者被本發(fā)明的方法成功地“治療”癌細胞數量的減小或完全不存在癌細胞；腫瘤大小的減 ??；癌細胞向周圍器官的浸潤、包括癌向軟組織和骨的擴散，的抑制或不存在；腫瘤轉移的 抑制或不存在；腫瘤生長的抑制或不存在；與具體癌癥相關的一種或多種癥狀的減輕；減 小的發(fā)病率和死亡率；和生活質量的提高。如本文所用，當用在生物活性的語境中時，術語“抑制”及其語法等同體是指生物 活性的下調，這可以減小或消除所靶向的功能，例如蛋白質的生產或分子的磷酸化。在特別 的實施方案中，抑制可以指所靶向活性的約20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90% 或95 %的減小。當用于紊亂或疾病的語境中時，該術語是指成功地防止癥狀發(fā)作、緩解癥狀 或消除疾病、病情或紊亂。如本文所用的單數或復數形式的“普通癌細胞”是指非癌干細胞的癌細胞。如本文所用的“組合”療法或治療表示施用至少兩種不同的治療，以處理紊亂、病 情或癥狀，例如癌癥病情。此類組合療法可以包括在施用一種治療之前、期間和/或之后施 用另一種治療。這些治療的施用可以在時間上分開長達數周，但最常見的是48小時之內， 且最常見的是24小時之內。如本文所用的術語"可藥用的賦形劑、載體或稀釋劑"表示可藥用的材料、組合 物或媒介物，例如參與將主題藥物活性劑由一種器官或身體部分攜帶或運輸至另一器官或 身體部分的液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料。就與制劑中的其他成分 相容且對患者無害這一意義上，各載體必須是"可接受的"。能夠作為可藥用載體的材料 的一些實例包括糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素 及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；黃芪膠粉；麥芽；明膠；滑 石；賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；油，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米 油和大豆油；甘醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如 油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；褐藻酸；無熱原水；等滲 鹽水；林格液；乙醇；磷酸鹽緩沖液；以及其他在藥學制劑中采用的無毒相容物質。潤濕劑、 乳化劑和潤滑劑(例如十二烷基硫酸鈉、硬脂酸鎂和聚環(huán)氧乙烷_聚環(huán)氧丙烷共聚物)、以 及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、矯味劑和香料劑、防腐劑和抗氧化劑也可存在于組合物 中。本發(fā)明的化合物可以形成鹽，這也落在本發(fā)明的范圍內。本文述及本發(fā)明的化合 物應理解為包括述及其鹽，除非另有說明。如本文所采用的術語“鹽”，表示與無機和/或有 機酸和堿形成的酸加成鹽和/或堿加成鹽。另外，當本發(fā)明的化合物既含有堿性部分(例 如但不限于吡啶或咪唑)、又含有酸性部分(例如但不限于羧酸)時，可以形成兩性離子 (“內鹽”)，并包括在如本文所用的術語“鹽”中。優(yōu)選可藥用的(即，無毒、生理上可接受 的)鹽，不過其他鹽也是有用的，例如用于制備期間可能采用的分離或純化步驟中。本發(fā)明 化合物的鹽可以，例如，通過使化合物I、II或III與一定量(例如等量)的酸或堿在介質 (例如鹽在其中沉淀的介質或在水性介質)中反應并之后凍干而形成。本文也考慮本發(fā)明化合物的溶劑化物。本發(fā)明化合物的溶劑化物包括例如水合 物。靶向Stat3通路
本發(fā)明提供了為Stat3通路活性有效抑制劑的化合物(實施例2)。由于Stat3通 路是經激活可以促進增殖、存活和許多其他生物學過程的潛伏轉錄因子，其牽涉到廣泛種 類的人類癌癥以及非癌癥紊亂，包括許多自身免疫病和炎性疾病(表1)。從而，本發(fā)明第 一方面提供了與異常(例如過表達的)Stat3通路活性相關的紊亂的組合治療。特別地，向 患者受試者施用第一量的第一藥劑以抑制至少一些異常的Stat3通路活性，以及還施用第 二量、包括信號轉導抑制劑的第二藥劑。在多個實施方案中，抑制一些(例如20%、30%、 40%)、大多數(約50%以上)、或基本上所有(例如60%、70%、80%、90%、95%或100%) 的異常Stat3通路活性。第一量和第二量之一或兩者可為組合應用前(即自身針對紊亂應 用時)相應藥劑的治療有效量，或者由于組合的突出協同效應而低于該量。第一藥劑可以 靶向Stat3通路中的一個或多個步驟。在一個實施方案中，第一藥劑是本發(fā)明的化合物。表1.人類疾病中STAT3通路的激活 第二藥劑，即信號轉導抑制劑，可用來靶向與第一藥劑所抑制的通路不相同的通 路、相關的通路或者相同Stat3通路中不同的步驟。通常，當組合療法中的兩類藥劑靶向相 同的通路(即使是不同的步驟)時，預期的協同作用量是有限的。然而，下文實施例5提供 的數據顯示出在本發(fā)明化合物與推測靶向相同通路中的其他步驟的第二藥劑(例如酪氨 酸激酶和GFR靶向劑)之間令人驚訝地高的協同作用量，提示意料不到的抑制機制在起作
具體地，Stat3通過由生長因子受體酪氨酸激酶、Janus激酶或Src家族激酶等介 導的關鍵酪氨酸殘基磷酸化而激活；一旦酪氨酸磷酸化，Stat3形成同源二聚體，轉位至細 胞核，結合靶基因啟動子區(qū)中的特定DNA效應元件，誘導基因表達。本發(fā)明的實施例2顯示 了在Stat3通路中，通過該DNA結合步驟，本發(fā)明化合物的抑制效應是明顯的。而且，由于 此類效應見于組成型激活的Stat3，故很可能本發(fā)明的化合物抑制Stat3蛋白的二聚化和/ 或核轉位。因此，當其與也靶向相同Stat3通路的酪氨酸激酶(TKI)和GFR靶向劑組合時， 觀察到的協同作用量令人驚訝地高。例如，當化合物401與TKI索拉非尼組合時，實現了來 自胰腺癌細胞系的細胞100%的抑制，而當化合物401和索拉非尼單獨施用時，兩者均僅能 分別實現相同細胞系66%的抑制——已知胰腺癌牽涉到Stat3的過表達[44]。事實上，所 有四種與化合物401組合檢驗的TKI均顯示出顯著的協同作用。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案 中，組合治療實現癌細胞超過約50%、或70%、或90%的抑制。根據本發(fā)明第一方面的方法可應用于治療癌癥或非癌癥紊亂，優(yōu)選已知與異常 Stat3通路活性相關的那些。與異常Stat3通路活性相關的非癌癥紊亂的實例包括但不 限于自身免疫性疾病、炎性疾病、炎性腸病、關節(jié)炎、哮喘、和系統性紅斑狼瘡、自身免疫性 脫髓鞘病、阿爾茨海默病、中風、缺血再灌注損傷和多發(fā)性硬化癥。與異常Stat3通路活性 相關的癌癥的實例包括但不限于乳腺癌、頭頸部癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、結直腸癌、前列 腺癌、腎細胞癌、黑素瘤、肝細胞癌、宮頸癌、肉瘤、腦瘤、胃癌、多發(fā)性骨髓瘤、白血病和淋巴 瘤。根據本發(fā)明第一方面的第二藥劑可為靶向劑，例如生長因子受體靶向劑(見實施 例5中厄洛替尼(特羅凱)的數據)、激酶靶向劑(見實施例5中拉帕替尼、厄洛替尼、舒尼 替尼和索拉非尼的數據)或血管生成抑制劑(見實施例5中舒尼替尼和索拉非尼的數據)。在一個實施方案中，第二藥劑是生長因子受體靶向劑，例如靶向與激酶相關的生 長因子受體[例如，表皮生長因子受體(EGFR)或血管內皮生長因子受體(VEGFR)]的抗體。 例如，靶向劑可為吉非替尼(艾瑞沙)厄洛替尼(特羅凱)、PD153035、西要昔單抗(愛必 要)、阿瓦斯丁、帕尼單抗、曲妥珠單抗和抗c-Met抗體。在一個實施方案中，第二藥劑是激酶靶向劑，其可為激酶抑制劑，例如酪氨酸 激酶抑制劑(TKI)。例如，TKI可為厄洛替尼(erlotinib)(特羅凱(Tarceva))、索坦 (Sutent)(舒尼替尼(sunitinib))、拉帕替尼(lapatinib)、索拉非尼(sorafenib)(多吉美 (nexavar))、凡德他尼(vandetanib)、阿西替尼(axitinib)、伯舒替尼(bosutinib)、西地 尼布(cedivanib)、達沙替尼(dasatinib)(撲瑞賽(sprycel))、吉非替尼(gefitinib)(艾 瑞沙(irressa))、伊馬替尼(imatinib)(格列衛(wèi)(gleevac))、來他替尼(lestaurtinib)、和 / 或 ARQ197。在多個實施方案中，激酶靶向劑為如下之一吉非替尼(艾瑞沙)、 ZD6474 (AZD6474)、EMD-72000 (馬妥珠單抗(matuzumab))、帕尼單抗(panitumab) (ABX-EGF)、ICR-62、CI-1033 (PD183805)、拉帕替尼(lapatinib)(泰克泊(tykerb))、 AEE788 (吡咯并嘧啶)、EKB-569、EXEL7647/EXEL 0999、厄洛替尼(特羅凱)、伊馬替 尼(格列衛(wèi))、索拉非尼(多吉美)、舒尼替尼(索坦)、達沙替尼(撲瑞賽)、凡德他 尼(ZACTIMA)、temsirolimus (歟瑞塞爾(torisel))、PTK787 (瓦他拉尼(vatalanib))、帕唑帕尼(pazopanib)、AZD2171、依維莫司(everolimus)、seliciclib、AMG706、阿西 替尼、PD0325901、PKC-412、CEP701、XL880、伯舒替尼、BIBF1120、BIBF1120、尼羅替尼 (nilotinib)、AZD6244、HKI-272、MS-275、BI2536、GX15-070、AZD0530、enzastaurin、 MLN-518 禾口 ARQ197。在一個實施方案中，第二藥劑是血管生成抑制劑，其可為如下之一 CM101、 IFN-a、IL-12、血小板因子-4、蘇拉明(suramin)、SU5416、血小板反應蛋白、VEGFR拮抗 劑、血管生成抑制性留醇(angiostatic steroids) —肝素、軟骨源性血管生成抑制因子、 基質金屬蛋白酶抑制劑、巴馬司他(batimastat)、馬立馬司他(marimastat)、制管張素 (angiostatin)、內皮抑素(endostatin)、2_甲氧基雌二醇、替可加蘭(tecogalan)、血小板 反應蛋白、a 3抑制劑、利諾胺(linomide)和ADH-1。在相關的第二方面，本發(fā)明提供了治療異常Stat3通路活性相關癌癥受試者的方 法，所述方法包括步驟(a)向受試者施用第一量的第一藥劑，以抑制至少一些異常Stat3 通路活性；和(b)向受試者施用第二量的第二抗癌藥劑?？捎么朔椒ㄖ委煹陌┌Y包括已知 與異常通路活性相關(例如至少部分地由之引起)的那些，在上文就本發(fā)明第一方面提供 了其列表。有關第一藥劑的特征可類似于就本發(fā)明第一方面所描述的那些，而第二抗癌藥劑 可為細胞毒性劑或化療劑。在一個實施方案中，第二藥劑是用于至少一種癌癥的標準一線 治療。在該方法中使用的第一藥劑和第二藥劑的量可為組合應用前相應藥劑的治療有效量 或者低于該量。在一個特征中，抗癌藥劑是DNA損傷劑、抗有絲分裂劑、和/或抗代謝物。DNA損傷 劑可為烷化劑、拓撲異構酶抑制劑、和/或DNA嵌入劑。如實施例5所示，將本發(fā)明的化合 物401分別與如下每一種一起添加到Paca2胰腺癌細胞中卡鉬(DNA烷化劑)、依托泊苷 (拓撲異構酶II抑制劑)、多柔比星(DNA嵌入劑)、多烯紫杉醇(抗有絲分裂劑)和健擇 (Gemzar)/吉西他濱(抗代謝物)。每種組合中都發(fā)現了顯著的協同作用量。例如，當化合 物401與健擇/吉西他濱組合時，實現了胰腺癌細胞96%的抑制，而當單獨施用時，化合物 401和健擇僅能分別實現相同細胞系66%和36%的抑制。烷化劑可為如下之一苯丁酸氮芥(chlorambucil)、環(huán)磷酰胺 (cyclophosphamide)、異環(huán)磷酉先胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、美法倉 (melphalan) > ^Bf PgM(uracil mustard) > ^(thiotepa) > S $ (busulfan) > 卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、鏈佐星(str印tozocin)、卡鉬 (carboplatin)、順鉬(cisplatin)、沙鉬(satraplatin)、奧沙禾lj 鉬(oxaliplatin)、 六甲蜜胺(altretamine)、ET-743、XL119 (becatecarin)、達卡巴嗪(dacarbazine)、 氮芥(chlormethine)、苯達莫司汀(bendamustine)、曲憐胺(trofosfamide)、烏 拉莫司汀(uramustine)、福莫司汀(fotemustine)、尼莫司汀(nimustine)、撥尼 莫司汀(prednimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、司莫司汀(semustine)、奈 ；ii 白(nedaplatin)、triplatintetranitrate> 1=t" M yHi (mannosulfan)、曲胃 ff 凡(treosulfan)、替莫唑胺(temozolomide)、卡波醌(carboquone)、三亞胺醌 (triaziquone)、三亞乙基蜜胺(triethylenemelamine)、禾口丙卡巴餅(and procarbazin)。拓撲異構酶抑制劑可為如下之一多柔比星(doxorubicin，doxil)、柔紅M M (daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依達比星(idarubicin)、二尹圣惠二 酮(anthracenedione,諾宵林(novantrone))、米托蒽酉昆(mitoxantrone)、絲裂霉素 C (mitomycin C)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素 D (dactinomycin)、plicatomycin、 伊立替康(irinotecan)(開普拓(camptosar))、喜豐對喊(camptothecin)、魯比替康 (rubitecan)、貝洛替康(belotecan)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)和拓 撲替康(topotecan)(禾口美新(hycamptin))。DNA嵌入劑可為原黃素(proflavine)、多柔比星(阿霉素(adriamycin))、柔紅霉 素、放線菌素D和沙立度胺(thalidomide)?？褂薪z分裂劑可為如下之一紫杉醇(paclitaxel，abraxane)/泰素(taxol)、 多烯紫杉醇(docetaxel)(泰索帝(taxotere))、BMS-275183、聚谷氨酸紫杉醇(xyotax), tocosal、異長春堿(vinorlebine)、長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、長春 地辛(vindesine)、長春利定(vinzolidine)、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷(teniposide) (VM-26)、伊沙匹隆(ixab印ilone)、larotaxel、ortataxel、tesetaxel 和伊斯平斯 (ispinesib)?？勾x物可為如下之一氟脲嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤、希羅 達(xeloda)、阿侖恩(arranon)、亞葉酸(leucovorin)、羥基脲、硫鳥嘌呤(6-TG)、巰嘌 呤(6-MP)、阿糖胞苷、噴司他丁(pentostatin)、磷酸氟達拉濱、克拉屈濱(cladribine) (2-CDA)、天冬酰胺酶(asparaginase)、吉西他濱、培美曲塞(pemetrexed)、硼替佐 米(bortezomib)、氨基喋呤(aminopterin)、雷替曲塞(raltitrexed)、氯法拉濱 (clofarabine)、依諾他濱(enocitabine)、sapacitabine 禾口阿扎胞苷(azacitidine)。在一個實施方案中，第二抗癌藥劑是如下之一卡鉬、多柔比星、吉西他濱、多烯紫 衫醇和依托泊苷。由于此方法抑制Stat3通路，本文證明該通路對于CSC的自我更新和存 活均至關重要(見實施例1中的數據)，且已經發(fā)現CSC根本性地負責藥物耐藥性、腫瘤復 發(fā)和轉移，所以在優(yōu)選的實施方案中，此方法用來治療或預防頑固性癌癥、復發(fā)性癌癥、和/ 或轉移性癌癥?？拱┗熀蜕锆煼ǖ母嘤懻撘约斑m宜治療方案的實例可見于諸如Cancer Chemotherapy and Biotherapy :Principles and Practice，第三片反(2001)，Chabner 禾口 Longo 編輯，以及 Handbook of Cancer Chemotherapy，第六版(2003)，Skeet 編輯(兩者 均來自 Lippincott ffilliams&ffilkins, Philadelphia, Pa.，U.S.A.)的書籍；而且抗癌 治療，尤其是化療的方案可見于諸如美國癌癥研究所(National Cancer Institute, www. cancer, gov)、美國臨床月中瘤學會(American Society for Clinical Oncology,www, asco. org)禾口美國綜合癌癥網(National Comprehensive Cancer Network, www, nccn. org)維護 的那些網站。靶向癌干細胞本發(fā)明還提供了本發(fā)明的化合物抑制CSC的自我更新并使CSC凋亡的體外和體內 數據(實施例3)。此外，本發(fā)明經驗性地確認了本發(fā)明化合物對轉移性癌癥的功效(實施 例4)。癌癥療法(抗癌療法)的目的在于防止癌細胞增殖、浸潤、轉移及最終殺死其宿主 生物體，例如人或其他哺乳動物。由于細胞增殖是許多正常細胞以及癌細胞的特征，大多數
22既有的抗癌療法對正常細胞也具有毒性作用，特別是對具有快速周轉率的那些正常細胞， 例如骨髓和粘膜細胞。因此，有效的癌癥療法需要對癌細胞具有顯著的生長抑制或控制作 用，同時對宿主的正常細胞施加最小的毒性作用。自從20世紀40年代第一代有效的抗癌化合物進入臨床試驗以來，癌癥復發(fā)和藥 物耐藥性依然是癌癥治療中一些最大的問題。往往是能夠獲得癥狀的消退，但反應屢屢為 部分性的，且僅有很短的持續(xù)時間，而且復發(fā)的癌癥傾向于對原來的藥物具有耐藥性?，F在 這可通過癌干細胞(CSC)的存在來解釋。如上文所述，全部腫瘤物質中的這一小群細胞能 夠躲避對其余癌細胞有效的藥物和放療，這是因為CSC大概與正常體干細胞享有相同類型 的生物機制，這些細胞對大多數(如果不是所有的話)化療劑具有天然的耐藥性。作為癌 物質中腫瘤發(fā)生活性的真正根源，CSC能夠重新支持癌癥的再生，或者如果不予治療的話導 致轉移。由于初始治療僅留下藥物耐藥性癌干細胞，整個再生的或轉移的腫瘤變得對初始 “有效”療法具有耐受性的幾率顯著增加。目前，抗癌療法由于若干原因而組合應用。其一，用兩種或更多種無交叉抵抗性的 療法治療可以防止腫瘤中抗性克隆的形成。對一種抗癌藥物(例如鉬抗癌化合物，如順鉬) 的耐藥性往往伴隨著對同類其他藥物(例如其他鉬化合物)的交叉耐藥性。而且，還存在 著多藥耐藥性，也稱為多效耐藥性，即用一種藥物治療不僅賦予對該藥物及對其類別的其 他藥物的耐藥性，而且還賦予對無關藥劑的耐藥性。其二，對處于不同生長期的細胞具有活 性的兩種或更多種療法的組合可以殺死緩慢分裂的細胞以及活躍分裂的細胞，和/或募集 細胞進入更為活躍的分裂狀態(tài)，使它們對多種抗癌療法更加敏感。其三，組合治療可以通過 影響不同的通路或單一生化通路中的不同步驟來創(chuàng)建生化增強效應。這些組合抗癌治療的基本理論沒有考慮到近來在確認和表征癌干細胞方面獲得 的進展。未能在組合療法中并入CSC特異性療法能夠解釋為何目前的組合療法不能治愈常 見癌癥如轉移性結腸癌和前列腺癌。鑒于本文提供的數據確認了本發(fā)明化合物針對CSC的 功效(實施例3)，本發(fā)明能夠設計組合CSC靶向劑和靶向普通癌細胞的其他藥劑的癌癥治 療方法。而且，雖然不希望束縛于特定的理論，本發(fā)明提供了藥物方案取代如下情形，在該 情形中當原始的CSC由于僅靶向CSC的單一藥物療法而被耗竭時，一些未被治療或未充分 治療的普通癌細胞會回復成或產生csc(目前這得到一些初步數據的支持)。由于癌干細胞一般抵抗放療和傳統化療，因此靶向癌干細胞的藥物在與其他抗癌 療法組合應用時應具有協同效應。因此，本發(fā)明提供了治療受試者癌癥的方法，其包括步 驟(a)向受試者施用第一量的第一抗癌藥劑，以抑制癌干細胞群；和(b)向受試者施用第 二量的第二抗癌藥劑，以抑制多數的普通癌細胞。在多個實施方案中，抑制一些(例如20%、30%、40%)、大多數(約50%以上)、或 基本上所有(例如60%、70%、80%、90%、95%或100%)的CSC。，第一量和第二量之一或 兩者可為相應藥劑在組合應用前(即自身針對癌癥應用時)的治療有效量，或者由于組合 的突出協同效應而低于該量。在一個實施方案中，第一藥劑是本發(fā)明的化合物，即，2-(1_羥 乙基)_萘并[2,3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙?；?7-氯-萘并[2,3-b]呋喃_4，9_ 二酮、 2-乙?；?7-氟-萘并[2,3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙?；敛2,3-b]呋喃_4，9-二酮、 2-乙基-萘并[2，3-b]呋喃_4，9-二酮、及其可藥用鹽或溶劑化物。此處的“第二抗癌藥劑”可為上述方法中相同的“第二抗癌藥劑”，故所有共享的特
23征不在此重復。在一個特征中，第二抗癌藥劑為DNA損傷劑、抗有絲分裂劑和/或抗代謝物。 例如，DNA損傷劑可為烷化劑、拓撲異構酶抑制劑或DNA嵌入劑。適宜的烷化劑、拓撲異構 酶抑制劑、DNA嵌入劑、抗有絲分裂劑和抗代謝物在上文列出，故不在此重復。在癌抑制實 驗中在本發(fā)明化合物與每一種上述類別的化療劑組合應用的情況下觀察到顯著的協同作 用(見實施例5)。在一個實施方案中，第二藥劑是卡鉬、多柔比星、吉西他濱、多烯紫衫醇和 依托泊苷之一。在另一特征中，第二抗癌藥劑是靶向劑，例如生長因子受體靶向劑(見實施例5中 厄洛替尼(特羅凱)的數據)、激酶靶向劑(見實施例5中拉帕替尼、厄洛替尼、舒尼替尼和 索拉非尼的數據)或血管生成抑制劑(見實施例5中舒尼替尼和索拉非尼的數據)。在癌 抑制實驗中在本發(fā)明化合物與每一種上述類別的靶向劑組合應用的情況下觀察到顯著的 協同作用。適宜的生長因子受體靶向劑、激酶靶向劑(尤其是TKI)、以及血管生成抑制劑在 上文列出，故不在此重復。由于此方法采用特異性地靶向腫瘤中的CSC細胞(其根本性地負責藥物耐藥性、 腫瘤復發(fā)和轉移)的治療劑，所以在優(yōu)選的實施方案中，此方法用來治療或預防頑固性癌 癥、復發(fā)性癌癥、和/或轉移性癌癥。在以組合治療靶向CSC方面，一個策略應當旨在靶向牽涉CSC關鍵生物學功能 (如自我更新和存活)的一個以上通路。為此，本發(fā)明提供了治療受試者癌癥的方法，包括 步驟(a)向受試者施用第一量的第一癌干細胞抑制劑，以抑制Stat3通路活性；和(b)向 受試者施用第二量的第二癌干細胞抑制劑，以抑制不同通路的活性。在一實施方案中，此方 法中第一和/或第二抗癌藥劑的量就其自身對癌干細胞群并非治療有效的——但是由于通 過該組合實現的顯著協同作用，較低的量能夠在此方法中應用以引發(fā)患者的反應。在一個實施方案中，第二抗癌干細胞劑是拉帕替尼(INN)或二甲苯磺酸拉帕替尼 (USAN)——其被FDA于2007年批準用于患有晚期轉移性乳腺癌的患者。拉帕替尼是ATP 競爭性表皮生長因子受體(EGFR)和HER2/neu(ErbB-2)雙重酪氨酸激酶抑制劑。其通過與 EGFR/HER2蛋白激酶結構域的ATP結合口袋結合而抑制受體的自磷酸化和激活。下文實施 例5呈現的數據顯示，針對Paca2胰腺癌細胞實現了顯著的協同作用組合前，化合物401 和拉帕替尼的抑制率分別為32%和27%，而組合后的抑制率暴漲至74%，高于兩抑制率之 和。由于此方法額外關注CSC(其根本性地負責藥物耐藥性、腫瘤復發(fā)和轉移)，所以在優(yōu)選 的實施方案中，此方法用來治療或預防頑固性癌癥、復發(fā)性癌癥、和/或轉移性癌癥。本發(fā)明的制劑包括適于口服、經鼻、局部(包括口腔和舌下)、直腸、陰道和/或腸 胃外施用的那些。制劑可以便利地以單位劑型的形式提供，并且可以通過任何藥學領域公 知的方法制備?？膳c載體材料混合以生產單劑型的活性成分量將根據待治療的哺乳動物和 具體的施用方式而變。可與載體材料混合以生產單劑型的活性成分量一般是產生治療效果 的化合物量。一般而言，在100%中，該量的范圍是例如約至約99%活性成分、約5%至 約70%、約10%至約30%。材料和方法生物學測定法本發(fā)明的化合物可根據上文所述的方案進行檢查。表2顯示了在該方案中描述的 化合物的列表。
表2 細胞培養(yǎng)HeLa、DU145、H1299、DLD1、SW480、A549、MCF7、LN18、HCT116、H印G2、 Paca2、Panel、LNcap、FaDu、HT29 和 PC3 細胞(ATCC, Manassas, VA)在補充有 10%胎牛血 清(FBS) (Gemini Bio-Products,West Sacramento,CA)和 5%青霉素 / 鏈霉素 / 兩性霉素 B(Invitrogen)的 Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA)中維持。Hoechst側群為鑒定和分離側群(SP)和非SP級分，用胰蛋白酶和EDTA自培養(yǎng)皿 中取出SW480細胞，離心沉淀，以磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌，并重懸于37°C含2% FBS和ImM HEPES 的 Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM)中。然后用 Hoechst 33342 (Invitrogen)以 5 u g/mL的濃度標記細胞。標記的細胞單獨或與50 y M戊脈安(verapamil，Sigma-Aldrich， St. Louis) 一起于37°C孵育120分鐘。染色后，使細胞懸浮于含2 % FBS和ImM HEPES 的Hanks平衡鹽溶液(HBSS ； Invitrogen)中，流經40 y m濾網，并維持在4 °C直至進行流 式細胞術分析。Hoechst染料在350nm激發(fā)，并利用450DF10 (450/20nm帶通濾光片)和 675LP(675nm長波通截止濾光片)光學濾光片在兩個波長測量其熒光。正向和側向散射光 設門并不嚴格，僅排除碎片[15]。以表面標志進行CSC分離通過主要基于表面標志(例如⑶44或⑶133)的 差異表達來分選腫瘤細胞，已經產生了大多數迄今描述的高致瘤性CSC。CD133基于稍 加修改的Ricci-Vitiani等人的方法[21]分離。⑶133+細胞通過熒光激活細胞分選 (FACS)或基于磁納米顆粒的分離法進行分離。簡言之，對于基于FACS的細胞分選，以 CD133/1 (aci33)-pe標記io7細胞/mL ；或對于基于磁場的分離，利用EasySep ,生物素 選擇試劑盒(MiltenyiBiotec)按照生產商的建議以CD133/1 (AC133)-生物素(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)標記107細胞/mL。非特異性標記用提供的FcR阻斷試劑來阻斷，而抗體 孵育(1 11)在冰上于具有2% FBS和ImM EDTA的PBS中進行15分鐘。對于EasySep 分離進行5次洗滌，而在FACS分選前細胞在400 X g沉淀5分鐘，并重懸至2 X 107mL。⑶44high細胞根據稍加修改的Ponti等人所述的方法[81]通過FACS分離。簡言 之，經胰蛋白酶消化和37°C生長培養(yǎng)基中30分鐘的細胞恢復之后，細胞在400Xg沉淀，并 于具有2%FBS和ImM EDTA的PBS中重懸至1X106細胞/mL。細胞隨之在冰上與1 100 稀釋的 CD44-FITC(BD Biosicences, SanDiego, CA)孵育 15 分鐘?；蛘?，利用 CD24-PE(BDBioscences，San Diego, CA) (1 100)進行負選擇。洗滌3次之后，細胞重懸至2 X 106/mL， 并流經40 y m濾網，之后進行分選。球體測定試驗一種測量細胞群自我更新能力的可靠方法是在不存在血清或貼壁 的情況下被培養(yǎng)為球體的能力。CD44high FaDu或Hoechst側群癌干細胞在超低附著板中于 癌干細胞培養(yǎng)基(DMEM/F12，B27Neurobasal 增補物，20ng/ml EGF, 10ng/ml FGF, 4 u g/ml 胰 島素和0.4%BSA)中培養(yǎng)以允許球體形成。一般，10-14天培養(yǎng)后通過顯微鏡檢評估球體 形成，并記錄具有> 50個細胞的球體。螢光素酶報告試驗HeLa細胞用Stat3_螢光素酶(Stat3-Luc)報告載體 (Panomics, Fremont, CA)禾口海腎螢光素酶(Promega, Madison, WI)通過 Lipofectamine 2000如生產商(Invitrogen)所述進行共轉染。轉染之后，細胞在含0. 5% FBS的培養(yǎng)基中 維持24小時。細胞隨之用所示的化合物處理30分鐘，之后向培養(yǎng)基中添加25ng/ml制瘤素 M(0SM) (R&D Systems，Minneapolis，MN)。繼 0SM 添加后 6 小時，收獲細胞，并利用 Dual-Glo 螢光素酶測定系統如生產商(Promega)所述測量螢火蟲和海腎螢光素酶的水平。凋亡分析用或未用化合物處理的細胞在處理后5小時收獲，進行膜聯蛋白-V染 色。收集的細胞以PBS洗滌，重懸于含膜聯蛋白-V-FITC的緩沖液中，并按照生產商(Roche) 的說明染色。膜聯蛋白-v陽性細胞通過流式細胞術確定。STAT3DNA 結合測定試驗如生產商(Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE)所述進 行電泳遷移率變動分析(EMSA)。簡言之，利用NucBuster蛋白質提取試劑盒如生產商(EMD Biosciences, San Diego，CA)所述由HeLa細胞制備核提取物。5iig核提取物與所示劑 量的所示化合物一起預孵育30分鐘，之后再與IR700標記的共有Stat3寡核苷酸一起孵 育15分鐘。樣品隨之在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并應用Odyssey紅外成像系統(Li-Cor Biosciences)直接掃描。對于酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，5 y g核提取物與所示濃度的所 示化合物預孵育30分鐘，之后添加生物素化的寡聚體(5’-生物素-GATCCTTCTGGGAATTCCTA GATC-3'SEQ ID NO. 1)。Stat3_DNA復合物隨之被捕獲到鏈親和素包被的96孔板(Pierce， Rockford, IL)上。結合的復合物隨之與Stat3多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz，CA)、接著是抗兔HRP綴合的二抗(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)進行孵育。 結合的抗體隨之通過添加TMB底物(Pierce)并在450nm測量吸光值而觀察。細胞生存力確定對于3-(4，5_ 二甲基噻唑-2-基)-2，5_ 二苯基四唑鐺(MTT) (Sigma-Aldrich, St. Louis, M0)分析，細胞以10，000細胞/孔接種在96孔板中。種板后 24小時，以所示劑量向細胞中添加化合物?；衔锾砑雍?2小時，向各孔添加MTT(0. 5mg/ ml終濃度)，并使板在37°C再孵育2小時。然后吸出培養(yǎng)基，并使甲臜產物溶解在100 u 1 異丙醇中。各孔的吸光值利用微板讀數器在570nm測量。免疫熒光用所示化合物處理所示時間的細胞在4%甲醛或冷甲醇中固定，分別 用于檢測膜聯蛋白V、裂解的胱天蛋白酶3(cleaVed caspase 3)或stat3。蓋片風干，在 PBS中室溫重新水合10分鐘。樣品之后在封閉緩沖液(PBS，5%FBS)中在潮濕箱中室溫孵 育10分鐘。細胞與一抗在4°C孵育過夜。洗滌后，細胞與1 500稀釋的FITC綴合的抗兔 抗體室溫孵育1小時。用配備有落射熒光和SPOT鑲嵌(XD相機的Nikon TE200顯微鏡捕 獲圖像。多克隆抗裂解的胱天蛋白酶3抗體(1 100)獲自Cell Signaling Technology, Danvers, MA.公司。膜聯蛋白-V-FITC獲自德國Penzberg的羅氏(Roche)公司。多克隆抗Stat3抗體獲自Santa Cruz公司。通過.TPIV 技術敲低基因TPIV (治療通路鑒定和驗證)技術 (BostonBiomedical Inc. ,Norwood,MA,USA)提供了能夠用來首先轉染細菌、進而被哺乳動 物受試者攝取的質粒。在細菌裂解后，由TPFV 質粒編碼并由細菌加工的dsRNA被釋放到 哺乳動物細胞的細胞質中，實現所靶向基因的敲低。TPIV 技術在共同擁有的于2008年 6月30日遞交的PCT專利申請PCT/US08/68866中描述，其全部內容并入本文作為參考。具 體而言，編碼針對Stat3的有效siRNA序列的TPIV 質粒利用如下引物通過PCR克隆購自 Origene Technologies (Rockville, MD, USA)的 Stat3 質粒來構建TPIV_Stat3 (300bp 插 入物)引物Stat3TPIV For 5，-GGATCTAGAATCAGCTACAGCAGC(SEQ ID NO. 2)Stat3TPIV Rev 5，-TCCTCTAGAGGGCAATCTCCATTG(SEQ ID NO. 3)對照質粒應用購自Promega(Madison，WI, USA)的pGL2質粒來構建。 TPIV-GL2 (300bp 插入物)引物GL2TPIV For 5，-CCCTCTAGATGGTTCCTGGAAC(SEQ ID NO. 4)GL2TPIV Rev 5，-GCTCTAGAAACCCCTTTTTGG(SEQ ID NO. 5)化學感受態(tài)大腸桿菌(E. Coli)BL21(DE3)pLYSe細菌(50 100 yl)用對照或 lOOng靶向Stat3的TPIV 質粒按照生產商(Stratagene)的說明進行轉化。然后將單菌 落接種到含100 u g/ml氨芐青霉素的BHI培養(yǎng)基中，并于37°C生長過夜。第二天，將5ml各 過夜培養(yǎng)物1 40稀釋至含100 y g/ml氨芐青霉素的新鮮BHI培養(yǎng)基中，并再生長2-4小 時(直至0D_ = 0. 5)。各培養(yǎng)物隨之用IPTG(lmM終濃度)處理2-4小時，以誘導長雙鏈 RNA轉錄，其會被細菌加工為混合siRNA。在IPTG誘導之后，通過測量0D6(1(1值來計算各培養(yǎng) 物中的細菌總數(8 X108細菌/ml培養(yǎng)物具有0D_= 1)。然后根據細胞匯合度和在適當反 應體積中所需的感染復數(M0I ；嘗試20 1至2000 1的細菌比細胞范圍)，計算用于細 胞處理的細菌數目。根據經驗，應選擇反應體積以導致對于1000 1M0I為3X108/ml。所 需體積的細菌培養(yǎng)物隨之在2500g 4°C離心10分鐘，沉淀用無血清培養(yǎng)基(用于細菌感染 的細胞，加上100 ii g/ml氨芐青霉素和ImM IPTG)洗滌一次，并以細菌感染(bactofection) 所需的密度重懸于相同的培養(yǎng)基中。同時分離癌細胞或癌干細胞，在細菌感染前30分鐘，將細胞培養(yǎng)基替換為2ml含 100 y g/ml氨芐青霉素和ImM IPTG的新鮮無血清培養(yǎng)基。上文制備的細菌隨之以期望的 M0I添加到細胞中，37°C感染2小時。感染期過后，細胞用無血清細胞培養(yǎng)基洗滌3次。細胞隨之與2ml含有100 u g/ml 氨芐青霉素和150 y g/ml慶大霉素的新鮮完全細胞培養(yǎng)基孵育2小時，以殺死任何殘留的 胞外細菌。在氨芐青霉素和慶大霉素處理后，細胞與3ml含10 y g/ml氧氟沙星的新鮮完全 RPMI 1640培養(yǎng)基孵育，以殺死任何胞內細菌。隨之收獲細胞或在各時間點進行分析，以評 估靶基因沉默的程度和產生的表型。活體評價(in life evaluations)還對每只動物的健康狀態(tài)進行了每日檢查。每
27三天檢查體重。按照機構的動物管理方法每日供應食物和水。引起>20%致死率和/或> 20%凈體重損失的處理視為有毒性。結果表達為平均腫瘤體積(mm3) 士SE。P值< 0. 05視 為統計學相關。動物管理4_5周齡的雄性或雌性無胸腺裸鼠(Charles RiverLaboratories, Wilmington,MA.)在研究開始前適應動物畜舍設施至少一周。所利用的所有實驗方法與美 國生理學會(American Physiology Society)所給出的指南以及實驗動物護理和使用指南 (Guide for the Care and Useof Laboratory Animals)相符，并且也得到了波士頓生物醫(yī) 學公司(BostonBiomedical Inc.)研究所動物護理和使用委員會(Institutional Animal Careand Use Committee)的批準。動物4只一組關進木屑鋪底的籠中，置于具有控制的溫 度(68° F-72° F)、光照(12小時光-暗周期)和濕度(45-55%)的房間。實驗期間動物 自由飲水攝食。脾內裸鼠模型系統(ISMS模型)雌性裸鼠麻醉并置于無菌條件，在左側腹切割以 露出脾臟。利用27號針在脾被膜下注射0. lml PBS中的100萬人結腸癌HT29細胞。將脾 重置于腹膜腔內，并閉合切口。移植后第二天開始處理直至檢查當天。處理策略為每周5 天一天一次(5qd/wk)的腹膜內注射。小鼠在垂死時或注射后30天處死。取出脾和肝進行 檢查，并記錄腫瘤病變數。實施例1鑒定Stat3作為抗癌干細胞靶標在CSC中Stat3的敲低可以誘導凋亡。為確定癌干細胞是否表達Stat3，以及 Stat3是否組成型激活，我們進行了免疫熒光顯微鏡檢，這不僅允許分析罕見細胞群，而且 還提供了有關蛋白質定位的額外信息，以及能夠將染色與表型(即凋亡)相關聯。在通過 FACS自SW480結腸癌細胞分離的NSP和SP細胞中對p_Stat3和Stat3進行了免疫熒光檢 測后，我們確定了 Stat3確實存在于SP細胞中，且在細胞核中適度富集(圖3A)。另外，我 們還在SP細胞中觀察到比NSP細胞增加的p-Stat3染色，提示SP細胞的存活可能更大比 重地依賴于Stat3。還評價了自FaDu人頭頸部癌細胞和LN18人成膠質細胞瘤細胞分離的⑶133+細 胞中的Stat3狀態(tài)。如圖3B所示，Stat3在這些細胞中也具有組成型活性。綜上所述，這 些數據提示Stat3是對于癌干細胞特別重要的靶標。我們接下來利用TPIV 檢驗了在CSC中Stat3敲低的效應。免疫熒光分析揭 示，在新鮮分離的CSC(SP)上感染24小時之內(圖4A)能夠實現Stat3的顯著耗竭，并發(fā) 現用靶向Stat3的TPIV ,質粒處理的大多數細胞在感染24小時之內經歷凋亡，而對照 TPIV 質粒并不誘導高于對照未感染細胞的凋亡水平(圖4B)。這些數據i正明癌干細胞 依賴于Stat3用于存活。在CSC中敲低Stat3抑制CSC球體形成。通過FACS分離QM^gh/a^f FaDu或 Hoeschst側群癌干細胞，并在超低附著板中于癌干細胞培養(yǎng)基(DMEM/F12，B27Neurobasal 增補物，20ng/mL EGF, 10ng/mL FGF，4 y g/mL胰島素和0. 4% BSA)中培養(yǎng)以允許球體形成。 收集初級球體(primary spheres)，用胰蛋白酶解聚，并在TPIV 處理之前分配至96孔超 低附著板中。以1000的M0I施加細菌兩小時，之后添加抗生素混合物(青-鏈霉素混合物 (penstr印)、慶大霉素、氧氟沙星)。10-14天培養(yǎng)后評估球體形成。在添加臺盼藍鑒定死
28細胞之前(圖5，左上圖)或之后(圖5，左下圖)獲取代表性的球體圖像。相對球體形成 示于圖5的右圖。數據清楚地表明，在癌干細胞中Stat3敲低抑制球體形成，證明Stat3是 癌干細胞的關鍵自我更新因子。實施例2鑒定抑制Stat3通路活件的化合物Stat3轉錄活性的抑制。利用Stat3_螢光素酶(Stat3-luc)報告分子構建體檢 驗了化合物在細胞中抑制Stat3轉錄激活活性的能力。轉染了 Stat3-luC的細胞在減少 血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，之后再添加所示的化合物孵育30分鐘。細胞隨之用25ng/ml制瘤 素M(OSM)刺激6小時，之后檢測Stat3-luc報告分子活性。細胞與化合物401孵育抑制了 0SM刺激的Stat3報告分子活性(圖6，左圖)。納入AG490 ( 一種已知的Jak-Stat通路抑 制劑)作為Stat3抑制的陽性對照。依托泊苷納入作為遺傳毒性活性對照，其顯示出很小 或無Stat3抑制作用?；衔?001為萘而非作為本發(fā)明化合物的萘醌，其即便是在高得多 的濃度也不抑制0SM刺激的Stat3報告分子活性(圖6，右圖)。在Stat3螢光素酶報告分子測定中檢驗了其他化合物，且結果總結于表3。表3 Stat3DNA結合活性的抑制。應用來自HeLa細胞的核提取物(如通過酪氨酸705 殘基磷酸化所檢測的那樣，其含有組成型激活的Stat3)進行Stat3EMSA以監(jiān)測Stat3DNA 結合活性。核提取物與所示化合物孵育，之后再與IR700標記的Stat3共有寡核苷酸孵育。 Stat3與寡核苷酸的結合通過凝膠電泳監(jiān)測，并利用LiCor Odyssey紅外掃描儀檢測。鑒定 到Stat3滯后條帶，并通過抗Stat3抗體的超級遷移(圖7A，左圖)和Stat3肽的劑量依賴 性抑制進行了確認(圖7A，中圖)。在孵育標記的探針和化合物401之后觀察到Stat3DNA 結合的劑量依賴性抑制(圖7A，右圖)。在EMSA測定中檢驗了其他化合物。如圖7B所示，化合物401、416和418能夠抑 制Stat3的DNA結合活性。異種移植腫瘤組織中Stat3下游效應子的抑制。從在收獲前4小時用化合物401 或載體對照處理過的異種移植Paca2腫瘤中制備提取物。樣品通過western印跡和EMSA 分析，以評價Stat3下游效應子表達水平和Stat3DNA結合活性?；衔?01處理的樣品 (T)與對照(V)相比顯示出Stat3 DNA結合活性下降(圖8A)。另外，化合物401處理導致 Stat3下游效應子細胞周期蛋白D1和生存素的表達水平下降(圖8B)。
實施例3鑒定靶向癌干細胞的化合物鑒定使癌干細胞凋亡的化合物。由于已經證明癌干細胞活躍地外排Hoechst，故用 Hoechst染色SW480細胞，分選側群(如圖9A所示，左圖圍起來的區(qū)域)以富集癌干細胞。 為確認此側群富集癌干細胞，對照組的SW480細胞首先用戊脈安(verapamil，ABC轉運蛋白 抑制劑)處理，之后用Hoechst染色。如圖9A右圖所示，戊脈安處理導致側群喪失。在MTT測定中評估了化合物401對Hoechst側群的IC5(1，并與對非側群的IC5(1進 行了比較。結果顯示，側群對化合物401與非側群一樣敏感(圖9B，右圖)。然而，側群對 多柔比星比非側群耐藥性大得多(圖9B，左圖)，這與之前的公開一致[7，82]。這些數據提 示化合物401殺死癌干細胞。Hoechst側群細胞用化合物401處理，并通過膜聯蛋白V(凋亡的早期標志)染色 來評估細胞死亡模式。結果顯示，垂死細胞為膜聯蛋白V陽性(
圖10A)，證明化合物401使 癌干細胞凋亡。可選地，我們進行了 CD133(常見的癌干細胞表面標志之一)抗體磁珠沉降以富集 癌干細胞。CD133+細胞隨之用化合物401處理，接著用抗裂解的胱天蛋白酶3 (凋亡標志) 的抗體染色。如
圖10B所示，許多CD133+細胞在化合物401處理后變成裂解型胱天蛋白酶 3陽性的，證實化合物401使癌干細胞凋亡。鑒定在體外抑制CSC球體形成的化合物。癌干細胞的標志之一是其自我更新的能 力。一種測量細胞群自我更新能力的可靠方法是其在不存在血清或附著的情況下培養(yǎng)為球 體的能力。為比較化合物401與其他靶向及化療劑的該能力，FACS分離的⑶44high CSC作 為球體培養(yǎng)72小時，之后用一組治療劑進行攻擊。所檢驗的藥劑中，只有化合物401有效 防止球體增殖(
圖11)。注意，盡管施加的多柔比星和多烯紫杉醇的量大約十倍于其在類 似測定中導致細胞死亡的IC5(1濃度，但球體還是具有耐藥性。添加的特羅凱(Tarceva)、索 坦(Sutent)和格列衛(wèi)(Gleevec)大約三倍于其報告的治療濃度。這證明雖然癌干細胞對 傳統化療劑和靶向劑具有耐藥性，但化合物401高度有效地抑制其生長。鑒定在體內抑制CSC球體形成的化合物。六周齡雌性無胸腺nu/nu小鼠獲自 Charles River Labs (Wilmington，MA)。小鼠在腰窩處皮下注射處于0. 2mL無血清DMEM中 的6X 106FaDu或Paca2癌細胞。在異種移植物大小達到 200mm3后，攜帶Paca2異種移植 腫瘤的動物通過腹膜內施用載體、吉西他濱(120mg/kg，一周兩次)或化合物401 (20mg/kg) 一周，而攜帶FaDu異種移植腫瘤的動物通過腹膜內每日施用載體、卡鉬(30mg/kg)或化合 物401(20mg/kg)兩周，之后處死。然后分別針對Paca2和FaDu細胞，收集腫瘤。在動物處 死并無菌取出腫瘤后制備單細胞懸液。簡言之，用無菌解剖刀將腫瘤切成0. 1mm3的碎塊， 之后在lmg/mL膠原酶/HBSS中持續(xù)震蕩消化15-30分鐘。在流經40 y m濾網后，將細胞懸 液層放在lmL Histopaque上，并在1440 X g離心30分鐘后收集界面層，而除去RBC、死細胞 和細胞碎片。然后計數活細胞，并用來測量其形成球體的能力。細胞以100細胞/孔的密 度分配到超低附著96孔板的癌干細胞培養(yǎng)基中(DMEM/F12，B27Neurobasal增補物，20ng/ mL EGF，10ng/mL FGF，4 u g/mL胰島素和0. 4% BSA)。每三天添加新鮮培養(yǎng)基，并在10-14 天培養(yǎng)后測定球體形成。記錄具有>50個細胞的球體。實驗結束時，添加臺盼藍以鑒定死 細胞。如
圖12所示，如增加的球體形成所證明的，標準化療吉西他濱(上圖)和卡鉬(下圖)富集了癌干細胞。相反地，如減少的球體形成所證明的那樣，化合物401處理減少了癌 干細胞。實施例4抗轉移功效還檢驗了化合物401在ISMS模型中抑制轉移的能力。脾內裸鼠模型系統(ISMS模 型)適于研究結直腸癌的惡性行為，因為此技術能夠在肝中產生實驗性轉移。在此模型中， 在裸鼠脾被膜下注射處于0. lml PBS中的100萬HT29細胞。將脾重置于腹膜腔內，并閉合 切口。小鼠在垂死時或注射后30天處死。取出脾和肝進行檢查，并記錄腫瘤病變數(number of tumorlesions)。小鼠分成2組，對照組給予載體(n = 4)，而另一組接受20mg/kg化合 物401(n = 4)。在Ls.注射后第2天起至第30天，5天/周腹膜內施用藥物。顯微鏡檢 估算原發(fā)性腫瘤和轉移性肝腫瘤的數目。代表性照片示于
圖13。在載體對照組中，脾臟處 有重負荷的原發(fā)性腫瘤(
圖13，上左圖)。還觀察到大量的自發(fā)肝轉移(
圖13，上右圖)。 化合物401處理顯著降低了原發(fā)性腫瘤病灶數和自發(fā)肝轉移數(
圖13，下圖)。實施例5組合活件Paca2人胰腺癌細胞、A549人肺癌細胞和IfepG2人肝癌細胞(美國典型培養(yǎng)物保 藏中心)在含有10%胎牛血清、100單位/mL青霉素、100iig/mL鏈霉素和2mM L-谷氨酰胺 的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)?；衔?01和索坦由Boston Biomedical, Inc.有 限公司合成。卡鉬、多柔比星、多烯紫杉醇、依托泊苷獲自Sigma (St. Louis，M0)，并以lOmM 溶于水或DMS0中。厄洛替尼來自American Custom Chemicals (San Diego, CA) 吉西他濱 來自Eli Lilly (Indianapolis，IN)，為水性20mM貯液的形式。索拉非尼購自LKT (St. Paul， MN)。拉帕替尼來自LC Laboratories (Woburn，MA)。除非另行指出，所有化合物以lOmM溶 于DMS0中，并等份貯存于-20°C呈指數生長的Paca2胰腺癌細胞以1，000細胞/孔接種在 6孔板中，并允許其貼壁24小時。然后向培養(yǎng)基中添加漸增濃度的個體藥物及組合藥物，再 過24小時。24小時接觸后，除去藥物，并在接下來的10-14天添加新鮮培養(yǎng)基，允許集落形 成。固定細胞，并用GIEMSA(Gibco BRL)染色。大于50個細胞的集落記錄為存活者，并針 對未處理的對照就細胞存活百分數進行標準化。結果為一式兩份實驗的平均值?？蛇x地， 在A549和H印G2細胞中在處理后72小時進行MTT測定。我們的數據證明，化合物401與所有檢驗的化合物組合時均具有有益效果。其中， 與酪氨酸激酶抑制劑(TKI)組合顯示出最出色的結果。例如，如
圖14所示，化合物401與 索拉非尼組合時在人肺A549細胞中72小時具有協同效應。與此類似，
圖15至17表明化 合物401分別與厄洛替尼、拉帕替尼和舒尼替尼(索坦組合時在人肺A549細胞中72小 時也具有協同效應。其余數據總結于表4，證明化合物401與所有檢驗藥物組合時均表現出 有益效果。表4
31 而且，我們還檢驗了化合物401與吉西他濱在人胰腺癌異種移植模型中的組合效 應。簡言之，無胸腺雌性裸鼠(Ncr)皮下接種8X106MIA PaCa_2人胰腺癌細胞，并使腫瘤生 長至約150mm3的大小。將動物隨機分成4組，每組6只動物，并用載體對照處理、每日口服 100mg/kg臨床制劑(20%GeluCire)形式的化合物401、每三天腹膜內注射120mg/kg(溶于
PBS中)吉西他濱(健擇 )、或施用后兩者。小鼠接受總計兩周的處理，并分析腫瘤的平均 體積。
如
圖18所示，用化合物401 (100mg/kg)或是吉西他濱(120mg/kg)單獨處理在處 理期間以類似的程度延遲腫瘤生長。用化合物401(100mg/kg)組合吉西他濱(120mg/kg) 處理的動物顯示出對腫瘤生長的協同效應。對于任何處理策略，未觀察到明顯的毒性。我 們的數據提示，化合物401組合吉西他濱在治療胰腺癌方面具有臨床益處。本文引述的所有參考文獻在適用法律允許的程度上整體并入本文作為參考，并在 相同的程度上用于所有目的，就如同明確單獨地說明將各單個出版物或專利或專利申請全 文并入作為參考用于所有目的一樣。在并入作為參考的出版物和專利或專利申請與本說明 書所含公開內容相悖的程度上，本說明書旨在替換和/或優(yōu)先于任何這樣的矛盾材料。在本說明書和權利要求書中所用的表達成分、反應條件、分析結果等等數量的數 字在所有情況下應理解為受術語“約”修飾。從而，除非有相反說明，本說明書和所附權利 要求書中闡述的數值參數為近似值，其可以根據本發(fā)明尋求獲得的期望性能而變。各數值 參數應按照有效數字和普通舍入方法加以解釋，但絲毫、也不應試圖限制等同原則對權利 要求范圍的適用?？蓪Ρ景l(fā)明進行修飾和改變而不偏離其精神和范圍，這對本領域技術人員是顯而 易見的。本文所述的具體實施方案僅僅是作為舉例提供，而不意味著以任何方式加以限制。 意思是說明書和實施例應視為僅僅是例示性的，而本發(fā)明的真正范圍和精神由如下權利要 求表明。參考文獻1. Bonnet,D. ,Normal and leukaemic stem cells. Br J Haematol, 2005. 130(4) p. 469-79.2. Bonnet, D.和 J.E.Dick, Human acute myeloid leukemia is organized as ahierarchy that originates from a primitiye hematopoietic cell. Nat Med, 1997. 3(7) :p. 730-7.3. Baumann, M. , M. Krause 和 R. Hill, Exploring the role of cancer stemcells in radioresistance. Nat Rev Cancer,2008. 8(7) :p. 545-54.4. Hambardzumyan, D. , M. Squatrito 和 E. C. Holland, Radiation resistanceand stem-like cells in brain tumors. Cancer Cell,2006. 10(6) :p. 454-6.5. Dean,M. , T. Fojo和 S. Bates, Tumour stem cells and drug resistance. NatRev Cancer, 2005. 5(4) :p. 275-84.6. Jones, R. J. , ff. H. Matsui 和 B. D. Smith, Cancer stem cells :are wemissing the target ？ J Natl Cancer Inst,2004. 96(8) :p. 583-5.7. Ho,M. M.等人，Side population in human lung cancer cell lines antitumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res,2007. 67(10) :p. 4827-33.8. Wang, J.等人，Identification of cancer stem cell-like side population cellsin human nasopharyngeal carcinoma cell line.Cancer Res,2007.67 (8) p. 3716-24.9. Haraguchi, N.等人，Characterization of a side population of cancer cellsfrom human gastrointestinal system. Stem Cells,2006. 24(3) :p. 506-13.10. Doyle, L. A.和 D. D. Ross, Multidrug resistance mediated by thebreastcancer resistance protein BCRP(ABCG2). Oncogene,2003. 22(47) :p. 7340-58.11. Alvi, A. J.等 人，Functional and molecular characterisation of mammaryside population cells.Breast Cancer Res,2003. 5(1) :p. Rl-8.12. Frank, N. Y.等 人，ABCB5_mediated doxorubicin transport andchemoresi stance in human malignant melanoma. Cancer Res,2005. 65 (10) p. 4320-33.13. Schatton,T.等人，Identification of cells initiating human melanomas. Nature, 2008. 451 (7176) :p. 345-9.14. Kondo，T.，T. Setoguchi 禾口T. Taga，Persistence of a small subpopulationof cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line. Proc Natl Acad Sci USA， 2004. 101(3) :p. 781-6.15. Goodel 1, M. A.等 人，Isolation and functional properties of murinehematopoietic stem eelIs that are replicating in vivo. J Exp Med, 1996. 183(4) :p. 1797-806.16. Al-Hajj, M. 入，Prospective identification of tumorigenie breast cancercells. Proc Natl Acad Sci USA, 2003. 100(7) :p. 3983—8.17. Collins, A. T.等 人，Prospective identification of tumorigenic prostatecancer stem cells. Cancer Res,2005. 65(23) :p.10946-51.18. Li, C.等人，Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Res, 2007. 67(3) :p. 1030-7.19. Ma, S.等 人，Identification and characterization of tumorigenic livercancer stem/progenitor cells. Gastroenterology,2007.132 (7) :p. 2542-56.20. Prince, M. E.等人，Identification of a subpopulation of cells with cancerstem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma.Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(3) :p. 973-8.21. Ricci-Vi tiani, L.等 人，Identification and expansion of humancolon-cancer-initiating cells. Nature,2007. 445(7123) :p. 111-5.22. Singh, S. K.等 人，Identification of a cancer stem cell in human braintumors. Cancer Res, 2003. 63 (18) :p. 5821-8.23. Dalerba, P.等人，Phenotypic characterization of human colorectal cancerstem cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(24) :p. 10158—63.24. Klein, W. M.等 人，Increased expression of stem cell markers in malignantmelanoma. Mod Pathol, 2007. 20 (1) :p. 102-7.25. Yu，H. Stat3 :Linking oncogenesis with tumor immune evasion, in AACR2008 Annual Meeting. 2008. San Diego, CA.26. Pedranzini, L. , A. Leitch 禾口 J. Bromberg，Stat3 is required for thedevelopment of skin cancer. J Clin Invest,2004.114(5) :p. 619-22.27. Catlett-Falcone, R.等人，Constitutive activation of Stat3 signaling confersresistance to apoptosis in human U266 myeloma cells.Immunity,1999. 10(1) :p. 105-15.28. Bromberg，J. F.等人，Stat3 as an oncogene. Cell，1999. 98 (3) :p. 295-303.29. Kan da, N.等 人，STAT3 is constitutively activated and supports cellsurvival in association with survivin expression in gastric cancer cells. Oncogene，2004. 23(28) :p. 4921—9.30. Schlette, E. J.等人，Survivin expression predicts poorer prognosis inanaplastic large-cell lymphoma. J Clin Oncol,2004. 22 (9) :p. 1682-8.31. Niu，G.等 人，Constitutive Stat3 activity up-regulates VEGF expressionand tumor angiogenesis. Oncogene,2002. 21 (13) :p. 2000-8.32. Xie, T. X.等 人，Stat3 activation regulates the expression of matrixmetalloproteinase-2 and tumor invasion and metastasis. Oncogene，
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38
權利要求
治療異常Stat3通路活性相關紊亂受試者的方法，所述方法包括步驟(a)向受試者施用第一量的第一藥劑，以抑制至少一些異常Stat3通路活性；和(b)向受試者施用第二量的、包含信號轉導抑制劑的第二藥劑。
2.權利要求1的方法，其中第一藥劑通過選自下組的作用抑制Stat3通路活性基本 上抑制Stat3蛋白的磷酸化、基本上抑制Stat3蛋白的二聚化、基本上抑制Stat3蛋白的核 轉位、基本上抑制Stat3蛋白的DNA結合活性、和基本上抑制Stat3蛋白的轉錄活性。
3.權利要求1的方法，其中第一藥劑選自下組化合物及其可藥用鹽或溶劑化物 2-(1_羥乙基)-萘并[2,3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙?；?7-氯-萘并[2，3_b]呋喃-4， 9-二酮、2-乙?；?7-氟-萘并[2,3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙酰基萘并[2,3-b]呋喃-4， 9-二酮、2-乙基-萘并[2,3-b]呋喃-4，9-二酮。
4.權利要求1的方法，其中所述紊亂選自下組自身免疫性疾病、炎性疾病、炎性腸病、 關節(jié)炎、哮喘、和系統性紅斑狼瘡、自身免疫性脫髓鞘病、阿爾茨海默病、中風、缺血再灌注 損傷和多發(fā)性硬化癥。
5.權利要求1的方法，其中所述紊亂是癌癥。
6.權利要求5的方法，其中所述癌癥選自下組乳腺癌、頭頸部癌、肺癌、卵巢癌、胰腺 癌、結直腸癌、前列腺癌、腎細胞癌、黑素瘤、肝細胞癌、宮頸癌、肉瘤、腦瘤、胃癌、多發(fā)性骨 髓瘤、白血病和淋巴瘤。
7.權利要求1的方法，其中第二藥劑包含靶向劑。
8.權利要求1的方法，其中第二藥劑包含生長因子受體靶向劑。
9.權利要求8的方法，其中所述生長因子受體靶向劑包含靶向與激酶相關的生長因子 受體的抗體。
10.權利要求8的方法，其中所述生長因子受體選自下組表皮生長因子受體(EGFR) 或血管內皮生長因子受體(VEGFR)。
11.權利要求8的方法，其中所述生長因子受體靶向劑選自下組吉非替尼(艾瑞沙)、 特羅凱、PD153035、西妥昔單抗(愛必妥)、阿瓦斯丁、帕尼單抗、曲妥珠單抗和抗c-Met抗 體。
12.權利要求1的方法，其中第二藥劑包含激酶靶向劑。
13.權利要求12的方法，其中所述激酶靶向劑包含激酶抑制劑。
14.權利要求12的方法，其中所述激酶靶向劑包含酪氨酸激酶抑制劑(TKI)。
15.權利要求14的方法，其中TKI選自下組厄洛替尼(特羅凱)、索坦(舒尼替尼)、 拉帕替尼、索拉非尼(多吉美)、凡德他尼、阿西替尼、伯舒替尼、西地尼布、達沙替尼(撲瑞 賽)、吉非替尼(艾瑞沙)、伊馬替尼(格列衛(wèi))、來他替尼、ARQ197。
16.權利要求12的方法，其中所述激酶靶向劑選自下組吉非替尼(艾瑞 沙)、ZD6474 (AZD6474)、EMD-72000 (馬妥珠單抗)、帕尼單抗(ABX-EGF)、ICR-62、 CI-1033(PD183805)、拉帕替尼(泰克泊)、AEE788 (吡咯并嘧啶)、EKB_569、EXEL 7647/EXEL 0999、厄洛替尼(特羅凱)、伊馬替尼(格列衛(wèi))、索拉非尼(多吉美)、舒尼替尼(索坦)、達 沙替尼(撲瑞賽)、凡德他尼(ZACTIMA) demsirolimus (馱瑞塞爾)、PTK787(瓦他拉尼)、帕 唑帕尼、AZD2171、依維莫司、seliciclib、AMG 706、阿西替尼、PD0325901、PKC_412、CEP701、 XL880、伯舒替尼、BIBF1120、BIBF1120、尼羅替尼、AZD6244、HKI-272、MS-275、BI2536、GX15-070、AZD0530、enzastaurin、MLN-518 和 ARQ197。
17.權利要求1的方法，其中第二藥劑包含血管生成抑制劑。
18.權利要求17的方法，其中所述血管生成抑制劑選自下組CM101、IFN-a、IL_12、血 小板因子-4、蘇拉明、STO416、血小板反應蛋白、VEGFR拮抗劑、血管生成抑制性甾醇+肝素、 軟骨源性血管生成抑制因子、基質金屬蛋白酶抑制劑、巴馬司他、馬立馬司他、制管張素、內 皮抑素、2-甲氧基雌二醇、替可加蘭、血小板反應蛋白、α νβ 3抑制劑、利諾胺和ADH-I。
19.治療異常Stat3通路活性相關癌癥受試者的方法，所述方法包括步驟(a)向受試者施用第一量的第一藥劑，以抑制至少一些異常Stat3通路活性；和(b)向受試者施用第二量的第二抗癌藥劑。
20.權利要求19的方法，其中第一藥劑通過選自下組的作用抑制Stat3通路活性基 本上抑制Stat3蛋白的磷酸化、基本上抑制Stat3蛋白的二聚化、基本上抑制Stat3蛋白的 核轉位、基本上抑制Stat3蛋白的DNA結合活性、和基本上抑制Stat3蛋白的轉錄活性。
21.權利要求19的方法，其中第一藥劑選自下組化合物及其可藥用鹽或溶劑化物 2-(1_羥乙基)-萘并[2,3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙?；?7-氯-萘并[2，3_b]呋喃-4， 9-二酮、2-乙?；?7-氟-萘并[2,3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙酰基萘并[2,3-b]呋喃_4， 9-二酮、2-乙基-萘并[2,3-b]呋喃-4，9-二酮。
22.權利要求19的方法，其中所述癌癥選自下組乳腺癌、頭頸部癌、肺癌、卵巢癌、胰 腺癌、結直腸癌、前列腺癌、腎細胞癌、黑素瘤、肝細胞癌、宮頸癌、肉瘤、腦瘤、胃癌、多發(fā)性 骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。
23.權利要求19的方法，其中第二藥劑是至少一種癌癥的標準一線治療。
24.權利要求19的方法，其中第二藥劑包含細胞毒性劑。
25.權利要求19的方法，其中第二藥劑選自下組DNA損傷劑、抗有絲分裂劑和抗代謝物。
26.權利要求25的方法，其中所述DNA損傷劑選自下組烷化劑、拓撲異構酶抑制劑和 DNA嵌入劑。
27.權利要求26的方法，其中所述烷化劑選自下組苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰 胺、氮芥、美法侖、尿嘧啶氮芥、塞替派、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、鏈佐星、卡鉬、順鉬、沙 鉬、奧沙利鉬、六甲蜜胺、ET-743、XL119(becatecarin)、達卡巴嗪、氮芥、苯達莫司汀、曲磷 胺、烏拉莫司汀、福莫司汀、尼莫司汀、潑尼莫司汀、雷莫司汀、司莫司汀、奈達鉬、triplatin tetranitrate、甘露舒凡、曲奧舒凡、替莫唑胺、卡波醌、三亞胺醌、三亞乙基蜜胺和丙卡巴 胼。
28.權利要求26的方法，其中所述拓撲異構酶抑制劑選自下組多柔比星(doxil)、柔 紅霉素、表柔比星、依達比星、蒽二酮(諾肖林)、米托蒽醌、絲裂霉素C、博來霉素、放線菌素 D^licatomycin、伊立替康(開普拓)、喜樹堿、魯比替康、貝洛替康、依托泊苷、替尼泊苷和 拓撲替康(和美新)。
29.權利要求26的方法，其中所述DNA嵌入劑選自下組原黃素、多柔比星(阿霉素)、 柔紅霉素、放線菌素D和沙立度胺。
30.權利要求25的方法，其中所述抗有絲分裂劑選自下組紫杉醇(abraxane)/泰 素、多烯紫杉醇(泰索帝)、BMS-275183、聚谷氨酸紫杉醇、tocosal、異長春堿、長春新堿、長春堿、長春地辛、長春利定、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷(VM-26)、伊沙匹隆、拉洛他賽、 ortataxel、tesetaxel 禾口伊其j 平其
31.權利要求25的方法，其中所述抗代謝物選自下組氟脲嘧啶(5-FU)、氟尿苷 (5-FUdR)、甲氨蝶呤、希羅達、阿侖恩、亞葉酸、羥基脲、硫鳥嘌呤(6-TG)、巰嘌呤(6-MP)、阿 糖胞苷、噴司他丁、磷酸氟達拉濱、克拉屈濱(2-CDA)、天冬酰胺酶、吉西他濱、培美曲塞、硼 替佐米、氨基喋呤、雷替曲塞、氯法拉濱、依諾他濱、sapacitabine和阿扎胞苷。
32.權利要求19的方法，其中第二藥劑選自下組卡鉬、多柔比星、吉西他濱、多烯紫衫 醇和依托泊苷。
33.權利要求19的方法，其中所述癌癥是轉移性的、標準一線癌癥治療頑固性的或復 發(fā)性的。
34.治療受試者癌癥的方法，包括步驟(a)向受試者施用第一量的第一抗癌藥劑，以抑制癌干細胞群；和(b)向受試者施用第二量的第二抗癌藥劑，以抑制多數的非癌干細胞的癌細胞。
35.權利要求34的方法，其中步驟(a)包括抑制至少一種癌干細胞自我更新。
36.權利要求34的方法，其中步驟(a)包括殺死至少一種癌干細胞。
37.權利要求36的方法，其中步驟(a)還包括抑制至少另一種癌干細胞自我更新。
38.權利要求34的方法，其中第一量的第一抗癌藥劑也殺死多數的普通癌細胞。
39.權利要求34的方法，其中步驟(a)抑制癌干細胞中的至少一些Stat3通路活性。
40.權利要求39的方法，其中第一抗癌藥劑通過選自下組的作用抑制Stat3通路活性 基本上抑制Stat3蛋白的磷酸化、基本上抑制Stat3蛋白的二聚化、基本上抑制Stat3蛋白 的核轉位、基本上抑制Stat3蛋白的DNA結合活性、和基本上抑制Stat3蛋白的轉錄活性。
41.權利要求34的方法，其中第一抗癌藥劑選自下組小分子Stat3抑制劑、針對 Stat3的RNAi藥劑、針對Stat3的反義藥劑、肽模擬物Stat3抑制劑和G四聯體寡聚脫氧核 苷酸Stat3抑制劑。
42.權利要求34的方法，其中第一抗癌藥劑選自下組化合物及其可藥用鹽或溶劑化 物2-(1_羥乙基)-萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙?；?7-氯-萘并[2，3_b]呋 喃_4，9-二酮、2-乙酰基-7-氟-萘并[2,3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙酰基萘并[2，3_b] 呋喃_4，9-二酮、2-乙基-萘并[2,3-b]呋喃-4，9-二酮。
43.權利要求34的方法，其中所述癌癥選自下組乳腺癌、頭頸部癌、肺癌、卵巢癌、胰 腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、結直腸癌、前列腺癌、黑素瘤、卡波西肉瘤、尤文氏肉瘤、肝癌、胃癌、成 神經管細胞瘤、腦瘤和白血病。
44.權利要求34的方法，其中第二藥劑是至少一種癌癥的標準一線治療。
45.權利要求34的方法，其中第二藥劑包含細胞毒性劑。
46.權利要求34的方法，其中第二藥劑選自下組DNA損傷劑、抗有絲分裂劑和抗代謝物。
47.權利要求46的方法，其中所述DNA損傷劑選自下組烷化劑、拓撲異構酶抑制劑和 DNA嵌入劑。
48.權利要求47的方法，其中所述烷化劑選自下組苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰 胺、氮芥、美法侖、尿嘧啶氮芥、塞替派、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、鏈佐星、卡鉬、順鉬、沙鉬、奧沙利鉬、六甲蜜胺、ET-743、XL119(becatecarin)、達卡巴嗪、氮芥、苯達莫司汀、曲磷 胺、烏拉莫司汀、福莫司汀、尼莫司汀、潑尼莫司汀、雷莫司汀、司莫司汀、奈達鉬、triplatin tetranitrate、甘露舒凡、曲奧舒凡、替莫唑胺、卡波醌、三亞胺醌、三亞乙基蜜胺和丙卡巴 胼。
49.權利要求47的方法，其中所述拓撲異構酶抑制劑選自下組多柔比星(doxil)、柔 紅霉素、表柔比星、依達比星、蒽二酮(諾肖林)、米托蒽醌、絲裂霉素C、博來霉素、放線菌素 D^licatomycin、伊立替康(開普拓)、喜樹堿、魯比替康、貝洛替康、依托泊苷、替尼泊苷和 拓撲替康(和美新)。
50.權利要求47的方法，其中所述DNA嵌入劑選自下組原黃素、多柔比星(阿霉素)、 柔紅霉素、放線菌素D、沙立度胺。
51.權利要求46的方法，其中所述抗有絲分裂劑選自下組紫杉醇(abraxane)/泰 素、多烯紫杉醇(泰索帝)、BMS-275183、聚谷氨酸紫杉醇、tocosal、異長春堿、長春新堿、 長春堿、長春地辛、長春利定、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷(VM-26)、伊沙匹隆、拉洛他賽、 ortataxel、tesetaxel 和伊斯平斯。
52.權利要求46的方法，其中所述抗代謝物選自下組氟脲嘧啶(5-FU)、氟尿苷 (5-FUdR)、甲氨蝶呤、希羅達、阿侖恩、亞葉酸、羥基脲、硫鳥嘌呤(6-TG)、巰嘌呤(6-MP)、阿 糖胞苷、噴司他丁、磷酸氟達拉濱、克拉屈濱(2-CDA)、天冬酰胺酶、吉西他濱、培美曲塞、硼 替佐米、氨基喋呤、雷替曲塞、氯法拉濱、依諾他濱、sapacitabine和阿扎胞苷。
53.權利要求34的方法，其中第二藥劑選自下組卡鉬、多柔比星、吉西他濱、多烯紫衫 醇和依托泊苷。
54.權利要求34的方法，其中第二藥劑包含靶向劑。
55.權利要求34的方法，其中第二藥劑包含生長因子受體靶向劑。
56.權利要求55的方法，其中所述生長因子受體靶向劑包含靶向與激酶相關的生長因 子受體的抗體。
57.權利要求55的方法，其中所述生長因子受體選自下組表皮生長因子受體(EGFR) 或血管內皮生長因子受體(VEGFR)。
58.權利要求55的方法，其中所述生長因子受體靶向劑選自下組吉非替尼(艾瑞 沙)、特羅凱、PD153035、西妥昔單抗(愛必妥)、阿瓦斯丁、帕尼單抗、曲妥珠單抗和抗c-Met 抗體。
59.權利要求34的方法，其中第二藥劑包含激酶靶向劑。
60.權利要求59的方法，其中所述激酶靶向劑包含激酶抑制劑。
61.權利要求59的方法，其中所述激酶靶向劑包含酪氨酸激酶抑制劑(TKI)。
62.權利要求61的方法，其中TKI選自下組厄洛替尼(特羅凱)、索坦(舒尼替尼)、 拉帕替尼、索拉非尼(多吉美)、凡德他尼、阿西替尼、伯舒替尼、西地尼布、達沙替尼(撲瑞 賽)、吉非替尼(艾瑞沙)、伊馬替尼(格列衛(wèi))、來他替尼、ARQ197。
63.權利要求59的方法，其中所述激酶靶向劑選自下組cefitinib (艾瑞 沙)、ZD6474 (AZD6474)、EMD-72000 (馬妥珠單抗)、帕尼單抗(ABX-EGF)、ICR-62、 CI-1033(PD183805)、拉帕替尼(泰克泊)、AEE788 (吡咯并嘧啶)、EKB_569、EXEL 7647/EXEL 0999、厄洛替尼(特羅凱)、伊馬替尼(格列衛(wèi))、索拉非尼(多吉美)、舒尼替尼(索坦)、達沙替尼(撲瑞賽)、凡德他尼(ZACTIMA)、temSir0limuS (馱瑞塞爾)、PTK787(瓦他拉尼)、帕 唑帕尼、AZD2171、依維莫司、seliciclib、AMG 706、阿西替尼、PD0325901、PKC_412、CEP701、 XL880、伯舒替尼、BIBF1120、BIBF1120、尼羅替尼、AZD6244、HKI-272、MS-275、BI2536、 GX15-070、AZD0530、enzastaurin、MLN-518 和 ARQ197。
64.權利要求34的方法，其中第二藥劑包含血管生成抑制劑。
65.權利要求64的方法，其中所述血管生成抑制劑選自下組CM101、IFN-a、IL_12、血 小板因子-4、蘇拉明、STO416、血小板反應蛋白、VEGFR拮抗劑、血管生成抑制甾醇+肝素、軟 骨源性血管生成抑制因子、基質金屬蛋白酶抑制劑、巴馬司他、馬立馬司他、制管張素、內皮 抑素、2-甲氧基雌二醇、替可加蘭、血小板反應蛋白、α νβ 3抑制劑、利諾胺和ADH-I。
66.權利要求34的方法，其中所述癌癥是轉移性的、標準一線癌癥治療頑固性的或復 發(fā)性的。
67.治療受試者癌癥的方法，包括步驟(a)向受試者施用第一量的第一癌干細胞抑制劑，以抑制Stat3通路活性；和(b)向受試者施用第二量的第二癌干細胞抑制劑，以抑制不同通路的活性。
68.權利要求67的方法，其中第二癌干細胞抑制劑是拉帕替尼。
69.權利要求67的方法，其中第二量的第二抗癌藥劑本身對癌干細胞群不是治療有效的。
70.權利要求67的方法，其中所述癌癥選自下組乳腺癌、頭頸部癌、肺癌、卵巢癌、胰 腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、結直腸癌、前列腺癌、黑素瘤、卡波西肉瘤、尤文氏肉瘤、肝癌、胃癌、成 神經管細胞瘤、腦瘤和白血病。
71.權利要求67的方法，其中所述癌癥是轉移性的、標準一線癌癥治療頑固性的或復 發(fā)性的。
72.治療受試者癌癥的方法，包括步驟(a)向受試者施用治療有效量的第一抗癌藥劑，其選自下組化合物及其可藥用鹽或溶 劑化物2-(1_羥乙基)-萘并[2,3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙?；?7-氯-萘并[2，3_b] 呋喃_4，9-二酮、2-乙?；?7-氟-萘并[2,3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙酰基萘并[2,3-b] 呋喃_4，9-二酮、2-乙基-萘并[2,3-b]呋喃-4，9-二酮；和(b)施用并非選自相同組的第二抗癌藥劑。
73.權利要求72的方法，其中第二藥劑是至少一種癌癥的標準一線治療。
74.權利要求72的方法，其中第二藥劑包含細胞毒性劑。
75.權利要求72的方法，其中第二藥劑選自下組DNA損傷劑、抗有絲分裂劑和抗代謝物。
76.權利要求84的方法，其中所述DNA損傷劑選自下組烷化劑、拓撲異構酶抑制劑和 DNA嵌入劑。
77.權利要求85的方法，其中所述烷化劑選自下組苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰 胺、氮芥、美法侖、尿嘧啶氮芥、塞替派、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、鏈佐星、卡鉬、順鉬、沙 鉬、奧沙利鉬、六甲蜜胺、ET-743、XL119(becatecarin)、達卡巴嗪、氮芥、苯達莫司汀、曲磷 胺、烏拉莫司汀、福莫司汀、尼莫司汀、潑尼莫司汀、雷莫司汀、司莫司汀、奈達鉬、triplatin tetranitrate、甘露舒凡、曲奧舒凡、替莫唑胺、卡波醌、三亞胺醌、三亞乙基蜜胺和丙卡巴胼。
78.權利要求85的方法，其中所述拓撲異構酶抑制劑選自下組多柔比星(doxil)、柔 紅霉素、表柔比星、依達比星、蒽二酮(諾肖林)、米托蒽醌、絲裂霉素C、博來霉素、放線菌素 D^licatomycin、伊立替康(開普拓)、喜樹堿、魯比替康、貝洛替康、依托泊苷、替尼泊苷和 拓撲替康(和美新)。
79.權利要求85的方法，其中所DNA嵌入劑選自下組原黃素、多柔比星(阿霉素)、柔 紅霉素、放線菌素D、沙立度胺。
80.權利要求84的方法，其中所述抗有絲分裂劑選自下組紫杉醇(abraxane)/泰 素、多烯紫杉醇(泰索帝)、BMS-275183、聚谷氨酸紫杉醇、tocosal、異長春堿、長春新堿、 長春堿、長春地辛、長春利定、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷(VM-26)、伊沙匹隆、拉洛他賽、 ortataxel、tesetaxel 禾口伊其j 平其
81.權利要求84的方法，其中所述抗代謝物選自下組氟脲嘧啶(5-FU)、氟尿苷 (5-FUdR)、甲氨蝶呤、希羅達、阿侖恩、亞葉酸、羥基脲、硫鳥嘌呤(6-TG)、巰嘌呤(6-MP)、阿 糖胞苷、噴司他丁、磷酸氟達拉濱、克拉屈濱(2-CDA)、天冬酰胺酶、吉西他濱、培美曲塞、硼 替佐米、氨基喋呤、雷替曲塞、氯法拉濱、依諾他濱、sapacitabine和阿扎胞苷。
82.權利要求72的方法，其中第二藥劑選自下組卡鉬、多柔比星、吉西他濱、多烯紫衫 醇和依托泊苷。
83.權利要求72的方法，其中第二藥劑包含靶向劑。
84.權利要求72的方法，其中第二藥劑包含生長因子受體靶向劑。
85.權利要求93的方法，其中所述生長因子受體靶向劑包含靶向與激酶相關的生長因 子受體的抗體。
86.權利要求93的方法，其中所述生長因子受體選自下組表皮生長因子受體(EGFR) 或血管內皮生長因子受體(VEGFR)。
87.權利要求93的方法，其中所述生長因子受體靶向劑選自下組吉非替尼(艾瑞 沙)、特羅凱、PD153035、西妥昔單抗(愛必妥)、阿瓦斯丁、帕尼單抗、曲妥珠單抗和抗c-Met 抗體。
88.權利要求72的方法，其中第二藥劑包含激酶靶向劑。
89.權利要求97的方法，其中所述激酶靶向劑包含激酶抑制劑。
90.權利要求97的方法，其中所述激酶靶向劑包含酪氨酸激酶抑制劑(TKI)。
91.權利要求99的方法，其中TKI選自下組厄洛替尼(特羅凱)、索坦(舒尼替尼)、 拉帕替尼、索拉非尼(多吉美)、凡德他尼、阿西替尼、伯舒替尼、西地尼布、達沙替尼(撲瑞 賽)、吉非替尼(艾瑞沙)、伊馬替尼(格列衛(wèi))、來他替尼、ARQ197。
92.權利要求97的方法，其中所述激酶靶向劑選自下組吉非替尼(艾瑞 沙)、ZD6474 (AZD6474)、EMD-72000 (馬妥珠單抗)、帕尼單抗(ABX-EGF)、ICR-62、 CI-1033(PD183805)、拉帕替尼(泰克泊)、AEE788 (吡咯并嘧啶)、EKB_569、EXEL 7647/EXEL 0999、厄洛替尼(特羅凱)、伊馬替尼(格列衛(wèi))、索拉非尼(多吉美)、舒尼替尼(索坦)、達 沙替尼(撲瑞賽)、凡德他尼(ZACTIMA) demsirolimus (馱瑞塞爾)、PTK787(瓦他拉尼)、帕 唑帕尼、AZD2171、依維莫司、seliciclib、AMG 706、阿西替尼、PD0325901、PKC_412、CEP701、 XL880、伯舒替尼、BIBF1120、BIBF1120、尼羅替尼、AZD6244、HKI-272、MS-275、BI2536、GX15-070、AZD0530、enzastaurin、MLN-518 和 ARQ197。
93.權利要求72的方法，其中第二藥劑包含血管生成抑制劑。
94.權利要求102的方法，其中所述血管生成抑制劑選自下組CM101、IFN-α、IL-12、 血小板因子-4、蘇拉明、STO416、血小板反應蛋白、VEGFR拮抗劑、血管生成抑制甾醇+肝素、 軟骨源性血管生成抑制因子、基質金屬蛋白酶抑制劑、巴馬司他、馬立馬司他、制管張素、內 皮抑素、2-甲氧基雌二醇、替可加蘭、血小板反應蛋白、α νβ 3抑制劑、利諾胺和ADH-I。
95.權利要求72的方法，其中所述癌癥是轉移性的、標準一線癌癥治療頑固性的或復 發(fā)性的。
96.權利要求72的方法，其中所述癌癥選自下組乳腺癌、頭頸部癌、肺癌、卵巢癌、胰 腺癌、結直腸癌、前列腺癌、黑素瘤、肉瘤、肝癌、腦瘤和白血病。
97.權利要求1、19、34、67和72中任一項的方法，還包括向受試者施用可藥用的賦形 齊U、載體或稀釋劑。
98.權利要求1、19、34、67和72中任一項的方法，其中至少一種藥劑以選自下組的方式 施用口服、經鼻、局部、直腸、陰道或腸胃外施用，或靜脈內(IV)、皮下或肌內注射。
99.權利要求19、34和72中任一項的方法，其中第二藥劑選自下組放療劑、生物藥、 激素藥、HDAC抑制劑、視黃醇類藥、檢查點激活物、蛋白酶體抑制劑、輔劑或輔助藥。
100.權利要求99的方法，其中放療劑包含放射性物質或放射增敏劑。
101.權利要求99的方法，其中所述DNA拓撲異構酶調節(jié)劑選自下組多柔比星 (doxil)、柔紅霉素、表柔比星、依達比星、蒽二酮(諾肖林)、米托蒽醌、絲裂霉素C、博來霉 素、放線菌素D、plicatomycin、伊立替康(開普拓)和拓撲替康(和美新)。
102.權利要求99的方法，其中所述生物藥選自下組白介素_2(阿地白介素)、 干擾素-α、干擾素-β、干擾素_ Y、促紅細胞生成素(EPO)、粒細胞集落刺激因子(非 格司亭(filgrastin))、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(沙格司亭(sargramostim))、 IL13-PE38QQR、卡介苗、左旋咪唑、抑生長肽(octreotide)、CPG7909、provenge、GVAX, myvax、favld、雷利米得(revlimid)(來那度胺(Ienalidomide))、赫賽汀(here印tin) (曲妥珠單抗)、美羅華(rituxan)(利妥昔單抗Kmyelotarg(吉妥單抗(gemtuzumab ozogamicin))、坎帕斯(campath)(阿侖單抗(alemtuzumab))、內皮抑素、澤娃靈(zevalin) (替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan))、百克沙(bexxar)(托西莫單抗(tositumomab))、 愛必妥(西妥昔單抗)、扎木單抗(zanolimumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、HGS-ETRU 帕妥珠單抗(pertuzumab)、M200、SGN-30、馬妥珠單抗、阿德木單抗(adecatumab)、迪諾 蘇單抗(denosumab)、扎魯木單抗(zalutumumab)、MDX—060、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、 M0RAb-003、vitaxin、MDX-IOU MDX-010, DPC4 抗體、NF-I 抗體、NF-2 抗體、Rb 抗體、p53 抗 體、WTl抗體、BRCAl抗體、BRCA2抗體、神經節(jié)苷脂(GM2)、前列腺特異性抗原(PSA)、甲胎蛋 白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、黑素瘤相關抗原(MART-l、gapl00、MAGEl，3酪氨酸)以及乳頭瘤 病毒E6和E7片段。
103.權利要求99的方法，其中所述激素藥選自下組二乙基己烯雌酚 (diethylstibestrol)、他莫昔芬(tamoxifen)、阿諾新(aromasin)、托瑞米芬 (tormifene)、氟羥甲基睪丸酮(fluoxymesterol)、雷洛昔芬(raloxifene)、比卡 魯胺(bicalutamide)、尼魯米特(nilutamide)、氟他胺(flutamide)、氨魯米特(aminoglutethimide)、阿那曲唑(anastrozole)(瑞寧得(arimidex))、四唑(tetrazole)、 酮康唑(ketoconazole)、促黃體生成激素釋放激素(LHRH)類似物、醋酸戈舍瑞林、亮丙瑞 林、醋酸甲地孕酮、米非司酮(mifepristone)和潑尼松(強的松)。
104.權利要求99的方法，其中所述HDAC抑制劑選自下組辛二酰苯胺異羥肟酸 (SAHA)、PXDlOl 和 FK228。
105.權利要求99的方法，其中所述視黃醇類藥選自下組塔革雷汀(targretin)和 DNlOlo
106.權利要求99的方法，其中所述檢查點激活物是ARQ501。
107.權利要求99的方法，其中所述輔助藥選自下組阿瑞吡坦(apr印itant)(愛門 德(emend))、恩丹西酮(ondansetron)(樞復寧(zofran))、勞拉西泮(loraz印am)、地塞 米松(地卡特隆(decadron))、苯海拉明(diphenhydramine)(苯那君(benadryl))、雷尼 替丁(ranitidine)(善胃得(Zantac))、西咪替丁(cimetidine)(泰胃美(tagamet))、雷 尼替丁(ranitidine)、法莫替丁(famotidine)、西咪替丁(cimetidine)、procrit、依普定 (印ogen)、優(yōu)保津(neupogen)、紐密伽(neumega)、甲酰四氫葉酸(Ieucovorin)和 GM-CSF。
108.權利要求19、34和72中任一項的方法，其中第二藥劑選自下組達珂(dacogen) (地西他濱(decitabine))、telcyta(canfosfamide)、EFAPR0XYN、替匹法尼(zarnestra)禾口 ionafarnib、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈 洛昔芬(droloxifene)、艾多昔芬(iodoxifene)、醋酸甲地孕酮、阿那曲唑(anastrozole)、 來曲唑(Ietrozole)、硼唑(borazole)、依西美坦(exemestane)、氟他胺(flutamide)、尼 魯米特(nilutamide)、必卡他胺(bicalutamide)、醋酸環(huán)丙孕酮(cyproteroneacetate)、 醋酸戈舍瑞林(gosereline acetate)、亮丙瑞林(Ieuprolide)、非那雄胺(finasteride)、 金屬蛋白酶抑制劑、尿激酶型纖溶酶原激活物受體功能抑制劑、生長因子抗體、生長因子 受體抗體、貝伐單抗(bevacizumab)、西妥昔單抗、絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑、甲氨蝶 呤、5_氟尿嘧啶、嘌呤和腺苷類似物、阿糖胞苷、多柔比星、柔紅霉素、表柔比星、依達比 星、絲裂霉素-C、放線菌素D、光神霉素、順鉬、卡鉬、氮芥、美法侖、苯丁酸氮芥、白消安、 環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、亞硝基脲、塞替派、長春新堿、長春瑞濱(vinorelbine)、長春堿、 長春氟寧(vinflimine)、紫杉醇、多烯紫杉醇、埃博霉素類似物(印othilone analogs), discodermolide類似物、eleutherobin類似物、依托泊苷、替尼泊苷、安吖啶(amsacrine)、 拓撲替康、flavopyridols、蛋白酶體抑制劑，包括硼替佐米(bortezomib)，和生物反應修飾 齊IJ、雄激素受體拮抗劑、LH/RH拮抗劑、紫杉烷(taxane)類似物和雌激素受體拮抗劑。
109.權利要求19、34和72中任一項的方法，其中所述癌癥選自下組肺癌、乳腺癌、宮 頸癌、結直腸癌、肝癌、頭頸部癌、胰腺癌、腦瘤、胃癌和前列腺癌。
110.藥物組合物，包含治療有效量的第一抗癌藥劑，其選自下組化合物及其可藥用鹽或溶劑化物2-(1-羥 乙基)_萘并[2,3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙?；?7-氯-萘并[2,3-b]呋喃_4，9_ 二酮、 2-乙酰基-7-氟-萘并[2,3-b]呋喃_4，9-二酮、2-乙?；敛2,3-b]呋喃_4，9_ 二酮、 2-乙基-萘并[2，3-b]呋喃-4，9- 二酮；和第二抗癌治療，其選自細胞毒性劑、靶向劑、放療劑、生物藥、激素藥、HDAC抑制劑、視 黃醇類藥、檢查點激活物、蛋白酶體抑制劑、輔劑和輔助藥。
111.權利要求110的藥物組合物，還包含可藥用的賦形劑 、載體或稀釋劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及應用Stat3通路抑制劑或癌干細胞抑制劑組合治療癌癥的組合物和方法。
文檔編號A01N31/14GK101854802SQ200880115249
公開日2010年10月6日 申請日期2008年9月10日 優(yōu)先權日2007年9月10日
發(fā)明者C·J·李, K·米庫爾, Y·李 申請人:波士頓生物醫(yī)藥公司