專利名稱：一種利用機(jī)械振蕩來制備超聲造影劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及超聲造影劑，特別涉及一種利用機(jī)械振蕩來制備超聲造影劑的方法，該方法適用于制備多種超聲造影劑，包括常規(guī)增強(qiáng)組織顯影的超聲造影劑(脂類、白蛋白類、多聚體類、表面活性劑類等)、靶向超聲造影劑、納米級(jí)微泡超聲造影劑和兼藥物或基因靶向載體的治療型超聲造影劑；本發(fā)明還具體涉及一種利用機(jī)械振蕩來制備脂類超聲造影劑的方法。
背景技術(shù)：
常規(guī)超聲造影劑是一種含有高濃度微氣泡的懸浮液，微氣泡的平均直徑約2～4微米，小于紅細(xì)胞，可以自由通過肺循環(huán)，但不透過血管，是一種血流示蹤劑。造影劑經(jīng)外周靜脈注入后，由于微泡與周圍組織不同的聲學(xué)特性，從而增強(qiáng)血流及周圍組織的回聲對(duì)比，明顯改善超聲影像對(duì)組織血流灌注的評(píng)價(jià)，顯著提高超聲診斷的敏感性和特異性，進(jìn)一步拓展超聲診斷領(lǐng)域。
近年來，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)，超聲造影劑不僅可用于常規(guī)造影增強(qiáng)，還可用于靶向診斷和介入治療通過在造影劑表面結(jié)合特異性配體制備靶向超聲造影劑，使超聲診斷的敏感性和特異性進(jìn)一步提高；而介入治療的研究，使超聲造影劑的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，應(yīng)用價(jià)值不斷提升。如利用造影劑微泡降低超聲空化閾值，從而促進(jìn)超聲溶栓或提高高功率聚焦超聲的治療效果；或利用超聲波破壞攜帶基因或藥物的造影劑微泡，使基因或藥物靶向釋放并促進(jìn)其穿透，以介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移或藥物靶向治療；或利用造影引導(dǎo)射頻或微波治療并即時(shí)評(píng)價(jià)治療效果，等。
為此，國(guó)外醫(yī)療機(jī)構(gòu)預(yù)測(cè)超聲造影劑不久將成為超聲診斷或治療中的常用試劑，具有巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
超聲造影劑的發(fā)展經(jīng)歷了從空氣微泡到氟碳微泡的進(jìn)步第一代含空氣微泡造影劑，如Levovist、Albunex等，因增強(qiáng)效果微弱、持續(xù)時(shí)間短，診斷價(jià)值不大，2000年后已逐漸退出造影劑市場(chǎng)及研究領(lǐng)域；第二代含氟碳微泡造影劑，不僅增強(qiáng)效果顯著，而且持續(xù)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，對(duì)于多種疾病有明確的診斷價(jià)值。
超聲造影劑發(fā)展的另一個(gè)進(jìn)步是成膜材料的改進(jìn)。從造影劑研制的歷史看，上世紀(jì)九十年代初期多采用人血白蛋白作為成膜材料，而后期開始向脂質(zhì)材料或多聚體材料方向發(fā)展。原因在于，從安全方面考慮，人血白蛋白存在傳播艾滋病、乙型肝炎等血液傳播性疾病的可能性；從造影效果看，脂類造影劑由大分子脂質(zhì)構(gòu)成的膜更穩(wěn)定、更有彈性，造影效果更好，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，更能滿足臨床的需要。因此，新批準(zhǔn)上市的造影劑，如美國(guó)的Definity和Imageat、歐洲的SonoVue均屬脂類造影劑。
目前，國(guó)外已有多種新一代產(chǎn)品上市，包括美國(guó)的Optison、Definity和Imageat，歐洲的SonoVue；而國(guó)內(nèi)沒有自主上市的新一代造影劑，歐洲Bracco公司生產(chǎn)的SonoVue是唯一被我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)商品化的超聲造影劑，價(jià)格十分昂貴。此外，目前市場(chǎng)上的造影劑在性能上也并非十分理想，突出表現(xiàn)在造影持續(xù)時(shí)間上。據(jù)報(bào)道，SonoVue對(duì)實(shí)質(zhì)性器官的有效增強(qiáng)時(shí)間僅4～8分鐘，這很難滿足一個(gè)臟器詳細(xì)超聲檢查(一般需要10～15分鐘)的需要。從發(fā)展的角度看，超聲造影劑要進(jìn)一步在介入治療領(lǐng)域發(fā)展，就更需要提高造影劑在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)在體循環(huán)時(shí)間。
基于此，我們研制了一種長(zhǎng)效脂類超聲造影劑“脂氟顯”(中國(guó)發(fā)明專利專利號(hào)ZL 02 1 33720.9)，該造影劑采用聲振法制備，具有微泡產(chǎn)出率高、使用劑量小、造影效果優(yōu)異、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、安全性好、造價(jià)低廉等特點(diǎn)，尤其在造影增強(qiáng)時(shí)間方面效果顯著，在心腔、肝臟、腎臟等臟器中的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)30分鐘以上，優(yōu)于國(guó)內(nèi)外多種造影劑。但在進(jìn)一步的開發(fā)過程中，我們發(fā)現(xiàn)，聲振法有一定的局限性，突出表現(xiàn)在①探頭式聲振儀的工藝參數(shù)，包括功率、探頭在液面的位置、深度等，不易控制，工藝重現(xiàn)性受到一定影響；②聲振過程中很難做到無菌操作，并存在金屬污染的可能，給造影劑的質(zhì)量控制、制備工藝增加了一定難度；③聲振過程中產(chǎn)生較多的熱量，對(duì)脂質(zhì)的活性，尤其在制備攜帶某些配體、藥物或基因的造影劑時(shí)，對(duì)同時(shí)聲振的配體、藥物或基因的活性產(chǎn)生很大的影響。此外，聲振法是目前應(yīng)用最廣泛的一種制備方法，中國(guó)發(fā)明專利公開的幾種類型的超聲造影劑，包括白蛋白類(CN1156626、CN1243753)、脂類(CN1631444)、多聚體類(CN1398640)、表面活性劑類(CN1369311)等，其制備過程都是采用聲振法，而聲振法的局限性在其制備過程中普遍存在。因此，尋找一種更好的制備方法以取代聲振法很有必要，也很有價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種采用機(jī)械振蕩取代超聲振蕩制備超聲造影劑的方法。
本發(fā)明的目的之二是在采用機(jī)械振蕩一種制備長(zhǎng)效脂類超聲造影劑的新方法。
1.采用機(jī)械振蕩制備超聲造影劑的方法分析聲振法制備超聲造影劑的原理各種類型超聲造影劑的制備都是利用超聲波振蕩時(shí)產(chǎn)生的高頻變換的正負(fù)聲壓，其中的負(fù)聲壓使存在于造影劑制備液中的氣體膨脹形成微小氣泡，此時(shí)，制備液中的脂質(zhì)或白蛋白、表面活性劑、多聚體等趁機(jī)包裹微小氣泡形成穩(wěn)定的造影劑微泡。同理，高頻機(jī)械振蕩時(shí)，由于制備液中各點(diǎn)受力的時(shí)相不同產(chǎn)生不同的正負(fù)壓力，其中的負(fù)壓也可使存在于制備液中的氣體形成微小氣泡。
根據(jù)機(jī)械振蕩法的原理，頻率越高，正負(fù)壓力的變換越快，負(fù)壓的時(shí)間越短，氣體膨脹越小，形成的氣泡就越小；振幅越小，產(chǎn)生的負(fù)壓力越小，相同時(shí)間情況下，由負(fù)壓產(chǎn)生的氣體膨脹越小，形成的氣泡就越小。由于制備超聲造影劑需要形成較小的微氣泡，因此，制備超聲造影劑的機(jī)械振蕩裝置需要較高的頻率、較低的振幅。此外，機(jī)械振蕩方式也是一個(gè)重要的影響因素。機(jī)械振蕩方式一般分為兩種往復(fù)式和漩渦式，其中往復(fù)式又分為水平往復(fù)和垂直往復(fù)。在超聲造影劑的制備過程中，漩渦式產(chǎn)生的渦流容易導(dǎo)致已形成的造影劑微泡相互碰撞而融合、破裂，因此往復(fù)式振蕩是更好的選擇。
綜合以上的要求，我們發(fā)現(xiàn)，膠囊式銀汞調(diào)合器是現(xiàn)有儀器中最符合用于制備超聲造影劑的機(jī)械振蕩裝置。膠囊式銀汞調(diào)合器是口腔科治療齲齒使用銀汞膠囊使之完成汞齊化的專用設(shè)備，它采用往復(fù)式振蕩方式，具有振蕩頻率高、性能穩(wěn)定、自動(dòng)保護(hù)、價(jià)格低廉、使用方便等特點(diǎn)，其構(gòu)造主要包括電機(jī)、夾頭(或卡口)、防護(hù)罩、控制面板等，使用時(shí)只需將銀汞膠囊裝在夾頭上，蓋好防護(hù)罩，選定振蕩時(shí)間，按下啟動(dòng)開關(guān)即可。本發(fā)明所采用的機(jī)械振蕩裝置正是在膠囊式銀汞調(diào)合器的基礎(chǔ)上改裝而成，改裝主要包括(1)根據(jù)一次制備造影劑劑量的多少，選擇不同的振蕩瓶(常規(guī)用西林瓶)，相應(yīng)調(diào)整儀器的大小，包括電機(jī)、夾頭及防護(hù)罩的大??；(2)根據(jù)造影劑制備的效果，在儀器定型前，反復(fù)探索不同工作參數(shù)(包括振蕩頻率、振幅、時(shí)間)對(duì)造影劑制備的影響，以選擇最優(yōu)的工作參數(shù)或參數(shù)范圍。根據(jù)反復(fù)摸索、實(shí)踐的結(jié)果，我們認(rèn)為，制備超聲造影劑的機(jī)械振蕩裝置應(yīng)滿足以下條件(1)振蕩方式為往復(fù)式；(2)振蕩頻率≥3000次/分；(3)振動(dòng)幅度10～30mm；其基本制備方法是將造影劑的制備液置于振蕩瓶?jī)?nèi)，氣體置換(即用所需的氣體將振蕩瓶頭部的空氣置換)后機(jī)械振蕩30～180秒；或?qū)⒃煊皠┑闹苽湟褐瞥蓛龈煞蹌?，制備前重新水合形成制備液，然后機(jī)械振蕩30～180秒，其中，氣體置換可在制成凍干粉劑的同時(shí)，也可在重新水合形成制備液后。
本發(fā)明的機(jī)械振蕩裝置及方法成功地實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的之一，它不僅克服了既往聲振法的局限性，使操作更簡(jiǎn)單，性能更穩(wěn)定，工藝重現(xiàn)性更好，而且應(yīng)用范圍更廣。
根據(jù)現(xiàn)有超聲造影劑制備的原理，本發(fā)明的機(jī)械振蕩裝置可用于制備目前各種類型的超聲造影劑。常規(guī)超聲造影劑中，脂類、表面活性劑類、多聚體類等可直接利用該裝置加普通振蕩瓶制備；白蛋白類，由于在制備過程中需要較高溫度使白蛋白變性，因此需要通過在振蕩瓶?jī)?nèi)加入小珠子來增加摩擦產(chǎn)熱。靶向超聲造影劑的制備有兩種選擇，一種是目前最常用的在常規(guī)超聲造影劑制備完成后加入特異性配體，通過該裝置振蕩一定時(shí)間后制備；另一種是在造影劑制備完成前的制備液中預(yù)先加入特異性配體，在形成造影劑微泡的同時(shí)結(jié)合上特異性配體。后一種選擇是以往采用聲振法制備所不能的，其優(yōu)點(diǎn)一是減少了制備環(huán)節(jié)，二是減少了制備環(huán)節(jié)中微泡的破壞。
該機(jī)械振蕩裝置最大的優(yōu)點(diǎn)是在造影劑制備過程中產(chǎn)熱少，因此尤其適合用于制備兼藥物或基因靶向載體的超聲造影劑。造影劑微泡攜帶基因或藥物的方式分為兩種黏附法和整合法，其中整合法具有明顯的優(yōu)勢(shì)，原因在于黏附法僅僅通過簡(jiǎn)單的混合將藥物或基因黏附在造影劑微泡表面，一方面結(jié)合量少，另一方面黏附的藥物或基因與微泡結(jié)合不牢固，經(jīng)靜脈注射后，在血流沖擊下很容易脫落，靶向性差；而整合法既可以將藥物或基因黏附在微泡表面，更可將其整合在微泡膜上或包裹在微泡內(nèi)，在使結(jié)合量增加的同時(shí)，又使靶向性更好。但既往采用聲振法時(shí)，由于在制備過程中產(chǎn)生較高的溫度，因此在制備時(shí)不能同時(shí)加入藥物或基因，只能采用黏附法制備兼藥物或基因靶向載體的超聲造影劑。而本發(fā)明的機(jī)械振蕩裝置在造影劑制備過程中產(chǎn)熱量少，因此可以采用整合法制備兼藥物或基因靶向載體的超聲造影劑。
2.一種制備長(zhǎng)效脂類超聲造影劑的新方法為驗(yàn)證本發(fā)明的機(jī)械振蕩裝置制備超聲造影劑的效果，也為了優(yōu)化“脂氟顯”的制備工藝，本發(fā)明的目的之二是用本發(fā)明的機(jī)械振蕩裝置取代超聲振蕩儀，相應(yīng)調(diào)整“脂氟顯”的制備工藝，探索一種制備長(zhǎng)效脂類超聲造影劑的新方法。
調(diào)整后，“脂氟顯”制備的主要步驟為(1)水合將造影劑成膜材料中的脂質(zhì)、高分子聚合物與水溶液或非水溶劑充分混勻，形成脂質(zhì)混懸液；(2)冷凍干燥將步驟(1)的脂質(zhì)混懸液冷凍干燥形成凍干粉；(3)再水合將步驟(2)的凍干粉用水合液充分混勻，重新形成脂質(zhì)混懸液；(4)氣體置換將盛有步驟(3)的脂質(zhì)混懸液的振蕩瓶?jī)?nèi)頭部的空氣用含氟氣體置換；(5)機(jī)械振蕩將步驟(4)的振蕩瓶置于機(jī)械振蕩裝置的夾頭上，按設(shè)置好的工作參數(shù)進(jìn)行機(jī)械振蕩，振蕩后即形成含有大量微氣泡的超聲造影劑。
上述步驟(1)中所述的脂質(zhì)為磷脂和/或附加劑。磷脂具有雙親分子特性、生物降解性和生物相容性，在超聲造影劑的制備過程中形成單分子或雙分子層結(jié)構(gòu)的膜，包裹氣體形成微氣泡，因而是脂類超聲造影劑制備中所必需的成分，其中，最常用的磷脂為卵磷脂(即磷脂酰膽堿)，包括天然的，如蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂；半合成的，如部分或充分氫化的卵磷脂；以及合成磷脂，如二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)。其它常用的磷脂還包括磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、心磷脂、鞘磷脂，以及卵磷脂和任何上述磷脂的氟化類似物。為制備攜帶特異性配體的靶向超聲造影劑，磷脂還可以攜帶聚合鏈，如攜帶具有兩親性質(zhì)的聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯酮(PVP)及其衍生物。根據(jù)同性相斥的原理，要增加超聲造影劑的穩(wěn)定性，在脂質(zhì)的組成中加入或全部利用帶凈電荷(如負(fù)電荷)的磷脂是非常有利的，如天然存在的(如大豆或蛋黃衍生的)、半合成的(如部分或充分氫化的)和合成的磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸和心磷脂。附加劑本身并不形成單分子或雙分子層結(jié)構(gòu)，因而并不是造影劑制備所必需的，但它可參與到磷脂膜中，調(diào)節(jié)膜的功能，如膽固醇可以調(diào)節(jié)膜的流動(dòng)性、通透性，十八胺(含正電荷)可改變膜表面的電荷性質(zhì)。本發(fā)明所采用的脂質(zhì)至少包括一種磷脂，最好為合成磷脂；如果是單一磷脂，則最好是帶凈電荷的磷脂；如果是多個(gè)磷脂(兩個(gè)或兩個(gè)以上)形成的混合磷脂，則至少一種是帶凈電荷的磷脂。
上述步驟(1)中所述的高分子聚合物為聚乙二醇，更優(yōu)選的方案是聚乙二醇4000(PEG4000)。高分子聚合物的使用為造影劑膜提供一個(gè)支持結(jié)構(gòu)，同時(shí)，由于膜表面包裹了一層親水性的聚乙二醇膜所形成的親水性屏障以及聚乙二醇分子較大的空間位阻，可防止造影劑被血漿蛋白和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識(shí)別而吞噬，使造影劑在血液循環(huán)中的滯留時(shí)間延長(zhǎng)，在肝、脾、骨髓等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中吞噬減少，增加造影劑的體內(nèi)穩(wěn)定性，延長(zhǎng)造影劑在組織顯影的有效增強(qiáng)時(shí)間。
上述步驟(1)中所述的水溶液選自水(包括注射用水、去離子水、蒸餾水、超純水等)、生理鹽水、鹽水/甘油的混合物(其中甘油所占的體積為5％～20％)和鹽水/甘油/丙二醇的混合物(體積比為8∶1∶1)；所述的非水溶劑選自丙二醇、聚乙二醇300、叔丁醇、正叔丁醇。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的水溶液選擇水。
上述步驟(1)中所述脂質(zhì)、高分子聚合物與水溶液或非水溶劑混合的比例為每毫升水溶液或非水溶劑中含脂質(zhì)1～10mg、含高分子聚合物50～200mg。
上述步驟(1)中所述的充分混勻包括本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的各種手段，其中最常用的是加熱和振蕩，加熱溫度應(yīng)略高于所選脂質(zhì)的最高相變溫度。
上述步驟(2)中所述的冷凍干燥為常規(guī)技術(shù)，冷凍干燥的目的一是增大脂質(zhì)的溶解性，使脂質(zhì)再水合時(shí)更容易分散，所形成的脂質(zhì)混懸液更細(xì)小、均勻；二是增大脂質(zhì)的表面積。凍干后，脂質(zhì)更細(xì)小，但相對(duì)表面積更大，因此，在制備造影劑時(shí)可以形成更多、更小的微泡，使造影劑微泡的產(chǎn)率及質(zhì)量明顯提高。
上述步驟(3)中所述的水合液選自高滲糖、高滲糖/甘油/丙二醇的混合物(體積比為8∶1∶1)以及上述溶液和起泡劑的混合物。其中，高滲糖為濃度＞10％的葡萄糖、果糖及其異構(gòu)體、多聚糖；起泡劑為非離子的表面活性劑，包括吐溫80、司盤80等，具體應(yīng)用時(shí)選擇吐溫80，加入的比例為每毫升水合液中含吐溫80 0.001～0.01ml。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的水合液為高滲糖/甘油/丙二醇的混合物(體積比為8∶1∶1)，其中高滲糖的濃度為20％～50％。加入水合液的量為加入后每毫升脂質(zhì)混懸液中含脂質(zhì)1～3mg，更優(yōu)選的方案為1.5mg。使用高滲糖的目的是為了增加溶液的粘滯度，減少造影劑微泡的相互融合傾向，同時(shí)糖上的氫鍵也直接與脂質(zhì)的氫鍵相互作用，兩者共同增強(qiáng)了造影劑微泡的穩(wěn)定性。甘油和丙二醇的加入，一是增加了溶液的粘滯度，減少造影劑微泡的相互融合傾向；二是可作為助乳化劑，使脂質(zhì)容易成膜，以增加微泡的產(chǎn)率。使用起泡劑的目的一是為了增加微泡的產(chǎn)出率；二是對(duì)脂膜起到穩(wěn)定作用，以延長(zhǎng)造影劑在組織顯影的時(shí)間。
上述步驟(3)中所述的充分混勻包括本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的各種手段，其中最常用的是加熱和振蕩。由于脂質(zhì)經(jīng)冷凍干燥后更容易分散，因此，此步驟的充分混勻難度不大，一般僅手搖片刻即可。
上述步驟(4)中所述的振蕩瓶常規(guī)用西林瓶，其大小應(yīng)適合所采用機(jī)械振蕩裝置的夾頭。此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，振蕩瓶?jī)?nèi)脂質(zhì)混懸液的容積占整個(gè)振蕩瓶容積的比例對(duì)造影劑的制備效果有很大的影響。振蕩瓶?jī)?nèi)脂質(zhì)混懸液所占的比例越小，機(jī)械振蕩時(shí)脂質(zhì)混懸液運(yùn)動(dòng)的幅度就越大(相當(dāng)于振幅越大)，所形成的微氣泡就越大；相反，脂質(zhì)混懸液所占的比例越大，所形成的微氣泡就越小。因此，振蕩瓶?jī)?nèi)脂質(zhì)混懸液的容積占整個(gè)振蕩瓶容積的比例應(yīng)適當(dāng)。經(jīng)過反復(fù)實(shí)踐，此比例應(yīng)在30％～70％的范圍之內(nèi)，最好在大約40％。
上述步驟(4)中所述的含氟氣體包括全氟化碳?xì)怏w、氟化硫氣體，更優(yōu)選的方案是全氟丙烷氣體(C3F8)。含氟氣體為惰性氣體，分子量大，在血液中的溶解度和彌散性差，穩(wěn)定性好。氣體置換的方法有很多種，實(shí)驗(yàn)室常用的方法有①將振蕩瓶直立，直接向振蕩瓶?jī)?nèi)注入一定量的含氟氣體(體積與振蕩瓶頭部的空氣相當(dāng))，借助重力作用(含氟氣體比空氣重得多)將空氣置換出來；②利用三通管，先抽出振蕩瓶?jī)?nèi)的空氣，再注入同等量的含氟氣體；工業(yè)優(yōu)選的方法是把已分裝的振蕩瓶放入冷凍干燥室內(nèi)，用含氟氣體置換振蕩瓶頭部的空氣，也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法。
上述步驟(5)中所述的工作參數(shù)包括機(jī)械振蕩的頻率、振幅、時(shí)間，其中頻率為3000～8000次/分，幅度為10～30mm，時(shí)間為30～90s。
需要說明的是，以上僅僅是造影劑制備工藝中的主要步驟，其它還包括(1)脂質(zhì)混懸液的無菌化處理常采用在分裝前高溫加壓過濾除菌的方法；也可以采用終末滅菌的方法，即將分裝后密封的振蕩瓶在高壓蒸汽滅菌器中滅菌，由于高壓滅菌可引起脂質(zhì)一定程度的降解，因此要掌握好滅菌的條件，一般是126～130℃滅菌1～10min；或同時(shí)應(yīng)用上述兩種方法。
(2)脂質(zhì)混懸液的分裝及密封根據(jù)制備工藝流程的不同，脂質(zhì)混懸液的分裝可以在上述制備的主要步驟(1)之后，也可以在上述制備的主要步驟(3)之后。前者的優(yōu)點(diǎn)是只需一次冷凍干燥過程就可以完成水合→冷凍干燥→氣體置換→密封等全過程，高壓滅菌后就可以作為凍干粉制成品；缺點(diǎn)是該凍干粉制成品需配送水合液，使用時(shí)要先將水合液加入凍干粉成品中，搖勻后機(jī)械振蕩數(shù)十秒才能成為所需要的造影劑成品。后者的缺點(diǎn)是工藝流程相對(duì)復(fù)雜，要先后經(jīng)過水合→冷凍干燥→再水合→分裝→冷凍干燥室進(jìn)行氣體置換→密封→無菌化處理等過程，才能成為制成品，而且制成品為水劑，保質(zhì)期不如凍干粉劑；優(yōu)點(diǎn)是包裝及使用更簡(jiǎn)單，不需配送水合液，使用時(shí)直接機(jī)械振蕩數(shù)十秒即可。
本發(fā)明采用機(jī)械振蕩來制備長(zhǎng)效脂類超聲造影劑“脂氟顯”不僅保留了原方法微泡產(chǎn)出率高、使用劑量小、造影效果優(yōu)異、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、安全性好、造價(jià)低廉等特點(diǎn)，還具有以下特點(diǎn)(1)采用機(jī)械振蕩裝置取代超聲振蕩儀，成功地克服了既往聲振法制備時(shí)的局限性；(2)本方法制備的造影劑微泡不僅產(chǎn)出率高，而且微泡的粒徑范圍窄，大小均勻，制備后馬上即可使用；而聲振法制備后由于有一定數(shù)量的較大微泡存在，使用前要通過靜置或?yàn)V過的辦法除去大微泡后才能使用；(3)本方法可在含脂質(zhì)混懸液的振蕩瓶中加入特異性配體，一次性制備長(zhǎng)效靶向脂類超聲造影劑；也可在含脂質(zhì)混懸液的振蕩瓶中加入所需的藥物或基因，將藥物或基因整合在膜上或包裹在膜內(nèi)，一次性制備兼藥物或基因靶向載體的長(zhǎng)效脂類超聲造影劑；(4)由于小型化的機(jī)械振蕩裝置價(jià)格低廉(不到1000元)，因此，本發(fā)明制備的“脂氟顯”可以先做成脂質(zhì)混懸液的凍干粉劑或水針劑，使用前再機(jī)械振蕩制備成造影劑。與既往造影劑微泡的凍干粉劑比較，該方法制備工藝更簡(jiǎn)單，制作成本更低，但同樣便于保存和運(yùn)輸。
四

圖1為本發(fā)明所采用的一種機(jī)械振蕩裝置；圖2為采用機(jī)械振蕩儀制備的脂類超聲造影劑微泡在光鏡下的圖像(×400)；圖3為造影劑對(duì)兔肝臟實(shí)質(zhì)增強(qiáng)顯像的動(dòng)態(tài)圖像。
參見附圖2，圖中表明造影劑稀釋100倍后在400倍光鏡下觀察，微泡分布均勻。
參見附圖3，該圖為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)造影效果圖，該附圖表明造影劑能長(zhǎng)時(shí)間增強(qiáng)肝實(shí)質(zhì)的灰階顯像，動(dòng)態(tài)觀察，造影后60min，下腔靜脈內(nèi)仍可見造影劑微泡的回聲(A、B、C、D、E、F分別為造影前、造影后11s、1min、12min、30min、60min)。
五具體實(shí)施例方式
用100ml錐形瓶稱取二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)30mg、DSPC 30mg、PEG4000 1940mg，加入40ml在60℃恒溫水浴中預(yù)熱后的去離子水，將錐形瓶放入60℃恒溫水浴搖床，調(diào)節(jié)搖床的速度約200rpm，振蕩10～20min，直至脂質(zhì)完全分散。用移液器將錐形瓶?jī)?nèi)的脂質(zhì)混懸液分裝入40瓶1ml西林瓶?jī)?nèi)(該西林瓶實(shí)際容積約3.5ml，適合作為振蕩瓶)，冷凍干燥成為凍干粉劑。采用高滲糖/甘油/丙二醇的混合物(體積比為8∶1∶1)作為水合液，其中高滲糖為20％的葡萄糖，按每瓶1.2ml加入水合液，用手輕輕混勻。將西林瓶直立，直接向振蕩瓶?jī)?nèi)注入約2.5ml全氟丙烷，借助重力作用將空氣置換出來。將西林瓶用機(jī)械振蕩裝置(注該機(jī)械振蕩裝置的振蕩頻率和振幅在儀器成型后已固定，分別為頻率4100次/分，幅度15±1mm)的夾頭固定好，設(shè)定機(jī)械振蕩的時(shí)間為45s，打開電源，啟動(dòng)開關(guān)，按預(yù)設(shè)的時(shí)間完成振蕩過程，即制備所需的脂類超聲造影劑。
造影劑制備后，用光鏡觀察微泡大小、形態(tài)，血球計(jì)數(shù)板測(cè)定微泡濃度，激光粒度分析儀測(cè)定粒徑及分布、表面電位、pH值；以新西蘭大白兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，經(jīng)耳緣靜脈按0.01ml/kg的劑量進(jìn)行超聲造影，觀察該造影劑對(duì)兔正常肝臟的增強(qiáng)效果。結(jié)果1.造影劑微泡的粒徑從數(shù)百nm到數(shù)個(gè)μm，全部均小于8μm(見圖2)，平均濃度為2.56±0.15×1010/ml，平均粒徑為1.67±0.11μm，表面電位為-37.5mV±0.3mV，pH值為6.46±0.21；2.該造影劑能長(zhǎng)時(shí)間增強(qiáng)肝實(shí)質(zhì)的灰階顯像，增強(qiáng)持續(xù)時(shí)間達(dá)60min以上(見圖3)，而且安全性好，表現(xiàn)為整個(gè)造影過程，所有動(dòng)物生命征平穩(wěn)，實(shí)驗(yàn)后病檢，所有組織，包括心、肝、腎、肺，大體及顯微病理檢查均未見異常；3.工藝重現(xiàn)性好，造影劑制備后，無論是物理性能，還是造影效果都基本一致。
權(quán)利要求
1.一種利用機(jī)械振蕩來制備超聲造影劑的方法，其特征在于將造影劑的制備液機(jī)械振蕩30～180秒；其中，機(jī)械振蕩的方式為往復(fù)式，振蕩頻率≥3000次/分，振蕩幅度10～30mm。
2.一種利用機(jī)械振蕩來制備長(zhǎng)效脂類超聲造影劑的方法，其主要包括如下步驟(1)水合將造影劑成膜材料中的脂質(zhì)、高分子聚合物與水溶液或非水溶劑充分混勻，形成脂質(zhì)混懸液；(2)冷凍干燥將步驟(1)的脂質(zhì)混懸液冷凍干燥形成凍干粉；(3)再水合將步驟(2)的凍干粉用水合液充分混勻，重新形成脂質(zhì)混懸液；(4)氣體置換將盛有步驟(3)的脂質(zhì)混懸液的振蕩瓶?jī)?nèi)頭部的空氣用含氟氣體置換；(5)機(jī)械振蕩將步驟(4)的振蕩瓶置于機(jī)械振蕩裝置的夾頭上，按設(shè)置好的工作參數(shù)進(jìn)行機(jī)械振蕩，振蕩后即形成含有大量微氣泡的超聲造影劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中步驟(1)中所述的脂質(zhì)為磷脂和/或附加劑，其中至少包括一種磷脂；所述的高分子聚合物為聚乙二醇；所述的水溶液選自水、生理鹽水、鹽水/甘油的混合物和鹽水/甘油/丙二醇的混合物，所述的非水溶劑選自丙二醇、聚乙二醇300、叔丁醇、正叔丁醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求2和3所述的方法，其中步驟(1)中所述的脂質(zhì)為合成磷脂，其中至少包括一種是帶凈電荷的磷脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求2和3的方法，其中步驟(1)中所述的高分子聚合物為聚乙二醇4000。
6.根據(jù)權(quán)利要求2和3所述的方法，其中步驟(1)中所述的水溶液選擇水。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中步驟(1)中所述脂質(zhì)、高分子聚合物與水溶液或非水溶劑混合的比例為每毫升水溶液或非水溶劑中含脂質(zhì)1～10mg、含高分子聚合物50～200mg。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟(3)中所述的水合液選自高滲糖、高滲糖/甘油/丙二醇的混合物以及上述溶液和起泡劑的混合物；其中，高滲糖為濃度＞10％的葡萄糖、果糖及其異構(gòu)體、多聚糖；起泡劑為非離子的表面活性劑，包括吐溫80、司盤80等，具體應(yīng)用時(shí)選擇吐溫80，加入的比例為每毫升水合液中含吐溫800.001～0.01ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟(3)中所述的水合液為高滲糖/甘油/丙二醇的混合物，其中高滲糖的濃度為20％～50％；加入水合液的量為加入后每毫升脂質(zhì)混懸液中含脂質(zhì)1～3mg。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟(4)中所述的振蕩瓶常規(guī)用西林瓶，其大小應(yīng)適合所采用機(jī)械振蕩裝置的夾頭，且加入脂質(zhì)混懸液的容積占整個(gè)振蕩瓶容積的比例應(yīng)在30％～70％的范圍之內(nèi)。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟(4)中所述的含氟氣體包括全氟化碳?xì)怏w、氟化硫氣體。
12.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟(4)中所述的含氟氣體為全氟丙烷氣體。
13.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟(5)中所述的工作參數(shù)包括機(jī)械振蕩的頻率、振幅、時(shí)間，其中頻率為3000～8000次/分，幅度為10～30mm，時(shí)間為30～90s。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用機(jī)械振蕩來制備超聲造影劑的方法，該方法可用于制備多種超聲造影劑，包括常規(guī)增強(qiáng)組織顯影的超聲造影劑(脂類、白蛋白類、多聚體類、表面活性劑類等)、靶向超聲造影劑、納米級(jí)微泡超聲造影劑和兼藥物或基因靶向載體的治療型超聲造影劑；本發(fā)明還具體涉及一種利用機(jī)械振蕩來制備脂類超聲造影劑的方法。
文檔編號(hào)A61K49/06GK1785435SQ20051005737
公開日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2005年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月9日
發(fā)明者譚開彬, 高云華, 劉政, 劉平, 夏紅梅 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院