專利名稱：分離的哺乳動(dòng)物膜蛋白基因和相關(guān)試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與在淋巴細(xì)胞，例如，在免疫系統(tǒng)中起作用的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的基因有關(guān)的組合物。這些基因在控制哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)的發(fā)育、分化和/或生理中起作用。具體地，本申請?zhí)峁┝撕怂?、蛋白質(zhì)、抗體，和使用它們的方法。
背景技術(shù)：
哺乳動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)的循環(huán)組分包括各種細(xì)胞類型，包括紅細(xì)胞和骨髓細(xì)胞譜系的紅細(xì)胞和白細(xì)胞。見，例如，Rapaport(1987)Introduction to Hematology(第二版)Lippincott，Philadelphia，PA；Jandl(1987)BloodTextbook of Hematology，Little，Brown和同事，Boston，MA.；和Paul(編者，1998)Fundamental Immunology(第四版)Raven Press，N.Y。
樹突細(xì)胞(DC)是抗原加工或呈遞細(xì)胞，并且被發(fā)現(xiàn)于身體的所有組織?？蓪⑺鼈兎殖筛鞣N類別，包括心臟、腎、內(nèi)臟和肺的間質(zhì)樹突細(xì)胞；腎和粘膜中的朗格漢斯細(xì)胞；胸腺髓質(zhì)和次級淋巴組織中的交錯(cuò)樹突細(xì)胞；和血液和淋巴樹突細(xì)胞。盡管這些隔室的每一種中的樹突細(xì)胞都是表面上來自骨髓的CD45+白細(xì)胞，但是它們顯示出與成熟狀態(tài)和微環(huán)境有關(guān)的差異。
這些樹突細(xì)胞將抗原有效加工并呈遞到例如，T細(xì)胞。它們刺激次級淋巴器官的副皮質(zhì)區(qū)中幼稚和記憶T細(xì)胞的應(yīng)答。有證據(jù)證明樹突細(xì)胞在誘導(dǎo)耐受性中的角色。
初級和次級B細(xì)胞濾泡含有濾泡樹突細(xì)胞，其捕獲并長時(shí)間保留完整抗原作為免疫復(fù)合體。這些樹突細(xì)胞將天然抗原呈遞給B細(xì)胞并且可能參與抗原的親和性成熟、免疫記憶的產(chǎn)生和體液免疫應(yīng)答的維持。
單核細(xì)胞是巨噬細(xì)胞性細(xì)胞，它們屬于單核巨噬細(xì)胞體系并停留在循環(huán)中。見Roitt(編者)Encyclopedia of ImmunologyAcademicPress，San Diego這些細(xì)胞起源于骨髓并且一旦它們分化僅在髓隔室中短時(shí)間保留。然后它們進(jìn)入循環(huán)并可以保持相對長的時(shí)間，例如，幾天。單核細(xì)胞通過所稱作的血細(xì)胞滲出過程可以進(jìn)入組織和體腔，在那里它們分化成巨噬細(xì)胞并可能分化成樹突細(xì)胞。在炎癥反應(yīng)中，循環(huán)中單核細(xì)胞數(shù)可以倍增，并且許多數(shù)量增加的單核細(xì)胞滲出到炎癥部位。
抗原呈遞指一種細(xì)胞事件，其中蛋白質(zhì)抗原被攝入，被抗原呈遞細(xì)胞(APC)加工，然后被識別而引起免疫應(yīng)答。最具活性的抗原呈遞細(xì)胞已經(jīng)被鑒定為巨噬細(xì)胞(它們是單核細(xì)胞的直接發(fā)育產(chǎn)物)、樹突細(xì)胞，和某些B細(xì)胞。
在多數(shù)組織中發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞并且它們在各種蛋白質(zhì)抗原和微生物的內(nèi)化中具有高度活性。它們具有高度發(fā)育的內(nèi)吞活性，并且分泌對免疫應(yīng)答的啟動(dòng)重要的許多產(chǎn)物。因?yàn)樵撛?，認(rèn)為被單核細(xì)胞表達(dá)或者被單核細(xì)胞活化誘導(dǎo)的許多基因?qū)τ诳乖瓟z入、加工、呈遞或所導(dǎo)致的免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)是重要的。
然而，樹突細(xì)胞和單核細(xì)胞在它們所表達(dá)的蛋白質(zhì)和許多它們的功能和作用機(jī)理，包括它們的活化狀態(tài)方面都沒有被良好表征。具體地，與免疫應(yīng)答的啟動(dòng)(包括抗原加工和呈遞)相關(guān)的過程和機(jī)理仍然不清楚。缺乏關(guān)于這些細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)和生理學(xué)性質(zhì)的知識限制了對它們的理解。從而，當(dāng)醫(yī)學(xué)病癥中的抗原呈遞細(xì)胞的調(diào)節(jié)、發(fā)育或生理不尋常時(shí)，仍然難以處理這些醫(yī)學(xué)病癥。
序列標(biāo)識符描述SEQ ID NO1是靈長類SDCMP3 C-凝集素家族基因核苷酸序列。
SEQ ID NO2是靈長類SDCMP3 C-凝集素家族基因多肽序列。
SEQ ID NO3是嚙齒類SDCMP3 C-凝集素家族基因核苷酸序列。
SEQ ID NO4是嚙齒類SDCMP3 C-凝集素家族基因多肽序列。
SEQ ID NO5是靈長類SDCMP4長C-凝集素家族基因核苷酸序列。
SEQ ID NO6是靈長類SDCMP4長C-凝集素家族基因多肽序列。
SEQ ID NO7是靈長類SDCMP4短C-凝集素家族基因核苷酸序列。
SEQ ID NO8是靈長類SDCMP4短C-凝集素家族基因多肽序列。
SEQ ID NO9是全長人SDCMP3核苷酸序列。
SEQ ID NO10是全長人SDCMP3多肽序列。
發(fā)明概述本發(fā)明部分基于發(fā)現(xiàn)了各種哺乳動(dòng)物Schering樹突細(xì)胞膜蛋白(SDCMP)基因。分布數(shù)據(jù)表明了更廣的細(xì)胞分布，結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)提出了某些功能，并且通過特定SDCMP3和SDCMP4實(shí)施方案例證。SDCMP3和4顯示了與凝集素和脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)類的相似性。本發(fā)明包括基因產(chǎn)物的激動(dòng)劑和拮抗劑，例如，天然序列的突變(突變蛋白)、融合蛋白、化學(xué)模擬物、抗體，和其他結(jié)構(gòu)或功能類似物。還涉及編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的分離的基因。還提供了這些不同蛋白質(zhì)或核酸組合物的各種用途。
本發(fā)明提供了分離的結(jié)合組合物，其特異結(jié)合含有SEQ ID NO2、4、6、8、或10的多肽。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合組合物是抗體或其抗體結(jié)合片段。通常，抗體結(jié)合片段是a)Fv片段；b)Fab片段；或c)Fab2片段，抗體是a)多克隆抗體；b)單克隆抗體；或c)人源化抗體。
本發(fā)明還提供了使用結(jié)合組合物的方法，該方法包括將結(jié)合組合物與含有抗原的樣品接觸形成結(jié)合組合物抗原復(fù)合體。在額外的實(shí)施方案中，樣品是生物樣品，包括體液；樣品是人；抗原在細(xì)胞上；抗原被進(jìn)一步純化；或者方法提供抗原的空間定位或分布。
還提供了檢測試劑盒，其含有結(jié)合組合物和a)關(guān)于試劑盒中試劑的使用或處理的使用說明材料；或b)隔室，其使得結(jié)合組合物或試劑盒的其他試劑分開。
本發(fā)明包括基本上純的或分離的多肽，該多肽特異結(jié)合結(jié)合組合物。該多肽含有SEQ ID NO2、4、6、8或10。還提供了使用該多肽的方法，該方法包括將該多肽與抗體在適宜條件下接觸以形成抗體多肽復(fù)合體。另一實(shí)施方案是檢測試劑盒，該試劑盒含有多肽和a)關(guān)于試劑盒中試劑的使用或處理的使用說明材料；或b)隔室，其使得該多肽或試劑盒的其他試劑分開。
本發(fā)明提供了分離或純化的編碼結(jié)合該結(jié)合組合物的多肽的核酸。在另一實(shí)施方案中，該核酸含有SEQ ID NO1、3、5、7或9。
還包括分離或純化的核酸，其在嚴(yán)格條件下與編碼結(jié)合該結(jié)合組合物的多肽的核酸雜交。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有該核酸的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。通常，該宿主細(xì)胞是a)哺乳動(dòng)物細(xì)胞；b)細(xì)菌細(xì)胞；c)昆蟲細(xì)胞；或d)酵母細(xì)胞。本發(fā)明還包括制備多肽的方法，該方法包括將宿主細(xì)胞在適宜條件下培養(yǎng)以表達(dá)該多肽和純化該多肽。
本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)樹突細(xì)胞生理或功能的方法，該方法包括將細(xì)胞與SEQ ID NO2、4、6、8、或10的激動(dòng)劑或拮抗劑接觸。在另一實(shí)施方案中，拮抗劑是抗體。在另一實(shí)施方案中，接觸是與抗原(包括細(xì)胞表面抗原、MHC I類或MHC II類抗原)相聯(lián)合。
詳述此處所引用的所有參考文獻(xiàn)都被相同程度地并入作為參考，就像為了所有目的每個(gè)單獨(dú)出版物或?qū)＠暾埍惶貏e和單獨(dú)地指出被完整并入作為參考一樣。
I.概要本發(fā)明提供了編碼在樹突細(xì)胞(DC)上表達(dá)的哺乳動(dòng)物蛋白的DNA序列。關(guān)于樹突細(xì)胞綜述，見Steinman(1991)Annual Review ofImmunology9271-296；和Banchereau和Schmitt(編者，1994)Dendritic Cells in Fundamental and Clinical ImmunologyPlenumPress，NY。這些蛋白質(zhì)被稱為樹突細(xì)胞蛋白質(zhì)是因?yàn)樗鼈冊谶@些細(xì)胞上被發(fā)現(xiàn)并且它們的表達(dá)似乎表現(xiàn)出一定的特異性。
下面提供了這些蛋白質(zhì)的特定人實(shí)施方案。下面的描述涉及(為了示例的目的)人DC基因，但是同樣可應(yīng)用于來自其他來源或哺乳動(dòng)物種類的結(jié)構(gòu)(例如序列)相關(guān)的實(shí)施方案，包括多態(tài)性變體或個(gè)體變體。這些蛋白包括，例如，在序列上顯示出相對少的改變，例如，少于約5％，和數(shù)目上相對少的改變，例如，少于20個(gè)殘基置換，通常少于15，優(yōu)選少于10，更優(yōu)選少于5個(gè)置換，包括4、3、2、或1個(gè)置換的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)還包括如所描述的從全長截?cái)嗟男问?，和含有這些序列的實(shí)質(zhì)片段的融合蛋白。
II.定義術(shù)語“結(jié)合組合物”指特異結(jié)合這些DC蛋白的分子(例如，在抗體-抗原相互作用中)。其他化合物，例如，蛋白質(zhì)，也可以特異結(jié)合各自蛋白。通常，特異結(jié)合將是天然的生理上相關(guān)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(共價(jià)或非共價(jià))，并且可以包括多蛋白質(zhì)復(fù)合體的成員，包括載體化合物或二聚體配偶體。該分子可以是聚合物，或化學(xué)試劑。功能類似物可以是具有結(jié)構(gòu)修飾的蛋白質(zhì)，或者可以是完全不相關(guān)的分子，例如，該分子的分子形狀與適宜的相互作用決定簇相互作用。變體可以作為蛋白質(zhì)的激動(dòng)劑或拮抗劑。見例如，Goodman，等人(編者)(1990)Goodman和Gilman′sThe Pharmacological Bases ofTherapeutics(第八版)Pergamon Press，Tarrytown，N.Y。
如此處所用的，術(shù)語“結(jié)合劑DC蛋白復(fù)合體”指結(jié)合劑和DC蛋白的復(fù)合體。結(jié)合劑的特異結(jié)合指結(jié)合劑具有特異結(jié)合部位，該結(jié)合部位識別各自DC蛋白上的位點(diǎn)。例如，針對DC蛋白產(chǎn)生并識別該DC蛋白上的表位的抗體能夠通過特異結(jié)合形成抗體DC蛋白復(fù)合體。通常，結(jié)合劑DC蛋白復(fù)合體的形成使得可以測量其他蛋白質(zhì)和生物產(chǎn)品的混合物中的DC蛋白。術(shù)語“抗體DC蛋白復(fù)合體”指結(jié)合劑DC蛋白復(fù)合體，其中結(jié)合劑是抗體?？贵w可以是單克隆的、多克隆的或者甚至是抗體的抗原結(jié)合片段，例如，包括Fv、Fab或Fab2片段。
“同源”核酸序列當(dāng)被比較時(shí)顯示出顯著的相似性。核酸中同源性的標(biāo)準(zhǔn)是或者通過序列比較和/或種系發(fā)生關(guān)系，或者基于雜交條件測量的本領(lǐng)域一般使用的同源性。下面更詳細(xì)的描述了雜交條件。
“分離的”核酸是一種核酸，例如，RNA、DNA或混合的聚合物，其與其他組分基本上分開，該其他組分天然地伴隨著天然序列，例如，來自最初物種的蛋白質(zhì)和側(cè)翼基因組序列。該術(shù)語包括已經(jīng)從其天然發(fā)生的環(huán)境除去的核酸序列，還包括重組或克隆的DNA分離物和化學(xué)合成的類似物或通過異源系統(tǒng)生物合成的類似物。基本上純的分子包括分子的分離形式。分離的核酸將通常是分子的同源組合物，但是將在一些實(shí)施方案中含有微小的異質(zhì)性。該異質(zhì)性通常發(fā)現(xiàn)于聚合物末端或者對于所希望的生物學(xué)功能或活性不關(guān)鍵的部分。
如此處所用的，術(shù)語“SDCMP3蛋白”當(dāng)用于蛋白質(zhì)語境中時(shí)將包括具有如SEQ ID NO2、4或10中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或者這種蛋白質(zhì)的重要片段。該術(shù)語指與各自SDCMP3蛋白質(zhì)特異結(jié)合組分相互作用的多肽。這些結(jié)合組分，例如，抗體，通常以高親和性(例如，至少約100nM，通常高于約30nM，優(yōu)選高于約10nM，更優(yōu)選高于約3nM)結(jié)合SDCMP3蛋白。類似地，術(shù)語SDCMP4將關(guān)于SEQ ID NO6或8應(yīng)用。
如此處所用的術(shù)語“多肽”或“蛋白質(zhì)”包括蛋白質(zhì)的重要片段或節(jié)段，并且包括一段氨基酸殘基，其至少約8個(gè)氨基酸，通常至少10個(gè)氨基酸，更通常至少12個(gè)氨基酸，通常至少14個(gè)氨基酸，更通常至少16個(gè)氨基酸，典型地至少18個(gè)氨基酸，更典型地至少20個(gè)氨基酸，通常至少22個(gè)氨基酸，更通常至少24個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少26個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少28個(gè)氨基酸，并且在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少約30個(gè)或更多氨基酸，例如，35、40、45、50、60、70個(gè)氨基酸等。
“重組”核酸通常由其結(jié)構(gòu)定義。其可以是通過將非天然相鄰的兩個(gè)片段融合產(chǎn)生序列而得到的核酸，但是排除天然產(chǎn)物，例如，天然發(fā)生的突變形式。
某些形式由產(chǎn)生的方法定義。關(guān)于此，例如，通過一種方法產(chǎn)生的產(chǎn)物，該方法使用重組核酸技術(shù)，例如，包括人為干預(yù)核苷酸序列(通常為選擇或制備)。
這樣，本發(fā)明包括，例如，含有使用合成寡核苷酸方法得到的序列的核酸，和通過用編碼這些蛋白質(zhì)的非天然發(fā)生的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞制備的產(chǎn)物。這通常將一個(gè)密碼子用編碼相同或保守氨基酸的冗余密碼子代替，而通常導(dǎo)入或者除去序列識別位點(diǎn)，例如，限制酶的序列識別位點(diǎn)。備選地，將具有所希望的功能的核酸片段連接在一起以產(chǎn)生單一遺傳實(shí)體，該遺傳實(shí)體含有所希望的功能的組合，在通?？梢缘玫降奶烊恍问街袥]有發(fā)現(xiàn)該功能組合。限制酶識別位點(diǎn)通常是這些人工操作的靶標(biāo)，但是其他位點(diǎn)特異靶標(biāo)，例如，啟動(dòng)子、DNA復(fù)制位點(diǎn)、調(diào)節(jié)序列、控制序列，或其他有用的特征，例如，引物片段，可以通過設(shè)計(jì)而被摻入。對于重組體，例如，融合多肽，具有類似的概念。特別包括合成的核酸，其通過遺傳密碼冗余性編碼了類似于這些抗原的片段的多肽，和來自各種不同物種變體的序列的融合。
“溶解度”由以Svedberg單位測量的沉降來反映，Svedberg單位是特定條件下分子的沉降速度的量度。沉降速度的確定通常在分析性超速離心機(jī)上進(jìn)行，但是現(xiàn)在通常在標(biāo)準(zhǔn)超速離心機(jī)上進(jìn)行。見，F(xiàn)reifelder(1982)Physical Biochemistry(第二版)Freeman和同事，San Francisco，CA；和Cantor和Schimmel(1980)Biophysical Chemistry，1-3部分，F(xiàn)reeman和同事，San Francisco，CA。作為粗略測定，將含有假定的可溶多肽的樣品在標(biāo)準(zhǔn)完全大小的超速離心機(jī)中以約50K rpm旋轉(zhuǎn)約10分鐘，可溶分子將保留在上清液中?？扇芪⒘；蚨嚯牡湫偷貙⑿∮诩s30S，更典型地小于約15S，通常小于約10S，更通常小于約6S，并且，在具體實(shí)施方案中，優(yōu)選小于約4S，更優(yōu)選小于約3S。多肽或片段的溶解度取決于環(huán)境和該多肽。許多參數(shù)影響多肽溶解度，包括溫度、電解質(zhì)環(huán)境、該多肽的大小和分子特征，和溶劑的性質(zhì)。通常，多肽所用的溫度為約4℃到約65℃。通常所用的溫度大于約18℃，更通常大于約22℃。對于診斷目的，溫度將通常為約室溫或更高溫度，但是低于測定中組分的變性溫度。對于治療目的，溫度將通常為體溫，對于人通常約37℃，盡管在某些條件下可以在原位或體外升溫或降溫。
該多肽的大小和結(jié)構(gòu)將通常處于基本上穩(wěn)定的生理活性狀態(tài)，并且通常不處于變性狀態(tài)。該多肽可以與處于四級結(jié)構(gòu)的其他多肽結(jié)合，例如，以賦予可溶性，或者以某種方式與脂質(zhì)或去污劑結(jié)合而接近天然脂質(zhì)雙層相互作用。
溶劑將通常是用于生物學(xué)活性的保持的一種類型的生物學(xué)相容的緩沖液，并且將通常接近生理溶劑。通常，該溶劑將具有中性pH，通常約5到10，優(yōu)選約7.5。在一些場合下，將加入去污劑，通常為溫和的非變性去污劑，例如，CHS(膽醇烯基半琥珀酸鹽)或CHAPS(3-([3-膽酰胺基丙基]二甲基氨)-1-丙磺酸鹽)，或者處于足夠低的去污劑濃度以便避免對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或生理性質(zhì)的重大破壞。
“基本純的”通常指，例如，在蛋白質(zhì)語境中，該蛋白質(zhì)與其他污染性蛋白質(zhì)、核酸、或來自最初來源生物的其他生物制劑分離。純凈，或者“分離”可以由標(biāo)準(zhǔn)方法來分析，通常按重量計(jì)，并且將通常至少約50％純，更通常至少約60％純，通常至少約70％純，更通常至少約80％純，經(jīng)常至少約85％純，更經(jīng)常至少約90％純，優(yōu)選至少約95％純，更優(yōu)選至少約98％純，在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少約99％純。通常加入載體或賦形劑，或者制劑可以是無菌的或者含有緩沖組分。
在核酸序列比較語境中的“基本相似性”指比較時(shí)，片段或它們的互補(bǔ)鏈當(dāng)最適對比(具有適宜的核苷酸插入或缺失)時(shí)至少約50％的核苷酸相同，通常至少56％，更通常至少59％，通常至少62％，更通常至少65％，通常至少68％，更通常至少71％，典型地至少74％，更典型地至少77％，通常至少80％，更通常至少約85％，優(yōu)選至少約90％，更優(yōu)選至少約95到98％或更高，在特定實(shí)施方案中，高達(dá)約99％或更多的核苷酸相同。備選地，當(dāng)片段在選擇性雜交條件下與鏈或者其互補(bǔ)序列雜交時(shí)，存在基本相似性，雜交所用序列通常來自SEQID NO1、3或9。典型地，當(dāng)在至少約30個(gè)核苷酸的一段序列上有至少約55％相似性，優(yōu)選至少約25個(gè)核苷酸的一段序列上有至少約65％相似性，更優(yōu)選至少約20個(gè)核苷酸的一段序列上有至少約75％和最優(yōu)選約90％相似性時(shí)將發(fā)生選擇性雜交。見，Kanehisa(1984)Nucl.Acids Res.12203-213。如描述的相似性比較的長度可以在更長序列上，在某些實(shí)施方案中將在至少約17個(gè)核苷酸，通常至少約20個(gè)核苷酸，更通常至少約24個(gè)核苷酸，典型地至少約28個(gè)核苷酸，更典型地至少約40個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少約50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少約75到100個(gè)或更多核苷酸的一段序列上。對SDCMP3比較的測量不反映對SDCMP4的比較測量。
對于序列比較，通常一個(gè)序列作為參比序列，受試序列與該參比序列比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將受試和參比序列輸入計(jì)算機(jī)，如果需要，指定序列坐標(biāo)，并指定序列算法程序參數(shù)。然后序列比較算法基于所指定的程序參數(shù)計(jì)算相對于參比序列，受試序列的百分?jǐn)?shù)序列同一性。
可以對用于比較的序列實(shí)施光學(xué)比對，這可以使用例如，Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2482的局部同源性算法，或者Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443的同源性對比算法、或者Pearson and Lipman(1988)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA852444的方法搜尋相似性，這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)現(xiàn)(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA，和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或者視覺檢查(一般見Ausubel，等人，如前)。
有用的算法的一個(gè)實(shí)例是PILEUP。PILEUP從一組相關(guān)序列產(chǎn)生多序列比對，使用漸進(jìn)性的成對對比來顯示相互關(guān)系和百分?jǐn)?shù)序列同一性。該算法還繪出樹或系統(tǒng)樹，其顯示用于產(chǎn)生比對的聚類關(guān)系。PILEUP使用Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evol.35351-360的漸進(jìn)性比對方法的簡化方法。所用方法類似于Higgins和Sharp(1989)CABIOS5151-153描述的方法。該程序可以比對高達(dá)300個(gè)序列，每個(gè)序列的最大長度為5,000個(gè)核苷酸或氨基酸。該多重比對方法以兩個(gè)最相似的序列的成對比對開始，產(chǎn)生兩個(gè)比對序列的聚類。然后該聚類與下一個(gè)最相關(guān)的序列或者比對序列的聚類相比對。通過兩個(gè)單獨(dú)序列的成對比對的簡單延伸來對比兩個(gè)序列聚類。通過一系列漸進(jìn)性、成對比對實(shí)現(xiàn)最后的比對。指定特定序列和它們的序列比較區(qū)域的氨基酸或核苷酸坐標(biāo)并指定程序參數(shù)后運(yùn)行該程序。例如，可以將參比序列與其他受試序列比較以確定百分?jǐn)?shù)序列同一性關(guān)系，其中使用下面的參數(shù)默認(rèn)缺口權(quán)重(3.00)、默認(rèn)缺口長度權(quán)重(0.10)，和加權(quán)的末端缺口。
適于確定百分?jǐn)?shù)序列同一性和序列相似性的算法的另一實(shí)例是BLAST算法，該算法在Altschul，等人(1990)J.Mol.Biol.215403-410中描述。用于實(shí)施BLAST分析的軟件可公開通過國家生物技術(shù)信息中心(httpwww.ncbi.nhn.nih.gov/)得到。該算法包括通過鑒定查詢序列中的長W的短字首先鑒定高得分序列對(HSPs)，該高得分序列對當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中的相同長度的字對比時(shí)匹配或滿足某一正值閾值得分T。T被稱為相鄰字得分閾值(Altschul，等人，如前)。這些最初鄰域字采樣作為種子啟動(dòng)搜索以發(fā)現(xiàn)含有這些字采樣的更長HSPs。只要累積對比得分可以增加，那么將該字采樣在兩個(gè)方向沿著每個(gè)序列延伸。當(dāng)累積對比得分從所實(shí)現(xiàn)的最大值下降的量為X；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)得分殘基對比的積累，累積得分到達(dá)0或以下；或者到達(dá)一個(gè)序列的末端時(shí)，停止字采樣在每個(gè)方向的延伸。BLAST算法參數(shù)W、T和X確定對比的靈敏性和速度。BLAST程序使用的默認(rèn)值為字長(W)為11、BLOSUM62得分矩陣(見Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA8910915)比對(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝4，和兩個(gè)鏈的比較。
除了計(jì)算百分?jǐn)?shù)序列同一性，BLAST算法還對兩個(gè)序列之間的相似性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(見，例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Nat′lAcad.Sci.USA905873-5787)。BLAST算法提供了相似性的一個(gè)測量是最小和概率(P(N))，其提供了概率的指示，兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間的匹配將通過該概率偶然地發(fā)生。例如，如果在受試核酸和參比核酸的比較中最小和概率小于約0.1，更優(yōu)選小于約0.01，最優(yōu)選小于約0.001，那么認(rèn)為該核酸與參比序列相似。
多肽的兩個(gè)核酸序列基本上相同的另一指示是第一個(gè)核酸編碼的多肽與第二個(gè)核酸編碼的多肽免疫學(xué)交叉反應(yīng)，如下述。從而，例如，當(dāng)兩個(gè)肽僅通過保守置換而不同時(shí)，一種多肽與另一多肽通常基本上相同。兩個(gè)核酸序列基本上相同的另一指示是兩個(gè)分子在嚴(yán)格條件下相互雜交，如下述。
“嚴(yán)格條件”當(dāng)在雜交語境中指同源性或基本相似性時(shí)，是鹽、溫度、有機(jī)溶劑和其他參數(shù)(通常在雜交反應(yīng)中受控的參數(shù))的嚴(yán)格的聯(lián)合條件。參數(shù)的聯(lián)合比任何單一參數(shù)的檢測更重要。見，例如，Wetmur和Davidson(1968)J.Mol.Biol.31349-370。在嚴(yán)格條件下結(jié)合靶核酸的核酸探針對所述靶核酸是特異的。這種探針通常長11個(gè)核苷酸以上，并且在該探針的序列所限定的區(qū)域上與靶核酸足夠相同或互補(bǔ)而在嚴(yán)格雜交條件下結(jié)合靶標(biāo)。通常，陽性信號將顯示出比背景高至少2倍信號，優(yōu)選比背景高至少5倍，更優(yōu)選至少15、25或甚至50倍。
通過密切相關(guān)的物種的種間雜交可以從其他哺乳動(dòng)物，例如，靈長類或嚙齒類物種克隆和分離對應(yīng)的SDCMP蛋白。見，例如，下文。關(guān)系遠(yuǎn)的物種之間相似性可能相對較低，從而關(guān)系相對較近的物種的雜交是可取的。備選地，顯示出較小的物種特異性的抗體制劑可用于表達(dá)克隆方法。
術(shù)語“特異結(jié)合抗體”或者“特異免疫反應(yīng)性”當(dāng)指蛋白質(zhì)或肽時(shí)，指一種結(jié)合反應(yīng)，其確定在異源蛋白質(zhì)群體和其他生物學(xué)組分的存在下該蛋白質(zhì)的存在。從而，在所指定的免疫測定條件下，所指定的抗體結(jié)合特定蛋白并且不顯著結(jié)合樣品中存在的其他蛋白。在這些條件下對抗體的特異結(jié)合可能需要一種抗體，該抗體由于對特定蛋白的特異性而被選中。例如，可以選擇針對具有SEQ ID NO2或10中描繪的氨基酸序列的人SDCMP3蛋白免疫原產(chǎn)生的抗體以得到與SDCMP蛋白并且不與其他蛋白質(zhì)特異免疫反應(yīng)的抗體。這些抗體識別與同源人SDCMP3蛋白高度相似的蛋白。
III.核酸這些SDCMP基因在樹突細(xì)胞上選擇性表達(dá)。如所公開的優(yōu)選實(shí)施方案將用于標(biāo)準(zhǔn)方法中以從其他物種，例如，溫血?jiǎng)游铮瑛B和哺乳動(dòng)物分離基因。交叉雜交將允許從個(gè)體、株系或種分離相關(guān)蛋白?？梢岳迷S多不同方法基于本文提供的信息成功分離適宜的核酸克隆。DNA印跡雜交研究將在適宜的雜交條件下鑒定其他物種中的同源基因。
通過下述標(biāo)準(zhǔn)方法，可以用純化的蛋白或確定的肽產(chǎn)生抗體。合成肽或純化蛋白可以被呈遞到免疫系統(tǒng)以產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體。見，例如，Coligan(1991)Current Protocols in ImmunologyWiley/Greene，NY；和Harlow和Lane(1989)AntibodiesALaboratory ManualCold Spring Harbor Press，NY，它們在此處被并入作為參考。備選地，SDCMP抗原結(jié)合組合物可用作特異結(jié)合試劑，并且可以利用其結(jié)合特異性用于，例如，純化SDCMP蛋白。
特異結(jié)合組合物可用于篩選表達(dá)文庫，該表達(dá)文庫由表達(dá)各自SDCMP蛋白的細(xì)胞系制備?？梢岳迷S多篩選方法，例如，表面表達(dá)的配體的標(biāo)準(zhǔn)染色，或者通過淘選。通過各種染色或免疫熒光方法也可以實(shí)施細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的篩選。結(jié)合組合物可用于親和純化或篩選表達(dá)該抗原的細(xì)胞。
序列分析表明這些SDCMPs是受體的凝集素/脫唾液酸糖蛋白超家族的成員。也見USSN 60/053,080，其在此處被并入作為參考。
對人SDCMP3的分析表明該蛋白是II型膜蛋白，跨膜片段為SEQ IDNO2或10的約殘基22到約t42。胞質(zhì)尾部將在N末端，SEQ ID NO2或10的殘基1到21。C-型凝集素(CRD)結(jié)構(gòu)域相應(yīng)于SEQ ID NO10的約殘基79到219。CRD的特點(diǎn)是在SEQ ID NO10的107、176、194和202位的4個(gè)保守半胱氨酸殘基。此外，CRD具有相應(yīng)于SEQ ID NO10的168-170殘基的谷氨酸-脯氨酸-天冬酰胺序列，該序列預(yù)示著甘露糖、N-乙?；咸前泛推渌嚓P(guān)糖的依賴Ca++的結(jié)合部位。
人蛋白的預(yù)測分子量為約18,500道爾頓，等電點(diǎn)為約6，在pH7下的電荷為約-2.6。親水性分析表明親水性序列的重要節(jié)段為約1-22、42-63、94-106和142-162。這些節(jié)段可能更具抗原性。對小鼠SDCMP3的類似分析表明該蛋白也是II型跨膜蛋白，跨膜節(jié)段為約ser20到thr40。細(xì)胞質(zhì)尾將從約met1到trp19；C-型凝集素結(jié)構(gòu)域?qū)⑾鄳?yīng)于約cys79到至少arg162。兩個(gè)假定的N-糖基化部位相應(yīng)于asn131-ser133和asn183-ser185。通過計(jì)算機(jī)鑒定的人蛋白的尤其具有抗原性的一段序列為約met1-ser18；tyr43-arg53；lys72-ser85；ser94-asn106；和ser135-arg162。見，例如，Beattie，等人(1992)Eur.J.Biochem.21059-66。
對人SDCMP4的分析表明該蛋白是II型膜蛋白。其有兩種形式長形式(SEQ ID NO5和6)和短形式(SEQ ID NO7和8)，其相應(yīng)于長形式的缺失，并且可以從備選的剪接事件得到。序列中分類的變異可以反映測序錯(cuò)誤或等位基因變體。
長形式的預(yù)測的跨膜節(jié)段為約leu45到met67。該蛋白的近氨基部分將在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。通過計(jì)算機(jī)鑒定的人蛋白的尤其具有抗原性的一段序列為約met1到arg44；trp70-thr113；和asn139到cys220。一個(gè)值得注意的特征是基序(YTQL，殘基14-17)向胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域的內(nèi)化。CRD將從長形式的約cys120到met247延伸，從短形式的約cys74到met201延伸。將預(yù)測長形式的分子量為約27.6kD，短形式為約22.5kD，其理論等電點(diǎn)為約4.6，在pH 7下電荷為-7.8。
SDCMP5蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)C-型(Ca++獨(dú)立的)凝集素碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域(CRD)，這通過與其他凝集素的顯著序列同源性所指出。II型跨膜C-型凝集素的原型是肝脫唾液酸糖蛋白-受體(ASGPR)。
肝ASGPR的CRD表現(xiàn)出對半乳糖的結(jié)合特異性。此外，ASGPR的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有基于酪氨酸的基序，其使得配體內(nèi)化。不像ASGPR或者巨噬細(xì)胞甘露糖受體，SDCMP4的CRD序列并不強(qiáng)烈暗示其糖特異性。這種暗示的缺乏也是其他C-型凝集素的特征，如通過NK細(xì)胞上的NGK2受體所例證的。
兩種具體SDCMP4的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域都顯示出YXXΦ型的內(nèi)化序列(YTQL)，其中Φ代表疏水氨基酸。作為參照，肝臟ASGPRH1鏈的內(nèi)化基序是YQDL。
值得注意的是，一些II型跨膜C-型凝集素(例如，人NKG2和DC-IR，小鼠Ly49和NKRP1)是免疫受體超家族(IRS)系統(tǒng)的成員。這些受體的一些形式能夠通過胞內(nèi)ITIM基序遞送抑制信號。相反，其他形式缺少ITIM基序，并且同樣不傳輸負(fù)信號。這種非抑制性IRS成員的一個(gè)標(biāo)志是在跨膜區(qū)內(nèi)存在帶電氨基酸。備選地，截?cái)嘈问娇梢耘c跨膜附屬分子相互作用。見，例如，Lanier，等人，(1998)Nature391703-7；和USSN 60/069,639，它們都在此處被并入作為參考。
SDCMP4既不在其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中顯示出ITIM基序，也沒有帶電的跨膜殘基?；诖耍坪鮏DCMP4不可能定義C型凝集素IRS基因的新家族。相反，可以認(rèn)為SDCMP4與參與配體內(nèi)化的分子的ASGPR系統(tǒng)有關(guān)。
已經(jīng)鑒定了兩種形式的SDCMP4，它們的區(qū)別是在胞外結(jié)構(gòu)域中存在46個(gè)氨基酸近膜插入片段。在該區(qū)域的插入也在巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞(ETA10)ASGPR中發(fā)生。
最后，通過RT-PCR在骨髓細(xì)胞(樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞，和粒細(xì)胞)中已經(jīng)觀察到SDCMP4的表達(dá)。與SDCMP3相比，被PMA和離子霉素活化后DC中SDCMP4的表達(dá)不被下調(diào)。
與這些序列相近的序列是ETA10序列。見，例如，Suzuki，等人(1996)J.Immunol.156128-135；和Sato，等人(1992)J.Biochem.111331-336。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出許多特征，這些特征表明該結(jié)構(gòu)域是C型(Ca++依賴的)碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域(CRD)。盡管人形式的CRD似乎在其羧基末端被截?cái)啵切∈笸滴?1469D4)的CRD未被截?cái)嗖⑶颐鞔_地將該凝集素分類為C-型超家族的一個(gè)新成員。
C型跨膜II型凝集素的原型是肝脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)。然而，ASGPR含有胞質(zhì)內(nèi)基于酪氨酸的配體內(nèi)化序列，該序列在人或小鼠SDCMP3中均未發(fā)現(xiàn)。編碼人SDCMP3的基因定位于染色體12 p12-13，例如，人NK受體復(fù)合體中。值得注意地，該區(qū)域包括NKG2基因和CD94基因，這些基因編碼C型跨膜II型凝集素并且代表免疫受體超家族(IRS)系統(tǒng)的實(shí)例。從而，殺傷細(xì)胞抑制受體(KIR)CD94-NKG2A/B異二聚體通過NKG2序列中細(xì)胞內(nèi)基于酪氨酸的ITIM基序轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)信號。然而，NKG2的另一種形式缺少ITIM基序，并且用CD94產(chǎn)生的異二聚體無抑制性。
人SDCMP3的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域不含有ITIM基序。然而，基于其染色體定位，以及其與IRS基因DC-IR的顯著(36.2％)同源性，預(yù)測人SDCMP3是IRS基因的新型C型凝集素家族。由于與其他IRS基因類似，所以SDCMP3可能代表一個(gè)基因家族，該家族將含有一些成員，這些成員有抑制(ITIM)或者無抑制功能。
通過RT-PCR，將靈長類SDCMP3表達(dá)限制在骨髓細(xì)胞中，該表達(dá)在樹突細(xì)胞(DC)、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中觀察到。選擇性地在CD14-衍生的DC而沒有在CD1a-衍生的朗格漢斯型DC中看到表達(dá)。最后，用PMA與離子霉素激活可以下調(diào)SDCMP3的表達(dá)。
該肽節(jié)段也可用于設(shè)計(jì)和產(chǎn)生適宜的寡核苷酸用以篩選文庫而確定類似基因，例如，相同或多態(tài)性變體的存在，或者鑒定DC。遺傳密碼可用于選擇適宜的寡核苷酸以用作篩選的探針。與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)聯(lián)合，合成的寡核苷酸將用于從文庫選擇所希望的克隆。
互補(bǔ)序列將也可以用作探針或引物。基于可能的氨基末端的鑒定，其他肽將尤其有用，例如，與錨定載體或者多聚A互補(bǔ)PCR技術(shù)或者與其他肽的互補(bǔ)DNA偶聯(lián)。
關(guān)于編碼這些DC蛋白的基因的核酸操作的技術(shù)，例如，將編碼多肽的核酸序列亞克隆到表達(dá)載體、標(biāo)記探針、DNA雜交等一般在Sambrook，等人(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版)卷1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Press，NY中描述，其在此處被并入作為參考并且在下文中被稱為“Sambrook，等人”。還見，Coligan，等人(1987和定期增刊)Current Protocols in Molecular BiologyGreene/Wiley，New York，NY，將其稱為“Coligan，等人”。
有各種方法可用于分離編碼這些DC蛋白的DNA序列。例如，使用標(biāo)記的寡核苷酸探針從基因組或cDNA文庫分離DNA，該探針具有與此處公開的序列相同或互補(bǔ)的序列。可以使用全長探針，或者通過將所公開的序列與其他蛋白相比較并選擇特異引物產(chǎn)生寡核苷酸探針。這些探針可直接用于雜交測定中以分離編碼DC蛋白的DNA，或者可以設(shè)計(jì)探針以用于擴(kuò)增技術(shù)如PCR，用以分離編碼DC蛋白的DNA。
為了制備cDNA文庫，從表達(dá)DC蛋白的細(xì)胞分離mRNA。從mRNA制備cDNA并將其連接到重組載體。將該載體轉(zhuǎn)染到重組宿主中以增殖、篩選和克隆。制備和篩選DNA文庫的方法是熟知的。見Gubler和Hoffman(1983)Gene 25263-269；Sambrook，等人；或Coligan，等人。
對于基因組文庫，可以從組織提取DNA并將其機(jī)械剪切或用酶消化以產(chǎn)生約12-20kb的片段。然后將片段通過梯度離心并克隆到λ噬菌體載體中。這些載體和噬菌體在體外包裝，如，例如，Sambrook，等人，或Coligan等人中描述的。通過Benton和Davis(1977)Science196180-182中描述的噬菌斑雜交分析重組噬菌體。通常如在例如，Grunstein，等人(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 723961-3965中描述的實(shí)施菌落雜交。
可以在cDNA或基因組文庫中鑒定編碼DC蛋白的DNA，這可通過該DNA能夠在例如，菌落或噬菌斑雜交實(shí)驗(yàn)中與此處描述的核酸探針雜交進(jìn)行鑒定。通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法分離相應(yīng)DNA區(qū)域。見Sambrook等人。
擴(kuò)增靶序列的各種方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，也可用于制備編碼DC蛋白的DNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)被用于從mRNA、cDNA和從基因組文庫或cDNA文庫直接擴(kuò)增這些核酸序列。分離的編碼DC蛋白的序列也可用作PCR擴(kuò)增的模板。
在PCR技術(shù)中，合成與所要擴(kuò)增的DNA區(qū)域中的兩個(gè)5’區(qū)互補(bǔ)的寡核苷酸引物。然后使用這兩種引物實(shí)施聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。見Innis，等人(編者1990)PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplicationsAcademic Press，San Diego，CA。如所希望的，可以選擇引物擴(kuò)增編碼所選全長DC蛋白的完整區(qū)域或者擴(kuò)增更小的DNA片段。具體地，所提供的序列提供了例如，15-30個(gè)核苷酸的引物，這些引物可用于擴(kuò)增所希望的編碼序列，或者其片段。一旦這些區(qū)域被PCR擴(kuò)增，可以對它們測序并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從所得序列制備寡核苷酸探針。然后用這些探針分離編碼DC蛋白的其他形式的DNA。
根據(jù)首先由Beaucage和Carruthers(1983)Tetrahedron Lett.221859-1862描述的固相亞磷酰胺三酯方法或者使用如Needham-VanDevanter，等人(1984)Nucleic Acids Res.126159-6168中描述的自動(dòng)化合成儀化學(xué)合成用作探針的寡核苷酸。通過例如，非變性丙烯酰胺凝膠電泳或通過如Pearson和Regnier(1983)J.Chrom.255137-149中描述的離子交換HPLC實(shí)施寡核苷酸純化。使用Maxam和Gilbert在Grossman和Moldave(編者1980)Methods inEnzymology65499-560 Academic Press，New York中的描述的化學(xué)降解方法可以驗(yàn)證合成的寡核苷酸的序列。
本發(fā)明提供了編碼DC蛋白的分離的DNA或片段，如所述。此外，本發(fā)明提供了分離的或重組DNA，其編碼生物活性蛋白或者多肽，該DNA在適宜條件例如，高嚴(yán)格條件下能夠與此處描述的DNA序列雜交。所述生物活性蛋白或者多肽可以是天然發(fā)生的形式，或者重組蛋白或片段，并且具有如SEQ ID NO2、4、6、8或10中公開的氨基酸序列。優(yōu)選實(shí)施方案將是全長天然分離物(例如，來自靈長類的分離物)。在糖基化形式中，該蛋白將顯示出更大的大小。此外，本發(fā)明包括使用分離的或重組DNA，或者其片段，該DNA或者該片段編碼與每種各自DC蛋白同源的蛋白。這些SDCMP3和4的片段與抗-CD3抗體聯(lián)合可以共刺激細(xì)胞，例如，樹突細(xì)胞或T細(xì)胞。該活化可以與抗原聯(lián)合。所分離的DNA可以在5’和3’側(cè)翼中具有各自調(diào)節(jié)序列，例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多聚A加入信號，等等。
本發(fā)明包括DC多核苷酸序列，該序列與在正常細(xì)胞中的表達(dá)相比可以以改變的方式表達(dá)，因此，可能設(shè)計(jì)針對這些序列的適宜的治療或診斷技術(shù)。從而，當(dāng)一種失調(diào)與DC核酸的表達(dá)相關(guān)時(shí)，可以使用在翻譯水平上干擾DC表達(dá)的序列。該方法利用了，例如，反義核酸，包括導(dǎo)入雙鏈RNA(dsRNA)以遺傳干擾基因功能，如例如，在Misquitta，等人(1999)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA961451-1456中描述，和核酶以阻斷特定DC mRNA的翻譯。這些失調(diào)包括與表達(dá)錯(cuò)誤調(diào)節(jié)相關(guān)的失調(diào)。
反義核酸是DNA或RNA分子，例如，至少與特定mRNA分子的一部分互補(bǔ)的寡脫氧核糖核苷酸，見Weintraub(1990)ScientificAmerican26240-46。寡脫氧核糖核苷酸能夠以可飽和的、序列獨(dú)立的，和溫度與能量獨(dú)立的方式進(jìn)入細(xì)胞。見，例如，Jaroszewski和Cohen.(1991)Advanced Drug Delivery Reviews6235-250；Akhtar，等人(1992)“反義寡核苷酸的生物穩(wěn)定性和膜轉(zhuǎn)運(yùn)性質(zhì)的藥學(xué)方面”，133-145頁，Erickson和Izant(編者)Gene RegulationBiology of Antisense RNA and DNARaven Press，New York；和Zhao，等人(1994)Blood 843660-3666。
已經(jīng)表明一些免疫細(xì)胞，例如，淋巴細(xì)胞中寡脫氧核糖核苷酸的攝入受到細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)。用B細(xì)胞有絲分裂原LPS刺激的脾細(xì)胞顯著增強(qiáng)了B細(xì)胞群體中寡脫氧核糖核苷酸攝入，而用T細(xì)胞有絲分裂原ConA處理的脾細(xì)胞表現(xiàn)出T但不是B細(xì)胞增加的寡脫氧核糖核苷酸攝入。見，例如，Krieg，等人，(1991)Antisense Research andDevelopment1161-171。
使用反義方法抑制基因的體外翻譯是本領(lǐng)域中熟知的。見，例如，Marcus-Sakura(1988)Anal.Biochem172289-295；和Akhtar(編者1995)Delivery Strategies for AntisenseOligonucleotideTherapeuticsCRC Press，Inc。
核酶是能夠以類似于DNA限制性內(nèi)切酶的方式特異切割其他單鏈RNA的RNA分子。通過編碼這些RNA的核苷酸序列的修飾，可以工程化分子，這些分子特異識別RNA分子中的特定核苷酸序列并將其切割。見，例如，Cech(1988)J.Amer.Med.Assn.2603030-3034。該方法的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是因?yàn)樗鼈兪切蛄刑禺惖?，所以僅具有特定序列的mRNA被失活。
有兩種基本類型的核酶，即，四膜蟲型和“錘頭”型。見，例如，Haseloff(1988)Nature334585-591。四膜蟲型核酶識別長為4個(gè)堿基的序列，而“錘頭”型核酶識別長為11-18個(gè)堿基的堿基序列。識別序列越長，該序列僅在靶mRNA種類中發(fā)生的可能性越大。因此，錘頭型核酶比四膜蟲型核酶優(yōu)選用于失活特定mRNA種類，并且18堿基識別比更短的識別序列優(yōu)選。
IV.制備DC基因產(chǎn)物通過化學(xué)合成、篩選cDNA文庫，或者通過篩選從各種細(xì)胞系或組織樣品制備的基因組文庫可以得到編碼這些DC蛋白或其片段的DNA。
這些DNA可以在各種宿主細(xì)胞中表達(dá)以合成全長蛋白或片段，該全長蛋白或片段可以，例如，用于產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體；用于結(jié)合研究；用于構(gòu)建和表達(dá)修飾分子；和用于結(jié)構(gòu)/功能研究。這些DC蛋白或它們的片段的每一種都可以在用適宜的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中表達(dá)。這些分子可被基本上純化而沒有蛋白質(zhì)或細(xì)胞污染物，不同于從重組宿主得到的那些分子，并且因此當(dāng)與藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑組合時(shí)可用于藥物組合物。該抗原，或者其部分可以作為與其他蛋白的融合蛋白表達(dá)。
表達(dá)載體通常是自身復(fù)制的DNA或RNA構(gòu)建體，其含有所希望的DC基因或其片段，該DC基因或其片段通常與適宜的遺傳控制元件可操作地連接，這些遺傳控制元件在適宜的宿主細(xì)胞中被識別。這些控制元件能夠在適宜宿主中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。實(shí)現(xiàn)表達(dá)所需的控制元件的特定類型將取決于所用的最終宿主細(xì)胞。通常，遺傳控制元件可以包括原核啟動(dòng)子系統(tǒng)或真核啟動(dòng)子表達(dá)控制系統(tǒng)，并且通常包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，和任選操縱子用以控制轉(zhuǎn)錄的開始，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子用以升高mRNA表達(dá)水平，編碼適宜的核糖體結(jié)合部位的序列，和終止轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列。表達(dá)載體通常還含有復(fù)制原點(diǎn)，其允許載體獨(dú)立于宿主細(xì)胞復(fù)制。
本發(fā)明的載體含有編碼各種DC蛋白的DNA，或其片段，通常編碼例如，生物活性多肽，或蛋白。該DNA可處于病毒啟動(dòng)子的控制下并且可以編碼選擇標(biāo)記。本發(fā)明還涉及這些表達(dá)載體的用途，該載體能夠在原核或真核宿主中表達(dá)編碼DC蛋白的真核cDNA，其中該載體與宿主相容并且其中編碼該蛋白的真核cDNA被插入到載體中，從而含有該載體的宿主的生長表達(dá)所述cDNA。通常，設(shè)計(jì)表達(dá)載體以在它們的宿主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制或者擴(kuò)增而極大地增加每個(gè)細(xì)胞所希望的基因的拷貝總數(shù)。不必總是要求表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制，例如，使用不含有被宿主細(xì)胞識別的復(fù)制原點(diǎn)的載體可以實(shí)現(xiàn)在各種宿主細(xì)胞中該蛋白質(zhì)或其片段的瞬時(shí)表達(dá)?？赡苁褂幂d體，該載體通過重組導(dǎo)致DC基因或其片段整合到宿主DNA中，或者整合啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子控制內(nèi)源基因的表達(dá)。見，例如，Treco，等人，WO96/29411。
如此處所用的，載體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、可整合的DNA片段，和能夠?qū)NA片段整合到宿主基因組的其他載體。表達(dá)載體是專門的載體，它們含有遺傳控制元件，這些元件可以實(shí)現(xiàn)可操作地連接的基因的表達(dá)。質(zhì)粒是最通常使用的載體形式，但是起等價(jià)功能的載體的所有其他形式也適于用于此處。見，例如，Pouwels，等人(1985和增刊)Cloning VectorsA Laboratory ManualElsevier，N.Y.；和Rodriguez，等人(編者1988)VectorsA Survey of MolecularCloning Vectors and Their UsesButtersworth，Boston，MA。
適宜的宿主細(xì)胞包括原核生物、低級真核生物，和高級真核生物。原核生物包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性生物，例如，大腸桿菌(E.coli)和枯草桿菌(B.subtilis)。低級真核生物包括酵母，例如，釀酒酵母(S.cerevisiae)和畢赤酵母(S.Pichia)，和Dictyostelium屬的種。高級真核生物包括從動(dòng)物細(xì)胞建立的組織培養(yǎng)細(xì)胞系，這些動(dòng)物細(xì)胞來自非哺乳動(dòng)物來源，例如，昆蟲細(xì)胞，和鳥類，還來自哺乳動(dòng)物來源，例如，人、靈長類、和嚙齒類。
原核宿主載體系統(tǒng)包括許多不同物種的各種載體。如此處所用的，將一般地使用大腸桿菌和其載體以包括用于其他原核生物的等價(jià)載體。用于擴(kuò)增DNA的一種代表性載體是pBR322或其衍生載體?？捎糜诒磉_(dá)DC蛋白或片段的載體包括，但不限于，含有l(wèi)ac啟動(dòng)子的載體(pUC-系列)；含有trp啟動(dòng)子的載體(pBR322-trp)；含有Ipp的啟動(dòng)子(pIN-系列)、含有λ-pP或pR啟動(dòng)子的載體(pOTS)；或者含有雜交啟動(dòng)子如ptac的載體(pDR540)。見，Brosius，等人(1998)“使用λ-、trp-、lac-、和Ipp-衍生的啟動(dòng)子的表達(dá)載體”，Rodriguez和Denhardt(編者)VectorsA Survey of MolecularCloning Vectors and Their Uses10205-236，Buttersworth，Boston，MA。
可以用含有DC基因序列的載體轉(zhuǎn)化低級真核生物，例如，酵母和Dictyostelium。為了本發(fā)明的目的，最常用的低級真核生物宿主是面包酵母釀酒酵母。其將通常代表低級真核生物，盡管也可以利用許多其他株系和物種。酵母載體通常由復(fù)制原點(diǎn)(除非整合型)、選擇基因、啟動(dòng)子、編碼所希望的蛋白的DNA或者其片段、翻譯終止序列、多腺苷酸化序列、和轉(zhuǎn)錄終止序列組成。酵母的適宜表達(dá)載體包括組成性啟動(dòng)子，如3-磷酸甘油酸激酶和各種其他糖酵解酶基因啟動(dòng)子或者可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如乙醇脫氫酶2啟動(dòng)子或者金屬硫蛋白啟動(dòng)子。適宜的載體包括下列類型的衍生物自復(fù)制低拷貝數(shù)(如YRp-系列)、自復(fù)制高拷貝數(shù)(如YEp-系列)、整合型(如YIp-系列)，或者微-染色體(如YCp-系列)。
高級真核生物組織培養(yǎng)細(xì)胞是用于DC蛋白表達(dá)的優(yōu)選宿主細(xì)胞。原則上，可以使用多數(shù)任一高級真核生物組織培養(yǎng)細(xì)胞系，例如，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，該細(xì)胞系可來自無脊椎動(dòng)物或脊椎動(dòng)物來源。然而，優(yōu)選用哺乳動(dòng)物細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)共翻譯時(shí)或翻譯后的正確加工。這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染和增殖是常規(guī)的?？捎玫募?xì)胞系包括HeLa細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系、幼大鼠腎(BRK)細(xì)胞系、昆蟲細(xì)胞系、鳥細(xì)胞系、和猴(COS)細(xì)胞系。這些細(xì)胞系的表達(dá)載體通常包括復(fù)制原點(diǎn)、啟動(dòng)子、翻譯起始位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)(例如，如果使用基因組DNA)、多腺苷酸化位點(diǎn)、和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。這些載體可以還含有選擇基因或擴(kuò)增基因。適宜的表達(dá)載體可以是質(zhì)粒、病毒，或逆轉(zhuǎn)錄病毒，這些質(zhì)粒、病毒，或逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶來自如例如，腺病毒、SV40、細(xì)小病毒、牛痘病毒或巨細(xì)胞病毒來源的啟動(dòng)子。適宜的表達(dá)載體的代表性實(shí)例包括pCDNA1、pCD，見Okayama，等人(1985)Mol.Cell Biol.51136-1142；pMC1 neo Poly-A，見Thomas，等人(1987)Cell51503-512；和桿狀病毒載體，如pAC373或pAC 610。此外，通過基因打靶可以調(diào)節(jié)DC基因的上游非編碼區(qū)或者DC基因內(nèi)的編碼或非編碼序列，在基因靶定中產(chǎn)生新的DC轉(zhuǎn)錄單位，其表達(dá)DC蛋白。例如，通過增加細(xì)胞中所表達(dá)的基因的表達(dá)、改變調(diào)節(jié)模式或誘導(dǎo)或減少或消除基因的表達(dá)導(dǎo)入和靶定調(diào)節(jié)DC蛋白的外源序列在例如，標(biāo)題為“蛋白質(zhì)產(chǎn)生和遞送”的Treco等人(1998)WO96/29411中描述。
在一些實(shí)施方案中，DC蛋白不必糖基化以在一些測定中引起生物學(xué)應(yīng)答。然而，通常希望在一些系統(tǒng)中表達(dá)DC多肽，該系統(tǒng)提供特定或明確的糖基化模式。在該情況中，通常的模式將是該表達(dá)系統(tǒng)天然提供的模式。然而，通過將例如，未糖基化形式的多肽暴露于導(dǎo)入異源表達(dá)系統(tǒng)的適宜的糖基化蛋白可以修改該模式。例如，可以用編碼哺乳動(dòng)物或其他的糖基化酶的一種或多種基因共轉(zhuǎn)化DC基因。還理解過度糖基化對于DC蛋白的生物學(xué)活性是有害的，并且技術(shù)人員可以進(jìn)行常規(guī)試驗(yàn)以優(yōu)化糖基化程度，該優(yōu)化的糖基化程度賦予最佳生物學(xué)活性。
可以將DC蛋白，或者其片段工程化以通過磷脂酰肌醇(PI)連接到細(xì)胞膜，但是通過用磷脂酰肌醇切割酶，例如，磷脂酰肌醇磷脂酶C處理可以從細(xì)胞膜除去DC蛋白，或者其片段。這釋放了生物學(xué)活性形式的抗原，并允許通過蛋白質(zhì)化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行純化。見，例如，Low(1989)Biochem.Biophys.Acta988427-454；Tse，等人(1985)Science2301003-1008；Brunner，等人(1991)J.Cell Biol.1141275-1283；和Coligan，等人(編者)(1996和定期增刊)CurrentProtocols in Protein Science，John Wiley and Sons，New York，NY。
既然已經(jīng)表征了這些SDCMP蛋白，那么通過合成肽的常規(guī)方法可以制備其片段或衍生物。這些方法包括如在Stewart和Young(1984)Solid Phase Peptide SynthesisPierce Chemical Co.，Rockford，IL；Bodanszky和Bodanszky(1984)The Practice of PeptideSynthesisSpringer-Verlag，New York，NY；和Bodanszky(1984)The Principles of Peptide SynthesisSpringer-Verlag，New York，NY中描述的方法。還見Merrifield(1986)Science232341-347；和Dawson，等人(1994)Science266776-779。例如，可以使用疊氮化物方法、?；确椒ā⑺狒椒?、混合酸酐方法、活性酯方法(例如，對-硝基苯酯、N-羥基琥珀酰亞胺酯，或氰基甲酯)、碳二咪唑方法、氧化-還原方法、或二環(huán)己基碳二亞胺(DCCD)/加成法。固相和液相合成都可用于前面的方法。
通過肽分離，例如，通過提取、沉淀、電泳和各種形式的層析等可以從反應(yīng)混合物分離和純化所制備的蛋白質(zhì)和其片段。根據(jù)所希望的用途，可以得到不同純度的本發(fā)明的DC蛋白。使用公知的蛋白質(zhì)純化技術(shù)或者通過使用此處描述的抗體或結(jié)合配偶體，例如，在免疫吸附親和層析中完成純化。該免疫吸附親和層析的實(shí)施過程為首先將抗體連接到固體支持體并將所連接的抗體與適宜的來源細(xì)胞的可溶裂解物、表達(dá)該蛋白的其他細(xì)胞的裂解物，或者由于DNA技術(shù)而產(chǎn)生這些蛋白的細(xì)胞的裂解物或上清液接觸，見下文。
可以對多種細(xì)胞系篩選一種與其他細(xì)胞相比高水平表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞系。對各種細(xì)胞系，例如，小鼠胸腺基質(zhì)細(xì)胞系TA4進(jìn)行篩選并由于其有利的操作性質(zhì)而被選中。可以從天然來源分離天然DC細(xì)胞蛋白，或者通過用適宜的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的表達(dá)得到天然DC細(xì)胞蛋白。所表達(dá)蛋白的純化可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)現(xiàn)，或者可以與工程化方法聯(lián)合以從細(xì)胞裂解物或上清液以高效率有效純化。FLAG或His片段可用于這些純化特征。
V.抗體可以針對各種DC蛋白產(chǎn)生抗體，這些DC蛋白包括個(gè)體的、多態(tài)性、等位基因的、株系或物種變體，和它們的片段，這些蛋白和它們的片段可以是天然發(fā)生的(全長)形式或者重組形式。此外，可以針對活性形式或者失活形式產(chǎn)生抗體。也可使用抗獨(dú)特型抗體。
a.抗體制備許多免疫原可用于制備與這些DC蛋白具有特異反應(yīng)性的抗體。重組蛋白是產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體的優(yōu)選免疫原。也可以使用純的或不純形式的天然發(fā)生的蛋白。使用此處描述的人DC蛋白序列制備的合成肽也可用作免疫原以產(chǎn)生DC蛋白的抗體?？梢栽谌绱颂幟枋龅恼婧嘶蛟思?xì)胞中表達(dá)并如所描述的純化重組蛋白。然后將產(chǎn)物注射到能夠產(chǎn)生抗體的動(dòng)物中?？梢援a(chǎn)生單克隆或多克隆抗體以隨后用于免疫測定中以測量該蛋白。
產(chǎn)生多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的。簡言之，將免疫原，優(yōu)選純化蛋白與佐劑混合并用該混合物免疫動(dòng)物。通過采集待測血并確定對目標(biāo)DC蛋白的反應(yīng)性的效價(jià)監(jiān)視動(dòng)物對免疫制劑的免疫應(yīng)答。當(dāng)?shù)玫綄υ撁庖咴倪m當(dāng)高的效價(jià)抗體時(shí)，從該動(dòng)物收集血液并制備抗血清。如果希望，可以將抗血清分級分離以富集對該蛋白具有反應(yīng)性的抗體。見，例如，Harlow和Lane。
通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員熟悉的各種技術(shù)可以得到單克隆抗體。簡言之，用所希望的抗原免疫動(dòng)物，從該動(dòng)物得到脾細(xì)胞，并通常通過與骨髓瘤細(xì)胞融合使脾細(xì)胞永生化。見，例如，Kohler和Milstein(1976)Eur.J.Immunol.6511-519，其在此處被并入作為參考。永生化的備選方法包括用EB病毒、癌基因或逆轉(zhuǎn)錄病毒或本領(lǐng)域中公知的其他方法轉(zhuǎn)化。對從單一永生化細(xì)胞產(chǎn)生的菌落進(jìn)行篩選能夠產(chǎn)生對該抗原具有所希望的特異性和親和性的菌落，并且這些細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的產(chǎn)率可以通過各種技術(shù)提高，這些技術(shù)包括注射到脊椎動(dòng)物宿主的腹膜腔。備選地，通過根據(jù)Huse，等人(1989)Science2461275-1281所概述的一般方案從人B細(xì)胞篩選DNA文庫可以分離編碼單克隆抗體或者其結(jié)合片段的DNA序列。
通過將這些DC蛋白的預(yù)定片段與如上述的載體蛋白的綴合物免疫動(dòng)物可以產(chǎn)生針對這些DC蛋白的預(yù)定片段的抗體，包括結(jié)合片段和單鏈形式的抗體。從分泌所希望的抗體的細(xì)胞制備單克隆抗體?？梢詫@些抗體篩選與正?；蛴腥毕莸腄C蛋白的結(jié)合，或者篩選激動(dòng)劑或拮抗劑活性。這些單克隆抗體結(jié)合的KD為通常至少約1mM，更通常至少約300μM，典型地至少約10μM，更典型地至少約30μM，優(yōu)選至少約10μM，更優(yōu)選至少約3μM或以上。
在一些情況中，希望從各種哺乳動(dòng)物宿主，如小鼠、嚙齒類、靈長類、人等制備單克隆抗體。制備這些單克隆抗體的技術(shù)的描述可以見Stites，等人(編者)Basic and Clinical Immunology(第四版)Lange Medical Publications，Los Altos，CA，和其中引用的參考文獻(xiàn)；Harlow和Lane(1988)AntibodiesA Laboratory ManualCSHPress；Goding(1986)Monoclonal AntibodiesPrinciples andPractice(第二版)Academic Press，New York，NY；尤其Kohler和Milstein(1975)Nature256495-497，其討論了產(chǎn)生單克隆抗體的一種方法。簡單總結(jié)，該方法包括用免疫原注射動(dòng)物以引起體液免疫應(yīng)答。然后處死動(dòng)物并從其脾臟取出細(xì)胞，然后將該細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。得到雜交細(xì)胞，或者“雜交瘤”，其能夠體外增殖。然后篩選雜交瘤群體以分離單個(gè)克隆，每個(gè)克隆分泌針對該免疫原的單一抗體種類。這樣，所得單個(gè)抗體種類是來自免疫動(dòng)物的永生化和克隆的單一B細(xì)胞應(yīng)答免疫原物質(zhì)上所識別的特定部位的產(chǎn)物。
其他適宜的技術(shù)包括選擇噬菌體或類似載體中抗體的文庫。見，Huse，等人(1989)“在λ噬菌體中產(chǎn)生免疫球蛋白所有組成成分的大組合文庫”Science 2461275-1281；和Ward，等人(1989)Nature 341544-546。所用的本發(fā)明的多肽和抗體可以被修飾或不被修飾，包括嵌合或人源化抗體。通常，該多肽和抗體將通過共價(jià)或非共價(jià)連接提供可檢測的信號的一種物質(zhì)而被標(biāo)記。各種標(biāo)記和綴合技術(shù)是公知的并且在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中被廣泛報(bào)導(dǎo)。適宜的標(biāo)記包括放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光部分、化學(xué)發(fā)光部分、磁性微粒，等等。教導(dǎo)這些標(biāo)記的使用的專利包括美國專利號3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149、和4,366,241。還可以產(chǎn)生重組免疫球蛋白。見，Cabilly，美國專利號4,816,567；和Queen，等人(1989)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA8610029-10033。
本發(fā)明的抗體也可用于親和層析以分離每種DC蛋白。當(dāng)抗體連接到固體支持體，例如，微粒，如瓊脂糖、SEPHADEX，等時(shí)，可以制備柱子，其中細(xì)胞裂解物可以穿過該柱子，洗滌柱子，然后增加溫和變性劑的濃度，從而，將釋放純化的DC蛋白。
該抗體還可用于篩選表達(dá)文庫的特定表達(dá)產(chǎn)物。通常，用于這種方法的抗體將被某一部分標(biāo)記，該部分允許通過抗體結(jié)合容易地檢測抗原的存在。
SDCMP蛋白的抗體可用于分析，或者鑒定表達(dá)各自蛋白的特定細(xì)胞群體組分。通過測定表達(dá)DC蛋白的細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物，可能診斷疾病，例如，免疫-受損的病癥、DC衰竭病癥，或DC的過量產(chǎn)生。
針對每種DC產(chǎn)生的抗體也可用于產(chǎn)生抗-獨(dú)特型抗體?？?獨(dú)特型抗體將可用于檢測或診斷與各自抗原的表達(dá)有關(guān)的各種免疫學(xué)病癥。
b.人源化非人來源的使用可以限制單克隆抗體的治療效率。來自鼠或其他非人來源的抗體可以引起免疫應(yīng)答，效應(yīng)物功能的低效募集，和從血流的快速清除(Baca，等人(1997)J.Biol.Chem.27210678-10684)。由于這些原因，希望通過人源化(Carpenter，等人(2000)J.Immunol.1656205；He，等人(1998)J.Immunol.1601029；Tang，等人(1999)J.Biol.Chem.27427371-27378)制備治療抗體。人源化抗體含有來自親本小鼠抗體的6個(gè)互補(bǔ)確定區(qū)(CDRs)的氨基酸序列，這些序列被嫁接到人抗體框架上。為了實(shí)現(xiàn)最優(yōu)結(jié)合，可能需要通過改變通常與維持CDRs的構(gòu)象有關(guān)的某些框架氨基酸，將人源化抗體微調(diào)回到在親本小鼠抗體中發(fā)現(xiàn)的相應(yīng)氨基酸。
人源化的一個(gè)備選方案是使用噬菌體上展示的人抗體文庫(Vaughan，等人(1996)Nat.Biotechnol.14309-314；Barbas(1995)Nature Med.1837-839；de Haard，等人(1999)J.Biol.Chem.27418218-18230；McCafferty等人(1990)Nature348552-554；Clackson等人(1991)Nature352624-628；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222581-597)，或轉(zhuǎn)基因小鼠中所含的人抗體文庫(Mendez，等人(1997)Nature Genet.15146-156)。噬菌體展示技術(shù)可用于篩選和選擇具有高結(jié)合親和性的抗體(Hoogenboom和Chames(2000)Immunol.Today 21371-377；Barbas，等人(2001)Phage DisplayA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Kay，等人(1996)Phage Display of Peptides and ProteinsALaboratory Manual，Academic Press，San Diego，CA)。使用噬菌體展示方法可以提供一種DNA序列，其提供緊密結(jié)合的單價(jià)抗體，如在絲狀噬菌體的表面上展示的。使用該DNA序列，研究人員可以構(gòu)造緊密結(jié)合的人源化二價(jià)抗體。噬菌體展示文庫可以含有單鏈抗體，其中重鏈和輕鏈可變區(qū)通過連接體融合于單一基因中，或者該單鏈抗體可以含有共表達(dá)的重鏈和輕鏈(de Bruin，等人(1999)Nat.Biotechnol.17397-399)。
c.免疫測定通過各種免疫測定法可以測量具體蛋白。關(guān)于一般的免疫學(xué)和免疫測定方法的綜述，見Stites和Terr(編者)1991 Basic andClinical Immunology(第7版)。此外，本發(fā)明的免疫測定可以以幾種方法的任一種實(shí)施，這些方法在Maggio(編者1980)EnzymeImmunoassayCRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida；Tijssen(1985)″Practice and Theory of EnzymeAntibodies，A LaboratoryManual，如前廣泛綜述，這些文獻(xiàn)的每一個(gè)都被并入本文作為參考。還見Chan(等人)(1987)ImmunoassayA Practical GuideAcademic Press，Orlando，F(xiàn)L；Price和Newman(編者)(1991)Principles and Practice of linmunoassaysStockton Press，NY；和Ngo(編者1988)Non-isotopic ImmunoassaysPlenum Press，NY。
通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的各種方法可以實(shí)施免疫測定以測量這些DC蛋白。簡言之，測量該蛋白的免疫測定可以是競爭性或非競爭性結(jié)合測定。在競爭性結(jié)合測定中，所要分析的樣品與被標(biāo)記的分析物競爭結(jié)合到固體表面的捕獲劑的特異結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選地，捕獲劑是與如上述產(chǎn)生的DC蛋白特異反應(yīng)的抗體。結(jié)合到捕獲劑的標(biāo)記分析物的濃度與樣品中存在的游離分析物的量成反比例。
在競爭性結(jié)合免疫測定中，樣品中存在的DC蛋白與標(biāo)記蛋白競爭結(jié)合特異結(jié)合劑，例如，與DC蛋白特異反應(yīng)的抗體。該結(jié)合劑可以結(jié)合到固體表面以實(shí)現(xiàn)結(jié)合的標(biāo)記蛋白與未結(jié)合的標(biāo)記蛋白的分離。備選地，競爭結(jié)合測定測定可以在液相中實(shí)施，并且可以用本領(lǐng)域中公知的各種技術(shù)將結(jié)合的標(biāo)記蛋白與未結(jié)合的標(biāo)記蛋白分離。分離后，確定結(jié)合的標(biāo)記蛋白的量。樣品中存在的蛋白質(zhì)的量與標(biāo)記的蛋白質(zhì)結(jié)合的量成反比例。
備選地，可以實(shí)施同質(zhì)免疫測定，其中不需要分離步驟。在這些免疫測定中，通過蛋白質(zhì)與其特異結(jié)合劑的結(jié)合而改變該蛋白質(zhì)上的標(biāo)記。標(biāo)記蛋白中的該改變導(dǎo)致標(biāo)記所發(fā)出的信號的減少或增加，從而測量免疫測定末的標(biāo)記就可以檢測或者定量該蛋白質(zhì)。
通過各種非競爭性免疫測定方法也可以定量確定這些DC蛋白。例如，可以使用兩位點(diǎn)、固相夾心免疫測定。在這種類型的測定中，蛋白質(zhì)的結(jié)合劑，例如，抗體，被附著到固體支持體。標(biāo)記第二種蛋白質(zhì)結(jié)合劑，其也可以是抗體，并且在不同位點(diǎn)結(jié)合該蛋白。發(fā)生蛋白質(zhì)上兩個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合后，除去未結(jié)合的被標(biāo)記的結(jié)合劑并測量結(jié)合到固相的標(biāo)記結(jié)合劑的量。結(jié)合的標(biāo)記結(jié)合劑的量與樣品中該蛋白質(zhì)的量直接成比例。
可以用蛋白質(zhì)印跡分析確定樣品中DC蛋白的存在。對例如，懷疑含有該蛋白質(zhì)的組織樣品實(shí)施電泳。電泳分離樣品，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到適宜的固體支持體，如硝酸纖維素濾器后，將固體支持體與可以與變性蛋白反應(yīng)的抗體孵育。該抗體可被標(biāo)記，或者備選地可通過將該抗體隨后與結(jié)合最初抗體的另一標(biāo)記的抗體孵育來檢測該抗體。
上面描述的免疫測定形式使用標(biāo)記的測定組分。該標(biāo)記可以為各種形式。根據(jù)本領(lǐng)域中熟知的方法，該標(biāo)記可以直接或間接偶聯(lián)到測定的所希望的組分?？梢允褂酶鞣N標(biāo)記。通過幾種方法的任一種可以標(biāo)記該組分。通常使用摻入3H、125I、35S、14C或32P的放射性標(biāo)記。非放射性標(biāo)記包括結(jié)合標(biāo)記抗體的配體、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光劑、酶和可以作為標(biāo)記蛋白的特異結(jié)合對成員的抗體。標(biāo)記的選擇取決于所需要的靈敏性、與化合物綴合的容易性、所需要的穩(wěn)定性，和可以利用的儀器。關(guān)于可以使用的各種標(biāo)記或信號產(chǎn)生系統(tǒng)的綜述，見，美國專利號4,391,904，其被并入本文作為參考。
通過各種免疫測定方法也可以測量與特定蛋白反應(yīng)的抗體。關(guān)于可用于通過免疫測定技術(shù)測量抗體的免疫學(xué)和免疫測定方法的綜述，見，例如，Stites和Terr(編者)Basic and Clinical Immunology(第七版)如前；Maggio(編者)Enzyme Immunoassay，如前；和Harlow和LaneAntibodies，A Laboratory Manual，如前。
類似于上面關(guān)于特定蛋白的測量所描述的，也可以使用各種不同的免疫測定形式、分離技術(shù)和標(biāo)記。
VI.純化的SDCMP蛋白在SEQ ID NO1、2；9和10中提供了靈長類(例如人)SDCMP3核苷酸和氨基酸序列。在SEQ ID NO3和4中提供了嚙齒類，例如小鼠SDCMP3序列。在SEQ ID NO5、6、7和8中提供了靈長類(例如人)SDCMP4核苷酸和氨基酸序列。肽序列允許制備肽以產(chǎn)生識別這些片段的抗體，并允許制備編碼這些序列的寡核苷酸。
可以利用標(biāo)準(zhǔn)純化方法，并且可以使用特定抗體實(shí)施純化。
VII.物理變體本發(fā)明還包括與SEQ ID NO2、4、6、8或10的氨基酸序列具有基本上氨基酸序列相似性的蛋白質(zhì)或肽。還包括顯示出置換(例如，20個(gè)或更少，優(yōu)選10個(gè)或更少，更優(yōu)選5個(gè)或更少置換)的變體。當(dāng)置換是保守置換時(shí)，變體將與相應(yīng)的天然序列蛋白共有免疫原或抗原相似性或者交叉反應(yīng)性。天然變體包括個(gè)體的、等位基因的、多態(tài)性、株系的和物種的變體。
通過優(yōu)化殘基匹配，如果需要，通過導(dǎo)入所需的缺口確定氨基酸序列相似性，或者序列同一性。當(dāng)將保守置換考慮為匹配時(shí)，該氨基酸序列相似性，或者序列同一性發(fā)生改變。保守置換通常包括下面組內(nèi)的置換甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。同源氨基酸序列包括每種各自蛋白質(zhì)序列中的天然等位基因和種間變異。典型的同源蛋白或肽將與相關(guān)DC蛋白的氨基酸序列具有50-100％相似性(如果可以導(dǎo)入缺口)到75-100％相似性(如果包括保守置換)。同一性測量將至少約50％、通常至少60％，更通常至少65％，通常至少70％，更通常至少75％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少80％，在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少85％或以上。也見Needleham，等人(1970)J.Mol.Biol.48443-453；Sankoff，等人(1983)Time Warps.String Edits，和MacromoleculesTheTheory and Practice of Sequence Comparison第一章，Addison-Wesley，Reading，MA；和來自NCBI(NIH)；和Universityof Wisconsin Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI的軟件包。
編碼相應(yīng)哺乳動(dòng)物DC蛋白的核酸在嚴(yán)格條件下將通常與SEQ IDNO1、3、5、7或9的編碼部分雜交。例如，編碼各自DC蛋白的核酸在嚴(yán)格條件(例如，提供至少2×背景，優(yōu)選5×、15×或25×背景的信號，而基本上不提供假陽性雜交信號)下將通常與SEQ ID NO1、3、5、7或9的核酸雜交。通常，所選的嚴(yán)格條件是在限定的離子強(qiáng)度和pH下所要雜交的序列的熱熔解點(diǎn)(Tm)低約10℃。Tm是在限定的離子強(qiáng)度和pH下50％的靶序列與完美匹配的探針雜交的溫度。通常，嚴(yán)格條件將是其中pH7時(shí)洗液中的鹽濃度為約0.02M并且溫度為至少約50℃的條件。其他因素可以顯著影響雜交的嚴(yán)格性，這些因素包括堿基組成和互補(bǔ)鏈的大小、有機(jī)溶劑如甲酰胺的存在，和堿基錯(cuò)配的程度。優(yōu)選的實(shí)施方案將包括在50％甲酰胺和20-50mM NaCl 42℃下結(jié)合所公開的序列的核酸。
通過核苷酸置換、核苷酸缺失、核苷酸插入，和核苷酸序列的倒置可以容易地修飾所分離的DC基因DNA。這些修飾導(dǎo)致新的DNA序列，這些DNA序列編碼這些DC抗原、它們的衍生物，或者具有高度相似的生理學(xué)、免疫原或抗原活性的蛋白質(zhì)。
可以用修飾序列產(chǎn)生突變抗原或增強(qiáng)表達(dá)。增強(qiáng)的表達(dá)可涉及基因擴(kuò)增、增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄、增強(qiáng)的翻譯，和其他機(jī)理。這些突變DC蛋白衍生物包括各自蛋白或其片段的預(yù)定的或位點(diǎn)特異的突變?！巴蛔兊腄C蛋白”包括否則屬于上面提出的DC蛋白的同源性定義的多肽，但是其氨基酸序列與自然中發(fā)現(xiàn)的DC蛋白的序列不同(通過缺失、置換或插入導(dǎo)致)。具體地，“位點(diǎn)特異的突變DC蛋白”通常包括與具有例如，SEQ ID NO2或10的序列的蛋白質(zhì)具有顯著相似性的蛋白質(zhì)。通常，該變體將與那些序列共有許多理化和生物學(xué)活性，例如，抗原性或免疫原性，并且在優(yōu)選實(shí)施方案中，該變體含有所公開序列的多數(shù)或全部。類似概念應(yīng)用于這些各種DC蛋白，尤其在各種溫血?jiǎng)游?，例如，靈長類和哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的DC蛋白。
盡管位點(diǎn)特異突變位點(diǎn)是預(yù)定的，但是突變體不必是位點(diǎn)特異的。通過產(chǎn)生氨基酸插入或缺失可以實(shí)施DC蛋白質(zhì)誘變?？梢援a(chǎn)生置換、缺失、插入或任意組合以得到最終構(gòu)建體。插入包括氨基-或羧基-末端融合?？梢栽诎忻艽a子實(shí)施隨機(jī)誘變并對所表達(dá)的突變體篩選所希望的活性。在DNA的預(yù)定位點(diǎn)產(chǎn)生置換突變的方法是本領(lǐng)域中熟知的，例如，通過M13引物誘變或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)。也見Sambrook，等人(1989)和Ausubel，等人(1987和增刊)。DNA中的突變通常不應(yīng)將編碼序列置于讀框的外面并且優(yōu)選不產(chǎn)生將雜交而產(chǎn)生二級mRNA結(jié)構(gòu)，如環(huán)或發(fā)夾的互補(bǔ)區(qū)域。
本發(fā)明還提供了重組蛋白，例如，使用這些蛋白的片段產(chǎn)生的異源融合蛋白。異源融合蛋白是蛋白質(zhì)或片段的融合，自然中，這些蛋白質(zhì)或片段通常不會以相同方式融合。從而，免疫球蛋白與各自DC多肽的融合產(chǎn)物是連續(xù)蛋白質(zhì)分子，其具有以典型的肽鍵融合的序列，通常作為單一翻譯產(chǎn)物并且表現(xiàn)出每種來源肽的性質(zhì)。類似概念可用于異源核酸序列。
此外，通過將來自其他蛋白質(zhì)的相似功能結(jié)構(gòu)域組合可以產(chǎn)生新的構(gòu)建體。例如，不同的新融合多肽或片段之間的結(jié)構(gòu)域或其他片段可以被“交換”，該交換通常使用相關(guān)蛋白，例如，使用凝集素或脫唾液酸糖蛋白家族。優(yōu)選地，將使用完整的結(jié)構(gòu)域，例如，完整的Ig部分。見，例如，Cunningham，等人(1989)Science 2431330-1336；和O′Dowd，等人(1988)J.Biol.Chem.26315985-15992。從而，蛋白質(zhì)結(jié)合特異性與其他功能結(jié)構(gòu)域的功能連接將產(chǎn)生新的嵌合多肽，其表現(xiàn)出特異性的新的組合。而且，丙氨酸掃描誘變可優(yōu)選應(yīng)用于結(jié)構(gòu)上位于二級結(jié)構(gòu)之外的殘基，這將避免多數(shù)關(guān)鍵殘基，這些關(guān)鍵殘基的誘變通常破壞三級結(jié)構(gòu)。
這些DC抗原的“衍生物”包括氨基酸序列突變體、糖基化變體，和與其他化學(xué)部分的共價(jià)或聚集綴合物。通過本領(lǐng)域中熟知的方法，將功能性與在這些DC蛋白氨基酸側(cè)鏈或N-或C-末端發(fā)現(xiàn)的基團(tuán)連接可以制備共價(jià)衍生物。這些衍生物可以包括，但不限于，羧基末端或者含有羧基側(cè)鏈的殘基的脂肪族酯或酰胺、含有羥基的殘基的O-?；苌?，和氨基末端氨基酸或者含有氨基的殘基(例如，賴氨酸或精氨酸)的N-?；苌?。?；x自包括C3到C18正常烷基的烷基-部分，從而形成烷?；减；N類。當(dāng)免疫原性部分是半抗原時(shí)，對載體蛋白的共價(jià)附著是重要的。
具體地，可以包括糖基化改變，該糖基化改變?yōu)槔?，在多肽的合成和加工期間，或者在進(jìn)一步加工步驟中通過修飾該多肽的糖基化模式產(chǎn)生的。實(shí)現(xiàn)糖基化的尤其優(yōu)選的方法是將該多肽暴露于來自通常提供這些加工的細(xì)胞的糖基化酶，例如，哺乳動(dòng)物糖基化酶。也考慮去糖基化酶。還包括具有其他微小修飾的相同一級氨基酸序列的形式，這些修飾包括磷酸化氨基酸殘基，例如，磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸，或其他部分，包括核糖基或交聯(lián)試劑。還包括含有置換的蛋白，該置換將保留充分的免疫原性以產(chǎn)生識別例如，SEQ IDNO2或10的蛋白質(zhì)的抗體。通常，這些蛋白質(zhì)將含有對所公開序列的少于20個(gè)殘基置換，更典型的少于10個(gè)置換，優(yōu)選少于5個(gè)，更優(yōu)選少于3個(gè)。備選地，在結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域開始和結(jié)束的蛋白質(zhì)將通常保留抗原性和交叉免疫原性。
衍生物的一個(gè)主要組是DC蛋白或其片段與其他蛋白質(zhì)或多肽的共價(jià)綴合物。這些衍生物可以在重組培養(yǎng)中合成，如N-或C-末端融合，或者通過使用本領(lǐng)域中公知的試劑合成，這些試劑可以通過反應(yīng)性側(cè)基用于蛋白質(zhì)交聯(lián)。與交聯(lián)劑交聯(lián)的優(yōu)選的蛋白質(zhì)衍生位點(diǎn)在游離氨基、碳水化合物部分，和半胱氨酸殘基。
還提供了這些DC蛋白和其他同源或異源蛋白之間的融合多肽。異源多肽可以是不同表面標(biāo)記之間的融合，導(dǎo)致例如，雜種蛋白。同樣，可以構(gòu)建異源融合體，其將顯示出衍生蛋白質(zhì)的性質(zhì)和活性的聯(lián)合。典型的實(shí)例是報(bào)道多肽，例如，螢光素酶與蛋白質(zhì)的片段或結(jié)構(gòu)域，例如，受體結(jié)合片段的融合，從而，可以容易地確定所融合的蛋白的存在或位置。見，例如，Dull，等人，美國專利號4,859,609。其他基因融合配偶體包括細(xì)菌β-半乳糖苷酶、trpE、蛋白質(zhì)A、β-內(nèi)酰胺酶、α淀粉酶、乙醇脫氫酶，和酵母α交配因子。見，例如，Godowski，等人(1988)Science 241812-816。
這些多肽也可以具有已經(jīng)被化學(xué)修飾的氨基酸殘基，這些化學(xué)修飾包括磷酸化、磺化、生物素化或者加入或除去其他部分，尤其分子形狀與磷酸基團(tuán)相似的那些部分。在一些實(shí)施方案中，該修飾將是有用的標(biāo)記試劑，或者作為純化靶標(biāo)，例如，親和配體。
本發(fā)明還考慮使用這些DC蛋白的衍生物，這些衍生物不同于氨基酸序列變異或糖基化得到的衍生物。這些衍生物可以包括與化學(xué)部分的共價(jià)結(jié)合或聚集結(jié)合。這些衍生物通常分成三類(1)鹽，(2)側(cè)鏈和末端殘基共價(jià)修飾，和(3)吸附復(fù)合體，例如，與細(xì)胞膜的吸附復(fù)合體。這些共價(jià)或聚集衍生物可用作免疫原、免疫測定中的試劑、或者用于純化方法中，如用于親和純化配體或其他結(jié)合配體。例如，通過本領(lǐng)域中熟知的方法可以將DC蛋白質(zhì)抗原通過共價(jià)結(jié)合固定到固體支持體，如溴化氰活化的Sepharose，或者使用或不用戊二醛交聯(lián)將DC蛋白質(zhì)抗原吸附到聚烯烴表面上，以用于抗-DC蛋白質(zhì)抗體的測定法或純化。本發(fā)明的DC蛋白還可以被可檢測基團(tuán)標(biāo)記，例如，通過氯胺T方法放射性碘標(biāo)記，共價(jià)結(jié)合稀土螯合物，或者綴合到另一熒光部分以用于診斷測定中。通過固定化抗體可以實(shí)現(xiàn)這些SDCMP蛋白的純化。
分離的DC蛋白質(zhì)基因?qū)⒃试S轉(zhuǎn)化缺少相應(yīng)DC蛋白表達(dá)的細(xì)胞，這些細(xì)胞，例如，物種型細(xì)胞，或者缺少相應(yīng)蛋白質(zhì)并且表現(xiàn)出陰性背景活性的細(xì)胞。所轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)將允許分離抗原性純的細(xì)胞系，具有明確的或者單一物種變體。該方法允許更靈敏地檢測和區(qū)分這些DC蛋白的生理學(xué)效應(yīng)?？梢苑蛛x和使用亞細(xì)胞片段，例如，胞質(zhì)體或膜片段。
VIII.結(jié)合劑DC蛋白復(fù)合體在免疫測定中確定一種DC蛋白，其特異結(jié)合針對明確的免疫原，例如，由SEQ ID NO2或10的氨基酸序列組成的免疫原產(chǎn)生的抗體或者與該抗體具有特異免疫反應(yīng)性。該免疫測定使用針對SEQ ID NO2或10的蛋白產(chǎn)生的多克隆抗血清。所選擇的該血清具有針對相關(guān)家族的其他成員的低交叉反應(yīng)性，并且在免疫測定中使用前通過免疫吸附除去任何這種免疫反應(yīng)性。
為了產(chǎn)生用于免疫測定中的抗血清，例如，如此處描述的分離SEQID NO2或10的蛋白。例如，可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中產(chǎn)生重組蛋白。使用標(biāo)準(zhǔn)佐劑，如弗氏佐劑，和標(biāo)準(zhǔn)小鼠免疫方案(見Harlow和Lane，如前)，用適宜的蛋白免疫小鼠的自交品系，如BALB/c。備選地，從此處公開的序列得到并綴合到載體蛋白的合成肽可以用作免疫原。收集多克隆血清并測定針對免疫測定(例如，免疫原固定在固體支持體上的固相免疫測定)中免疫原蛋白的效價(jià)。選擇效價(jià)為104或更大的多克隆抗血清并試驗(yàn)它們針對其他相關(guān)蛋白的交叉反應(yīng)性，該試驗(yàn)使用競爭性結(jié)合免疫測定，如Harlow和Lane，如前，570-573頁中所描述的競爭性結(jié)合免疫測定。優(yōu)選地，兩種不同相關(guān)蛋白聯(lián)合給定DC蛋白被用于該測定中。例如，對于凝集素蛋白，使用至少兩種其他家族成員以吸附完共有的表位。SDCMP3家族成員與該家族的兩種其他成員聯(lián)合使用。這些其他家族成員可以作為重組蛋白產(chǎn)生并且可以用此處描述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)分離。
競爭結(jié)合形式中的免疫測定可用于交叉反應(yīng)性測定。例如，可以將SEQ ID NO2或10的蛋白質(zhì)固定到固體支持體。加入該測定中的蛋白質(zhì)與抗血清競爭結(jié)合固定化抗原。將上面的蛋白質(zhì)與抗血清競爭結(jié)合固定化蛋白質(zhì)的能力與SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)相比。使用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算方法計(jì)算上面蛋白的百分?jǐn)?shù)交叉反應(yīng)性。選擇并合并與上面所列的蛋白質(zhì)的每一種的具有小于10％交叉反應(yīng)性的那些抗血清。然后通過與上面所列蛋白質(zhì)的免疫吸附從合并的血清除去交叉反應(yīng)抗體。
然后將免疫吸收并合并的血清用于如上述的競爭性結(jié)合免疫測定中以將另一蛋白與免疫原蛋白(例如，SEQ ID NO2或10的SDCMP3蛋白)比較。為了進(jìn)行該比較，測定寬范圍濃度下這兩種蛋白的每一種并確定將抗血清與固定化蛋白的結(jié)合抑制50％所需的每種蛋白的量。如果所需的第二種蛋白質(zhì)的量少于所需的SEQ ID NO2或10的蛋白質(zhì)的量的2倍，那么認(rèn)為第二種蛋白特異結(jié)合針對該免疫原產(chǎn)生的抗體。
可以理解DC蛋白可能是含有兩種或多種基因的同源蛋白家族。對于具體基因產(chǎn)物，如人Ig家族成員蛋白，本發(fā)明不僅包括此處公開的氨基酸序列，還包括其他蛋白，該其他蛋白是等位基因的、多態(tài)性的、非等位基因的，或物種的變體。還可以理解術(shù)語“人DC蛋白”包括非天然突變，這些非天然突變通過使用常規(guī)重組技術(shù)如單一位點(diǎn)突變的有意突變或者通過切除編碼這些蛋白質(zhì)的DNA的短片段或者該基因的剪接變體，或者通過置換或加入少數(shù)新氨基酸導(dǎo)入。這些較小的改變必須基本上保持最初分子的免疫同一性和/或其生物學(xué)活性。這些改變包括與所指定的天然發(fā)生的各自SDCMP蛋白(例如，SEQ ID NO6或8的人SDCMP4蛋白)特異免疫反應(yīng)的蛋白。認(rèn)為較小的具體蛋白質(zhì)修飾將包括具有相似化學(xué)性質(zhì)的氨基酸的保守置換，如上面對作為一個(gè)整體的每個(gè)蛋白質(zhì)家族所描述的。通過將蛋白質(zhì)與SEQ ID NO2或10的蛋白質(zhì)最優(yōu)比對，并通過使用此處描述的常規(guī)免疫測定以確定免疫同一性，可以確定本發(fā)明的蛋白質(zhì)組合物。
IX.用途本發(fā)明提供了試劑，這些試劑將用于本文別處(例如，關(guān)于發(fā)育異常的一般描述中，或者下面關(guān)于診斷試劑盒的描述中)描述的診斷應(yīng)用中。
DC基因，例如，DNA或RNA可用作法醫(yī)測定中的組分。例如，可以用，例如，32P或者生物素標(biāo)記所提供的核苷酸序列并將其用于檢測標(biāo)準(zhǔn)限制性片段長度多態(tài)性印跡，提供可測量的特征以幫助區(qū)分個(gè)體。這些探針可用于熟知的法醫(yī)技術(shù)，如基因指紋法中。此外，從DC序列制備的核苷酸探針可用于原位測定中以檢測染色體異常。
針對DC蛋白或核酸的抗體和其他結(jié)合試劑可用于純化相應(yīng)的DC蛋白分子。如在下面實(shí)施例中描述的，DC蛋白的抗體純化是可能的和可行的。使用此處描述的熟知的技術(shù)，抗體和其他結(jié)合試劑也可用于診斷方式以確定DC組分是否存在于組織樣品或細(xì)胞群體。能夠?qū)⒔Y(jié)合試劑附著到DC蛋白提供了診斷與表達(dá)錯(cuò)誤調(diào)節(jié)相關(guān)的失調(diào)的方法?？贵w和其他DC蛋白結(jié)合試劑還可用作組織學(xué)標(biāo)記，或者純化試劑。如下面實(shí)施例中所描述，這些蛋白的每一種的表達(dá)都限于特定組織類型。通過將探針，如抗體或核酸針對各自DC蛋白，可能使用該探針原位或體外區(qū)分組織和細(xì)胞類型。
此外，純化的抗原可用于耗盡選擇性結(jié)合該抗原的抗體的抗血清制劑。從而，例如，小鼠SDCMP3可用于耗盡針對可以與小鼠SDCMP3交叉反應(yīng)的組分的人SDCMP4產(chǎn)生的抗血清。備選地，SDCMP3可用于純化抗血清的那些組分，這些組分親和地結(jié)合各自抗原。
SDCMP4與肝ASGPR具有許多共同特征，ASGPR是II型跨膜C-型凝集素的最熟知的實(shí)例。肝ASGPR顯示出對半乳糖殘基的結(jié)合特異性，并且其細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有用于配體內(nèi)化的酪氨酸基序。這些特征使得肝ASGPR結(jié)合表達(dá)半乳糖殘基的脫唾液酸化的血漿糖蛋白，并隨后提供了這些蛋白從血漿的清除。
不能從SDCMP4的CRD序列完全推論出SDCMP4的配體特異性。然而，SDCMP4在DC上的表達(dá)表明潛在抗原組分(諸如在微生物上發(fā)現(xiàn)的)可以代表SDCMP4的天然配體。在該背景中，在DC和巨噬細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的另一C-型凝集素-甘露糖受體在識別例如酵母細(xì)胞壁的甘露糖部分后結(jié)合和內(nèi)化酵母顆粒。
SDCMP4中基于酪氨酸的內(nèi)化基序的存在預(yù)示著該分子在DC的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞中起作用?？梢哉J(rèn)為SDCMP4作為DC中的“抗原受體”內(nèi)化配體，該配體將隨后被送到細(xì)胞內(nèi)加工途徑，導(dǎo)致抗原呈遞和啟動(dòng)或促進(jìn)免疫應(yīng)答。
這種SDCMP4介導(dǎo)的內(nèi)化功能使得該受體是指導(dǎo)抗原進(jìn)入DC的潛在靶標(biāo)，例如，用以增強(qiáng)向T細(xì)胞的呈遞，和隨后活化特異免疫。從而，SDCMP4可以代表一種受體，其將抗原遞送到接種方案，從而，將抗原靶定到適宜細(xì)胞以啟動(dòng)疫苗應(yīng)答。這種策略的治療重要性與癌癥的免疫治療尤其相關(guān)，其中腫瘤相關(guān)抗原(TAA)可以與特異識別SDCMP4的試劑偶聯(lián)以選擇性遞送到DC。
本發(fā)明還提供了可以表現(xiàn)出重要的治療價(jià)值的試劑。DC蛋白(天然發(fā)生的或重組的)、其片段和其抗體，以及被鑒定具有對DC蛋白結(jié)合親和性的化合物可用于治療與異常生理或發(fā)育相關(guān)的病癥，包括異常增殖，例如，癌性病癥，或退化性病癥。通過適宜的治療性治療，使用此處提供的組合物可以調(diào)節(jié)異常增殖、再生、退化和萎縮。例如，與DC(例如，作為抗原呈遞細(xì)胞)的異常表達(dá)或異常信號化相關(guān)的疾病或失調(diào)是該蛋白的激動(dòng)劑或拮抗劑的靶標(biāo)。這些蛋白可能在造血細(xì)胞，例如，淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)或發(fā)育中起作用，這些造血細(xì)胞影響免疫應(yīng)答，例如，抗原呈遞和所導(dǎo)致的效應(yīng)功能。
認(rèn)為阻斷這些SDCMPs的相互作用就可以阻斷信號。從而，例如，使用針對這些蛋白的多克隆或篩選的單克隆抗體可以影響免疫應(yīng)答，例如，MLR。備選地，可溶的細(xì)胞外片段可以阻斷與反受體的相互作用，從而也阻斷這種反應(yīng)。因?yàn)镸LR是免疫應(yīng)答的啟動(dòng)或維持的診斷，所以這些試劑可用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的啟動(dòng)和維持。
通過RNA印跡分析知道細(xì)胞類型中的其他異常發(fā)育病癥具有DC蛋白mRNA。見Berkow(編者)The Merck Manual of Diagnosis andTherapy，Merck and Co.，Rahway，NJ；和Thorn，等人Harrison′sPrinciples of Internal Medicine，McGraw-Hill，NY。例如，免疫系統(tǒng)的發(fā)育或功能異?？蓪?dǎo)致嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)異常和病癥，用此處提供的組合物可以預(yù)防或治療這些異常和病癥。
可以純化重組DC蛋白或抗體并將它們施用于患者。這些試劑可以與其他活性或惰性成分組合用于治療，這些成分為例如，常規(guī)藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，例如，免疫原性佐劑，以及生理上無害的穩(wěn)定劑和賦形劑。具體地，這些成分可以用于疫苗背景中，其中抗原與激動(dòng)劑或拮抗劑的這些治療形式之一組合。可以將這些組合無菌過濾或者通過在劑量小瓶中凍干得到劑型，或者保存在穩(wěn)定的水性制劑中。本發(fā)明還預(yù)期抗體或者其結(jié)合片段的用途，該結(jié)合片段包括不互補(bǔ)結(jié)合的形式。
使用抗體或者其受體或片段的藥物篩選可以鑒定對這些DC蛋白具有結(jié)合親和性的化合物，包括分離結(jié)合的組分。然后可以用生物學(xué)測定以確定該化合物是否具有內(nèi)在刺激活性并由于其阻斷該蛋白的活性而因此是阻斷劑或拮抗劑。同樣，具有內(nèi)在刺激活性的化合物可以通過該蛋白激活細(xì)胞從而由于其刺激該細(xì)胞而是激動(dòng)劑。本發(fā)明還考慮針對這些蛋白的抗體作為拮抗劑的治療用途。
有效治療所需的試劑的量將取決于許多不同因素，包括施用方法、靶標(biāo)部位、患者的生理狀態(tài)，和所施用的其他藥物。從而，將滴定治療劑量以優(yōu)化安全性和效能。通常，體外使用的劑量可以對用于這些試劑的原位施用的量提供有用的指導(dǎo)。具體失調(diào)的治療的有效劑量的動(dòng)物試驗(yàn)將進(jìn)一步提供對人劑量的預(yù)測性指示。在例如，Gilman，等人(編者)(1990)Goodman and Gilman′sThe PharmacologicalBases of Therapeutics(第八版)Pergamon Press；和(1990)Remington′s Pharmaceutical Sciences(第17版)Mack PublishingCo.，Easton，PA中描述了各種考慮。此處和下文討論了施用，例如，經(jīng)口、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)施用、透皮擴(kuò)散，和其他施用的方法。藥學(xué)上可接受的載體將包括水、鹽水、緩沖液和例如在Merck Index，Merck和Co.，Rahway，NJ中描述的其他化合物。通常預(yù)期劑量范圍的量低于1mM濃度，通常小于約10μM濃度，通常小于約100nM，優(yōu)選小于約10pM(皮摩爾)，最優(yōu)選小于約1fM(毫微微摩爾)，與適宜的載體。緩釋制劑，或者緩釋裝置將通常用于持續(xù)施用。
DC蛋白、其片段、針對DC蛋白或其片段的抗體、拮抗劑和激動(dòng)劑可被直接施用于所要治療的宿主，或者，根據(jù)化合物的大小，可以希望將該化合物綴合到載體蛋白如卵清蛋白或者血清白蛋白后施用?？梢砸栽S多常規(guī)劑量制劑施用治療制劑。盡管活性成分可以單獨(dú)施用，但是優(yōu)選將其作為藥物制劑施用。制劑通常含有如上面定義的至少一種活性成分，以及其一種或多種可接受的載體。每種載體應(yīng)該是藥學(xué)上和生理學(xué)上可接受的，也就是與其他成分相容并且對患者無害。制劑包括適于經(jīng)口、直腸、鼻、或腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮內(nèi))施用的制劑。制劑可以方便地以單位劑型給出并且可以通過藥劑學(xué)領(lǐng)域中熟知的任何方法制備。見，例如，Goodman，等人(編者)(1990)Goodman和Gilman′sThe Pharmacological Bases ofTherapeutics(第八版)Pergamon Press，和(1990)Remington′sPharmaceutical Sciences(第17版)Mack Publishing Co.，Easton，PA；Avis等人(編者)(1993)Pharmaceutical Dosage FormsParenteral MedicationsDekker，NY；Lieberman等人(編者)(1990)Pharmaceutical Dosage FormsTablets Dekker，NY；和Lieberman等人(編者)(1990)Pharmaceutical Dosage FormsDisperse SystemsDekker，NY。本發(fā)明的治療可以與其他化學(xué)治療或者化學(xué)預(yù)防劑組合或聯(lián)合使用。
本發(fā)明的DC蛋白的天然發(fā)生的和重組形式都可尤其用于試劑盒和測定方法，該試劑盒和測定方法能夠篩選對這些蛋白具有結(jié)合活性的化合物。最近已經(jīng)開發(fā)了幾種自動(dòng)測定方法以允許在短期內(nèi)篩選上萬種化合物。見，例如，F(xiàn)odor，等人(1991)Science 251767-773，和化學(xué)多樣性文庫的其他描述，其描述了通過多種化合物試驗(yàn)結(jié)合親和性的方法。通過利用如本發(fā)明提供的DC蛋白的大量純化的，例如，可溶形式，可以極大地方便適宜測定法的開發(fā)。
例如，一旦蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被確定，那么通常可以發(fā)現(xiàn)拮抗劑。使用純化的表面蛋白開發(fā)高度自動(dòng)化測定方法后，現(xiàn)在可以試驗(yàn)潛在的蛋白質(zhì)類似物。具體地，使用此處描述的篩選技術(shù)將發(fā)現(xiàn)新的拮抗劑和激動(dòng)劑。尤其重要的是發(fā)現(xiàn)對多種相關(guān)的細(xì)胞表面抗原具有聯(lián)合的結(jié)合親和性的化合物，例如，可以作為DC蛋白的種變體的拮抗劑的化合物。
本發(fā)明尤其用于通過使用重組DC蛋白在各種藥物篩選技術(shù)中篩選化合物。使用重組蛋白篩選特異配體的優(yōu)點(diǎn)包括(a)來自特定來源的蛋白質(zhì)的改良的可更新的來源；(b)每個(gè)細(xì)胞潛在的在測定中給出更好的信號噪聲比值的更多的抗原；和(c)物種變體特異性(理論上給出更大的生物學(xué)和疾病特異性)。
藥物篩選的一種方法利用了真核或原核宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞被表達(dá)DC蛋白的重組DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化?？梢詮谋磉_(dá)分離的該蛋白的任何其他宿主分離細(xì)胞。這些存活或被固定形式的細(xì)胞可以用于標(biāo)準(zhǔn)表面蛋白結(jié)合測定中。還見，Parce，等人(1989)Science246243-247；和Owicki，等人(1990)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA874007-4011，它們描述了檢測細(xì)胞應(yīng)答的靈敏方法。競爭性測定尤其有用，其中將細(xì)胞(DC蛋白源)與已知對該抗原具有結(jié)合親和性的抗體，如125I-抗體，和待測樣品接觸并孵育，測量該試樣對結(jié)合組合物的結(jié)合親和性。然后分離結(jié)合的和游離的被標(biāo)記的結(jié)合組合物以評估蛋白質(zhì)結(jié)合的程度。所結(jié)合的受試化合物的量與結(jié)合已知來源的標(biāo)記抗體的量成相反比例?？梢杂迷S多技術(shù)將結(jié)合的試劑與游離的試劑分開以評估結(jié)合程度。該分離步驟可通常包括諸如粘附到濾器然后洗滌，粘附到塑料然后洗滌，或者離心細(xì)胞膜。也可以用存活的細(xì)胞篩選藥物對這些DC蛋白介導(dǎo)的功能，例如，抗原呈遞或輔助功能的影響。
另一方法利用來自被轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細(xì)胞的膜作為DC蛋白的來源。這些細(xì)胞被DNA載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，該DNA載體指導(dǎo)適宜的蛋白，例如，工程化的膜結(jié)合形式的蛋白的表達(dá)?；旧希瑢募?xì)胞制備膜并將其用于結(jié)合測定中，如上面提出的競爭測定。
另一方法是使用來自被轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細(xì)胞的溶解的、未純化的或溶解的、純化的DC蛋白。這允許“分子”結(jié)合測定，其優(yōu)點(diǎn)是特異性增加，能夠自動(dòng)化，和高藥物試驗(yàn)通量。
藥物篩選的另一技術(shù)包括化合物的高通量篩選，這些化合物對各自DC蛋白具有適宜的結(jié)合親和性，該技術(shù)在Geysen，歐洲專利申請84/03564(1984年9月13日公開)中詳細(xì)描述。首先，在固體基質(zhì)，如塑料針或者某些其他適宜的表面上合成大量不同的小肽受試化合物，見，F(xiàn)oder，等人，如前。然后將所有針與可溶的、未純化的或可溶的、純化的DC蛋白反應(yīng)，并洗滌。下一步驟包括檢測所結(jié)合的試劑，例如，抗體。
確定那些位點(diǎn)與特定其他蛋白相互作用的一種方法是物理結(jié)構(gòu)測定，例如，x-射線晶體學(xué)或者二維NMR技術(shù)。這些將提供關(guān)于哪些氨基酸殘基形成分子接觸區(qū)域的指導(dǎo)。關(guān)于蛋白質(zhì)結(jié)合確定的詳細(xì)描述，見，例如，Blundell和Johnson(1976)Protein CrystallographyAcademic Press，NY。
X.試劑盒本發(fā)明還考慮這些DC蛋白、其片段、肽、和它們的融合產(chǎn)物在用于檢測DC蛋白或信息的存在的各種診斷試劑盒和方法中的用途。通常，試劑盒將具有隔室，隔室含有所定義的DC肽或基因片段或者試劑，其識別一種或另一種，例如，抗體。
測定受試化合物與各自DC蛋白的結(jié)合親和性的試劑盒將通常含有受試化合物；被標(biāo)記的化合物，例如，已知對該蛋白具有結(jié)合親和性的抗體；DC蛋白質(zhì)(天然發(fā)生的或重組的)來源；和將結(jié)合的標(biāo)記化合物與游離的標(biāo)記化合物分開的工具，如用于固定DC蛋白的固相。一旦篩選了化合物，可以在如本領(lǐng)域中熟知的適宜生物學(xué)測定中評價(jià)對該蛋白具有適宜的結(jié)合親和性的那些化合物，以確定這些化合物是否作為激動(dòng)劑或拮抗劑以調(diào)節(jié)DC功能。重組DC多肽的存在也提供了用于校準(zhǔn)這些測定的明確標(biāo)準(zhǔn)。
用于確定例如樣品中DC蛋白的濃度的優(yōu)選試劑盒將通常包含標(biāo)記的具有對DC蛋白的已知的結(jié)合親和性的化合物，例如，抗體；DC蛋白(天然發(fā)生的或重組的)來源和將結(jié)合的標(biāo)記化合物與游離的標(biāo)記化合物分開的工具，如用于固定DC蛋白的固相。通常將提供含有試劑的隔室，和使用說明書。
對各自DC或其片段特異的抗體，包括抗原結(jié)合片段，可用于診斷性應(yīng)用以檢測該蛋白質(zhì)和/或其片段的水平是否升高。這些診斷測定可以使用裂解物、活細(xì)胞、固定細(xì)胞、免疫熒光、細(xì)胞培養(yǎng)物、體液，并且還可以包括檢測血清中的抗原，等。診斷測定可以是同質(zhì)的(沒有游離試劑和抗原-DC蛋白復(fù)合體之間的分離步驟)或者異質(zhì)的(有分離步驟)。存在各種商業(yè)化測定，如放射免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、酶免疫測定(EIA)、酶-倍增的免疫測定技術(shù)(EMIT)、底物標(biāo)記的熒光免疫測定(SLFIA)、等等。例如，通過使用第二抗體，可以使用未標(biāo)記的抗體，該第二抗體被標(biāo)記并且識別針對DC蛋白或者其特定片段的抗體。在文獻(xiàn)中已經(jīng)廣泛討論類似測定。見，例如，Harlow和Lane(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，CSH Press，NY；Chan(編者1987)ImmunoassayA Practical GuideAcademic Press，Orlando，F(xiàn)L；Price和Newman(編者1991)Principles and Practice of ImmunoassayStockton Press，NY；和Ngo(編者1988)Nonisotopic ImmunoassayPlenum Press，NY。具體地，該試劑可用于診斷生物樣品中DC群體，以檢測樣品中DC的過量或不足。該測定可以用于活檢的組織學(xué)分析，或者評價(jià)血液或組織樣品中DC的數(shù)目。
抗獨(dú)特型抗體可以具有類似用途以診斷針對DC蛋白的抗體的存在，同樣可以診斷各種異常狀態(tài)。例如，DC蛋白的過量產(chǎn)生可導(dǎo)致各種免疫學(xué)反應(yīng)，其可以診斷異常生理狀態(tài)，尤其增殖性細(xì)胞病癥，如癌癥或異常分化。
通常在試劑盒中提供用于診斷測定的試劑，以便優(yōu)化測定的靈敏性。對于主題發(fā)明，根據(jù)測定的性質(zhì)，提供了方案、和標(biāo)記、標(biāo)記或未標(biāo)記的抗體或受體，或者標(biāo)記的DC蛋白。這通常與其他添加劑，如緩沖劑、穩(wěn)定劑、信號產(chǎn)生所需的物質(zhì)，如酶的底物，等等一起提供。優(yōu)選地，該試劑盒將還含有關(guān)于正確使用和使用后內(nèi)含物的處理的使用說明。通常，試劑盒具有每種有用試劑的隔室。希望試劑作為干燥的凍干粉末提供，其中這些試劑可以在水性介質(zhì)中重構(gòu)，從而提供實(shí)施該測定的試劑的適當(dāng)濃度。
藥物篩選和診斷測定的許多前述組分可以不加修飾地使用或者可以以各種方法修飾。例如，通過共價(jià)或非共價(jià)連接一個(gè)部分可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記，該部分直接或間接提供可檢測的信號。在許多這些測定中，可以直接或間接標(biāo)記該蛋白、受試化合物、DC蛋白或者其抗體。直接標(biāo)記的可能性包括標(biāo)記基團(tuán)放射標(biāo)記如125I、酶(美國專利號3,645,090)，如過氧化物酶和堿性磷酸酶，和熒光標(biāo)記(美國專利號3,940,475)，其能夠監(jiān)視熒光強(qiáng)度、波長偏移，或者熒光偏振的改變。間接標(biāo)記的可能性包括將一種組分生物素化，然后結(jié)合偶聯(lián)到上面標(biāo)記基團(tuán)之一的抗生物素蛋白。
有多種方法可以將結(jié)合的蛋白與游離蛋白分離，或者備選地，將結(jié)合的受試化合物與游離的受試化合物分離?？梢詫C蛋白固定在各種基質(zhì)上，然后洗滌。適宜的基質(zhì)包括塑料，如ELISA板、濾器，和珠子。將DC蛋白固定到基質(zhì)的方法包括，但不限于，使用捕獲抗體直接粘附到塑料、化學(xué)偶聯(lián)，和生物素-抗生物素蛋白。該方法中的最后一步包括通過幾種方法之一沉淀蛋白/抗體復(fù)合體，這些方法包括例如，例如有機(jī)溶劑如聚乙二醇或鹽，如硫酸銨的方法。其他適宜的分離技術(shù)包括，但不限于，Rattle，等人(1984)Clin.Chem.301457-1461中描述的熒光素抗體可磁化顆粒方法，和如在美國專利號4,659,678中描述的雙抗體磁性顆粒分離。
將蛋白質(zhì)或它們的片段連接到各種標(biāo)記的方法已經(jīng)在文獻(xiàn)中廣泛報(bào)導(dǎo)并且不需要在此處詳細(xì)討論。許多技術(shù)包括通過利用碳二亞胺或活性酯使用活化的羧基基團(tuán)以形成肽鍵，通過將巰基與活化的鹵素，如氯乙?；磻?yīng)形成硫醚，或者活化的烯烴，如馬來酰亞胺用于連接，等等。融合蛋白也可用于這些應(yīng)用中。
本發(fā)明的另一個(gè)診斷方法包括使用從各自DC蛋白的序列得到的寡核苷酸或多核苷酸序列。這些序列可用作探針以檢測來自懷疑患有異常病癥，例如，癌癥或免疫問題的患者的樣品中信息的水平。RNA和DNA核苷酸序列的制備、這些序列的標(biāo)記，和這些序列的優(yōu)選大小已經(jīng)在文獻(xiàn)中大量描述和討論。通常，寡核苷酸探針將有至少約14個(gè)核苷酸，通常至少約18個(gè)核苷酸，并且多核苷酸探針可以高達(dá)數(shù)千堿基?？梢允褂酶鞣N標(biāo)記，最常用放射性核素，尤其32P。然而，也可以使用其他技術(shù)，如使用生物素修飾的核苷酸以導(dǎo)入多核苷酸。然后生物素作為結(jié)合抗生物素蛋白或抗體的部位，該抗體可以被各種標(biāo)記物標(biāo)記，這些標(biāo)記物為諸如放射性核素、熒光團(tuán)、酶，等等。備選地，可以使用能夠識別特異雙鏈體的抗體，這些雙鏈體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體、DNA-RNA雜種雙鏈體，或者DNA-蛋白雙鏈體。該抗體叉可以被標(biāo)記并實(shí)施測定，其中雙鏈體結(jié)合到表面，從而在表面上形成雙鏈體時(shí)，可以檢測結(jié)合雙鏈體的抗體的存在。可以以任一常規(guī)技術(shù)使用針對新反義RNA的探針，該技術(shù)為諸如核酸雜交、加減篩選、重組檢測、雜種釋放翻譯(HRT)、和雜種停滯翻譯(HART)。還包括擴(kuò)增技術(shù)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
還預(yù)期診斷試劑盒，其也定性或定量檢驗(yàn)其他標(biāo)記的存在。診斷或預(yù)后可以取決于用作標(biāo)記的多種指征的組合。從而，試劑盒可以檢驗(yàn)標(biāo)記的組合。見，例如，Viallet，等人(1989)Progress in GrowthFactor Res.189-97。
XI.結(jié)合配偶體分離已經(jīng)分離了特異相互作用的結(jié)合配偶體的一個(gè)成員，存在分離反-配偶體的方法。見，Gearing，等人(1989)EMBO J.83667-3676?？梢源_定標(biāo)記DC表面蛋白而不干擾與其受體的結(jié)合的方法。例如，可以將親和標(biāo)記融合到配體的氨基末端或羧基末端?？梢院Y選表達(dá)文庫對DC蛋白的特異結(jié)合，這可以通過例如細(xì)胞分類，或者其他篩選以檢測表達(dá)這種結(jié)合組分的亞群。見，例如，Ho，等人(1993)Proc.Nat′lAcad.Sci.USA9011267-11271。備選地，可以使用淘選方法。見，例如，Seed和Aruffo(1987)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA843365-3369。制備與可得到的DC蛋白質(zhì)序列適宜的構(gòu)建體也可以應(yīng)用雙雜交選擇系統(tǒng)。見，例如，F(xiàn)ields和Song(1989)Nature 340245-246。
可以使用蛋白質(zhì)與標(biāo)記的交聯(lián)技術(shù)分離DC蛋白的結(jié)合配偶體。這將允許鑒定與適宜的DC蛋白特異相互作用的蛋白。
參考下面的實(shí)施例可以最好地理解本發(fā)明的寬范圍，這些實(shí)施例不打算將本發(fā)明限制于特定實(shí)施方案。
實(shí)施例I.一般方法在例如Maniatis，等人(1982)Molecular Cloning，ALaboratory ManualCold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Press，NY；Sambrook，等人(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版)卷1-3，CSH Press，NY；Ausubel，等人BiologyGreene Publishing Associates，Brooklyn，NY；或Ausubel，等人(1987和增刊)Current Protocols in MolecularBiologyWiley/Greene，NY；huis，等人(編者)(1990)PCRProtocolsA Guide to Methods and ApplicationsAcademic Press，NY中描述或參考了許多下面的標(biāo)準(zhǔn)方法。
蛋白質(zhì)純化方法包括諸如硫酸銨沉淀、柱層析、電泳、離心、結(jié)晶、和其他方法。見，例如，Ausubel，等人(1987和定期增刊)；Deutscher(1990)″蛋白質(zhì)純化指南″Methods in Enzymology卷182，和該系列中的其他卷；Coligan，等人(1996和定期增刊)CurrentProtocols in Protein ScienceWiley/Greene，NY；和生產(chǎn)商(例如Pharmacia，Piscataway，NJ，或Bio-Rad，Richmond，CA)的關(guān)于蛋白質(zhì)純化產(chǎn)物的文獻(xiàn)。重組技術(shù)的組合允許融合到適宜的片段，例如，融合到FLAG序列，或者等價(jià)序列，其可以通過蛋白酶-可除去的序列融合。見，例如，Hochuli(1989)Chemische Industrie1269-70；Hochuli(1990)″用金屬螯合吸收劑純化重組蛋白″Setlow(編者)Genetic Engineering，Principle and Methods1287-98，Plenum Press，NY；和Crowe，等人(1992)QIAexpressThe HighLevel Expression and Protein Purification SystemQUIAGEN，Inc.，Chatsworth，CA。
在Hertzenberg，等人(編者，1996)Weirs’s Handbook ofExperimental Immunology，卷1-4，Blackwell Science；Coligan等人(1992和定期增刊)Current Protocols in Protein ScienceWiley/Greene，NY和Methods in Enzymology卷70、73、74、84、92、93、108、116、121、132、150、162和163。還見，例如，Paul(等人)(1993)Fundamental Immunology(第三版)Raven Press，N.Y。在，例如Steinman(1991)Annual Review of Immunology 9271-296；和Banchereau和Schmitt(編者，1994)Dendritic Cells inFundamenal and Clinical Immunology Plenum Press，NY中描述了確定免疫功能的方法。
在Melamed等人(1990)Flow Cytometry and SortingWiley-Liss，Inc，New York，NY；Shapiro(1988)Practical FlowCytometryLiss，New York，NY；和Robinson，等人(1993)Handbookof Flow Cytometry MethodsWiley-Liss，New York，NY中描述了FACS分析。
II.樹突細(xì)胞的產(chǎn)生如下得到人CD34+細(xì)胞。見，例如，Caux，等人(1995)1-5頁，Banchereau和SchmittDendritic Cells in Fundamental andClinical ImmunologyPlenum Press，NY。在干細(xì)胞因子(SCF)、GM-CSF、和TNF-α存在下，在補(bǔ)加熱失活的胎牛血清(FBS；FlowLaboratories，Irvine，CA)、10mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺，5×10-5M 2-巰基乙醇、青霉素(100μg/ml)的無內(nèi)毒素RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO，Grand Island，NY)中培養(yǎng)外周血或臍血細(xì)胞，有時(shí)選擇CD34+。該培養(yǎng)基被稱為完全培養(yǎng)基。
將CD34+細(xì)胞以2×104個(gè)細(xì)胞/ml接種于25到75cm2培養(yǎng)瓶(Corning，NY)中擴(kuò)大。通過在第5和10天將這些培養(yǎng)物分到含有新鮮GM-CSF和TNF-α(細(xì)胞濃度1-3×105個(gè)細(xì)胞/ml)的培養(yǎng)基中以保持最優(yōu)條件。在一些情況中，在約第6天，用FACS根據(jù)CD1a表達(dá)對細(xì)胞分選。
在一些情況中，培養(yǎng)12天后常規(guī)地收集細(xì)胞，最后使用5mM EDTA溶液回收貼壁細(xì)胞。在其他情況中，將CD1a+細(xì)胞以5×106個(gè)細(xì)胞/ml重懸在完全培養(yǎng)基中活化，并用1μg/ml 12-肉豆蔻酸13-乙酸佛波酯(PMA，Sigma)和100ng/ml離子霉素(Calbiochem，La Jolla，CA)活化適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(例如，1或6h)。將這些細(xì)胞再擴(kuò)大6天，并分離用于cDNA文庫制備的RNA。
III.RNA分離和文庫構(gòu)建使用如Chirgwin，等人(1978)Biochem.185294-5299描述的硫氰酸胍/CsCl梯度方法分離總RNA。
備選地，使用OLIGOTEX mRNA分離試劑盒(QIAGEN)分離多聚(A)+RNA。用例如，用于cDNA合成和質(zhì)?？寺〉腟UPERSCRIPT質(zhì)粒系統(tǒng)(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)產(chǎn)生雙鏈cDNA。將所得雙鏈cDNA單向克隆到，例如，pSport1并通過電穿孔轉(zhuǎn)染到ELECTROMAX DH10BTM細(xì)胞(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。
IV.測序?qū)碾S機(jī)挑選的克隆或者從用未活化的細(xì)胞扣除雜交后的克隆分離的DNA用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)施核苷酸序列分析?？梢允褂肨aq雙脫氧終止子循環(huán)測序試劑盒(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。用適宜的自動(dòng)化測序儀的DNA測序凝膠分離標(biāo)記的DNA片段。備選地，如例如在Maniatis，等人(1982)Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborPress；Sambrook，等人(1989)Molecular CloningA LaboratoryManual，(第二版)，卷1-3，CSH Press，NY；Ausubel，等人，Biology，Greene Publishing Associates，Brooklyn，NY；或Ausubel，等人(1987和增刊)Current Protocols in Molecular Biology，Greene/Wiley，New York中描述的對所分離的克隆測序。也可以利用化學(xué)測序方法，例如，使用Maxam和Gilbert測序技術(shù)。
V.重組DC基因構(gòu)建體例如，使用FastTrack mRNA試劑盒(Invitrogen，San Diego，CA)從適宜的細(xì)胞群分離poly(A)+RNA。將樣品在例如含有甲醛的1％瓊脂糖凝膠中電泳并轉(zhuǎn)移到GeneScreen膜(NEN Research Products，Boston，MA)。在例如，65℃下，0.5M NaHPO4pH 7.2，7％SDS，1mMEDTA，和1％BSA(級分V)與107cpm/ml32P-dCTP標(biāo)記的DC基因cDNA的混合物中實(shí)施雜交。雜交后，將濾器在50℃下，0.2×SSC，.1％SDS中洗滌3次，例如30分鐘，然后暴露于膠片24h。陽性信號通常為背景的2倍，優(yōu)選5-25倍。
重組基因構(gòu)建體可用于產(chǎn)生檢測信息的探針?？梢郧谐迦肫尾⑵溆糜谏鲜鰴z測方法中。種間雜交和洗滌的各種標(biāo)準(zhǔn)方法是本領(lǐng)域中熟知的。見，例如，Sambrook，等人，和Ausubel。
VI.DC基因蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)用PCR制備含有可讀框的構(gòu)建體，該可讀框優(yōu)選可操作地與正確的啟動(dòng)子、選擇、和調(diào)節(jié)序列結(jié)合。將所得表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到適宜的，例如，Topp5大腸桿菌菌株(Stratagene，La Jolla，CA)。將氨芐西林抗性(50μg/ml)轉(zhuǎn)化株37℃下生長在Luria培養(yǎng)基(Gibco)中直到550nm處光密度為0.7。用0.4mM異丙基-βD-硫代乳-吡喃糖苷(Sigma，St.Louis，MO)誘導(dǎo)重組蛋白并將細(xì)胞在20℃繼續(xù)孵育18小時(shí)。通過離心從1升培養(yǎng)物收獲細(xì)胞并將細(xì)胞重懸在例如冰冷30％蔗糖、50mM TrisHCl pH8.0，1mM乙二胺四乙酸的200ml混合液中。置于冰上10分鐘后，加入冰冷卻的水至總體積2升。冰上20分鐘后，離心除去細(xì)胞并通過5μM Millipak 60(Millipore Corp.，Bedford，MA)過濾使上清液澄清。
通過標(biāo)準(zhǔn)純化方法，例如，各種離子交換層析方法純化重組蛋白。也可以使用下面描述的利用抗體的免疫親和方法?？梢允褂糜H和方法，其中表位標(biāo)記被工程化到表達(dá)構(gòu)建體中。
類似方法被用于制備真核細(xì)胞中的表達(dá)構(gòu)建體和細(xì)胞。可以如上面描述的產(chǎn)生真核啟動(dòng)子和表達(dá)載體。
VII.人DC基因作圖根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)施DNA分離、限制酶消化、瓊脂糖凝膠電泳、DNA印跡轉(zhuǎn)移和雜交。見Jenkins，等人(1982)J.Virol.4326-36。可以用Hybond-N尼龍膜(Amersham)制備印跡。用32P-dCTP標(biāo)記探針，在例如0.1×SSC，0.1％SDS，65℃的最終嚴(yán)謹(jǐn)性條件下進(jìn)行洗滌。
備選地，可以將BIOS Laboratories(New Haven，CT)小鼠體細(xì)胞雜種細(xì)胞分布板與PCR方法結(jié)合。見，F(xiàn)an，等人(1996)Immunogenetics4497-103。
如通過用PCR引物實(shí)施放射雜種作圖所確定的，人SDCMP3基因位于染色體12 p12-13(人NK受體復(fù)合體)上。
VIII.個(gè)體變異分析根據(jù)分布數(shù)據(jù)，選擇大量的容易接近的細(xì)胞類型用于從個(gè)體采樣。使用PCR技術(shù)，為該基因分析了大群體個(gè)體。用cDNA或其他PCR方法對不同個(gè)體，例如遠(yuǎn)交小鼠品系中的相應(yīng)基因測序，并比較它們的序列。這指出了種族或其他群體中分散的程度，以及確定哪些殘基可能被修飾而對功能無顯著影響。
IX.抗體的制備通過在如上面所示的大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)生重組DC蛋白，并測定其生物學(xué)活性。備選地，可以通過純化方法得到天然蛋白質(zhì)來源?？贵w試劑可用于免疫純化中，或者用于追蹤分離方法?？梢杂没钚曰蜃冃缘牡鞍酌庖哌m宜的哺乳動(dòng)物以產(chǎn)生多克隆血清，或者單克隆抗體。
X.對應(yīng)DC基因的分離將編碼這些基因的人cDNA克隆用作探針，或者用于設(shè)計(jì)PCR引物，用以發(fā)現(xiàn)各種靈長類物種，例如，黑猩猩中的對應(yīng)物。可以從其他動(dòng)物，例如，馴養(yǎng)的農(nóng)場或?qū)櫸飫?dòng)物物種鑒定其他對應(yīng)DC基因。
XI.使用試劑分析細(xì)胞群體檢測樣品中存在的樹突細(xì)胞的水平對于異常疾病狀況的診斷是重要的。例如，組織或淋巴系統(tǒng)中樹突細(xì)胞數(shù)目的增加可能指征存在DC增生，或者組織或移植物排斥。低DC群體可以指征對例如，細(xì)菌或病毒感染的異常反應(yīng)，其可能需要適宜的治療而使DC應(yīng)答正?；?。
使用對細(xì)胞表面DC蛋白特異的標(biāo)記的結(jié)合試劑的FACS分析(見，例如，Melamed，等人(1990)Flow Cytometrv and SortingWiley-Liss，Inc，New York，NY；Shapiro(1988)Practical FlowCytometryLiss，New York，NY；和Robinson，等人(1993)Handbookof Flow Cytometry MethodsWiley-Liss，New York，NY)被用于確定細(xì)胞混合物，例如，PBMCs、粘附細(xì)胞，等中存在的DC的數(shù)目。結(jié)合試劑還用于新鮮或固定的組織樣品的組織學(xué)分析以分析DC浸潤。還可以在破壞性測定，或者在細(xì)胞保持存活的某些測定中評價(jià)各種細(xì)胞群體。備選地，可以使用組織或細(xì)胞固定方法。
用，例如Murphy，等人(1993)J.Immunol.Methods162211-223中描述的半定量PCR可以定量DC轉(zhuǎn)錄物的水平。設(shè)計(jì)引物和其他方法使得基因組DNA不被檢測。
XII.制備免疫選擇性結(jié)合制劑例如，如上面描述的制備多克隆抗血清。其他脫唾液酸糖蛋白受體被用于耗盡特異結(jié)合這些受體的組分，留下將結(jié)合所希望的SDCMP3或SDCMP4的組分。這些耗盡的血清可以連接到例如，固體基質(zhì)，并用于從不純的來源免疫選擇抗原?？梢詫⒚庖哌x擇的抗原進(jìn)一步純化，該純化可使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法，例如，硫酸銨沉淀、離子交換，或其他層析方法、HPLC等?？梢杂锰禺愌甯櫦兓?，例如，確定哪些級分是所希望的蛋白質(zhì)部分。
XIII.表達(dá)分布檢測DC(從GM-CSF和TNFα中培養(yǎng)12天的CD34+祖細(xì)胞制備，用PMA和離子霉素活化1-6h)、TF1(早期骨髓樣細(xì)胞系)和U937(骨髓單核細(xì)胞系，用PMA和離子霉素活化)中靈長類SDCMP3的分布。還檢測了單核細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞和來自扁桃體的CD11 c+樹突細(xì)胞中的表達(dá)。在未活化的Jurkat、CHA、MRD5、JY細(xì)胞系、來自扁桃體的漿細(xì)胞CD11 c-樹突細(xì)胞(活化的或未活化的)、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞或粒細(xì)胞(活化的或未活化的)中沒有檢測到信號。這些數(shù)據(jù)清楚地將人SDCMP3鑒定為干預(yù)骨髓樹突細(xì)胞的靶標(biāo)，或者作為感染性疾病和癌癥的潛在診斷。
DC亞組的評價(jià)將CD34+祖細(xì)胞與GM-CSF和TNFα培養(yǎng)6天，F(xiàn)ACS-分類成CD1a+和CD14+群體。將分類的亞組在GM-CSF和TNFα中再培養(yǎng)6天，并用PMA和離子霉素活化1h或6h。檢測CD14衍生的DC，但不是CD1a衍生的DC中的表達(dá)，并且該表達(dá)被PI活化下調(diào)。在用PMA和離子霉素活化的單核細(xì)胞中檢測到更小的信號，在未活化的和用PMA、離子霉素活化的PBL中檢測到非常弱的信號。在用PMA、離子霉素活化的各種細(xì)胞T細(xì)胞、粒細(xì)胞或B細(xì)胞中沒有檢測到信號。
評估了巨噬細(xì)胞的表達(dá)，并在用PMA、離子霉素活化的單核細(xì)胞；和PBL(未活化的或用PMA、離子霉素活化的)中檢測到信號。
通過RT-PCR在下面的細(xì)胞類型中沒有檢測到SDCMP3表達(dá)朗格漢斯細(xì)胞、外周血和扁桃體CD11 c+或CD11 c-陰性DC(用或不用PMA和離子霉素，或IL-3和抗-CD40活化)、B細(xì)胞(用或不用PMA和離子霉素，或抗-CD40 mAB活化)、T細(xì)胞(用或不用PMA和離子霉素，或抗-CD3和抗-CD28mABs活化)。
通過cDNA序列數(shù)據(jù)庫中的序列表達(dá)，在來自DC、活化的單核細(xì)胞，和睪丸腫瘤的文庫中檢測到序列。
SDCMP3的鼠同系物(1469D4)包括其CRD中的甘露糖識別基序(EPN)。此外，該小鼠凝集素具有糖-結(jié)合蛋白的特征性共有WND序列。因此，可以預(yù)期1469D4將能夠結(jié)合甘露糖。由于微生物的細(xì)胞壁富含甘露糖，可能抗原呈遞細(xì)胞(DC)能夠利用凝集素捕獲并隨后通過胞外酶活性降解微生物抗原。
通過與以密切相關(guān)的形式存在的其他C-型凝集素類比，可以預(yù)測可以從人細(xì)胞鑒定SDCMP3的甘露糖-結(jié)合形式。樹突細(xì)胞上的甘露糖結(jié)合活性將代表上調(diào)靶標(biāo)，用以在感染性疾病的治療中得到潛在益處。SDCMP3的另一可能的功能可以作為DC和表達(dá)配體的其他細(xì)胞類型，例如，T細(xì)胞之間的粘附分子，從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。
SDCMP3的序列同源性和染色體定位強(qiáng)烈表明其是IRS基因的新的C-型凝集素家族的一員。SDCMP3的序列將用于通過生物信息學(xué)和PCR技術(shù)鑒定該家族的其他成員。通過與其他IRS分子類比，預(yù)測SDCMP3結(jié)合在細(xì)胞表面的信號受體復(fù)合體中?；谄湓贒C和單核細(xì)胞中的受限表達(dá)，SDCMP3將代表調(diào)節(jié)DC活化的治療性干預(yù)的選擇性靶標(biāo)。根據(jù)所闡明的與抑制(ITIM)或活化(ITAM)IRS-信號途徑的關(guān)系，SDCMP3的動(dòng)員可以抑制或者加強(qiáng)免疫應(yīng)答。
此外，SDCMP3的受限表達(dá)表明可能將藥物選擇性遞送到樹突細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系列的細(xì)胞。
通過DNA印跡從來自各種來源的cDNA文庫評估小鼠SDCMP3的分布。將來自初步擴(kuò)增的cDNA文庫的DNA(5μg)用適宜的限制性內(nèi)切酶消化以釋放插入片段，在1％瓊脂糖凝膠上電泳并轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Schleicher and Schuell，Keene，NH)上。
用于小鼠mRNA分離的樣品包括靜息小鼠成纖維細(xì)胞L細(xì)胞系(C200)；BrafER(Braf融合到雌激素受體)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、對照(C201)；T細(xì)胞，TH1極化的(來自脾臟的Mel14 bright、CD4+細(xì)胞，用IFN-γ和抗IL-4極化7天；T200)；T細(xì)胞，TH2極化的(來自脾臟的Mel14 bright、CD4+細(xì)胞，用IL-4和抗-IFN-γ極化7天；T201)；T細(xì)胞，高度TH1極化的(見Openshaw，等人(1995)J.Exp.Med.1821357-1367；用抗-CD3活化2、6、16h，合并；T202)；T細(xì)胞，高度TH2極化的(見Openshaw，等人(1995)J.Exp.Med.1821357-1367；用抗-CD3活化2、6、16h，合并；T203)；CD44-CD25+前T細(xì)胞，從胸腺分選(T204)；TH1 T細(xì)胞克隆D1.1，用抗原最后刺激后靜息3周(T205)；TH1 T細(xì)胞克隆D1.1，10μg/ml ConA刺激15h(T206)；TH2 T細(xì)胞克隆CDC35，用抗原最后刺激后靜息3周(T207)；TH2 T細(xì)胞克隆CDC35，10μg/ml ConA刺激15h(T208)；來自脾臟的Mell4+幼稚T細(xì)胞，靜息的(T209)；Mel14+T細(xì)胞，用INF-γ/IL-12/抗-IL-4極化到Th1 6、12、24h，合并(T210)；Mel14+T細(xì)胞，用IL-4/抗-INF-γ極化到Th2 6、13、24h，合并(T211)；未刺激的成熟B細(xì)胞白血病細(xì)胞系A(chǔ)20(B200)；未刺激的B細(xì)胞系CH12(B201)；來自脾臟的未刺激的大B細(xì)胞(B202)；來自總脾臟的B細(xì)胞，LPS活化的(B203)；來自脾臟的三碘苯甲酰氨基酸葡萄糖富集的樹突細(xì)胞，靜息(D200)；來自骨髓的樹突細(xì)胞，靜息的(D201)；用LPS活化4小時(shí)的單核細(xì)胞細(xì)胞系RAW 264.7(M200)；用GM和M-CSF衍生的骨髓巨噬細(xì)胞(M201)；巨噬細(xì)胞細(xì)胞系J774，靜息的(M202)；0.5、1、3、6、12h處的巨噬細(xì)胞細(xì)胞系J774+LPS+、抗IL-10，合并的(M203)；05、1、3、5、12h處的巨噬細(xì)胞細(xì)胞系J774+LPS+IL-10，合并的(M204)；氣溶膠刺激的小鼠肺組織，Th2引物、氣溶膠OVA刺激7、14、23h，合并(見Garlisi，等人(1995)Clinical Immunology andImmunopathology7575-83；X206)；Nippostrongulus-感染的肺組織(見Coffman，等人(1989)Science 245308-310；X200)；總成人肺，正常的(O200)；總肺，rag1(見Schwarz，等人(1993)Immunodeficiency4249-252；O205)；IL-10K.O.脾臟(見Kuhn等人(1991)Cell 75263-274；X201)；總成人脾臟，正常的(O201)；總脾臟，rag-1(O207)；IL-10K.O.Peyers淋巴集結(jié)(O202)；總Peyers淋巴集結(jié)，正常的(O210)；IL-10 K.O.腸系膜淋巴結(jié)(X203)；總腸系膜淋巴結(jié)，正常的(O211)；IL-10K.O.結(jié)腸(X203)；總結(jié)腸，正常的(O212)；NOD小鼠胰腺(見Makino，等人(1980)Jikken Dobutsu291-13；X205)；總胸腺，rag-1(O208)；總腎臟，rag-1(O209)；總心臟，rag-1(O202)；總腦，rag-1(O203)；總睪丸，rag-1(O204)；總肝臟，rag-1(O206)；大鼠正常關(guān)節(jié)組織(O300)；和大鼠關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)組織(X300)。
在來自骨髓的樹突細(xì)胞，靜息的(D201)；和用GM和M-CSF衍生的骨髓巨噬細(xì)胞(M201)中檢測到強(qiáng)陽性信號。在總胸腺，rag-1(O208)；和總脾臟，rag-1(O207)中檢測到弱信號。在IL-10 K.O.腸系膜淋巴結(jié)(X203)；總成人肺，正常的(O200)；和總肺，rag1(見Schwarz，等人(1993)Immunodeficiency4249-252；O205)中檢測到幾乎不能檢測到的信號。其他細(xì)胞沒有可檢測的信號。強(qiáng)信號表明該標(biāo)記可用于區(qū)分或表征樹突細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞群體或亞群。
通過PCR確定SDCMP4分布在GM-CSF和TNFα處理的樹突細(xì)胞、用PMA和離子霉素活化的單核細(xì)胞；用PMA和離子霉素活化的粒細(xì)胞；和PBL中檢測到陽性信號；在TF1、Jurkat、MRC5、JY、U937、CHA細(xì)胞系、活化的T細(xì)胞或活化的B細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)可檢測的信號；在未活化的或者用PMA和離子霉素活化的DC(來自在GM-CSF和TNFα中培養(yǎng)12天的CD34+祖細(xì)胞)中檢測到SDCMP4。還在單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和PBL(未活化的或者用PMA和離子霉素活化的)中檢測到信號。
序列數(shù)據(jù)庫顯示了原代樹突細(xì)胞(經(jīng)常)；骨髓細(xì)胞(一個(gè))；嗜酸性粒細(xì)胞(一個(gè))；胎盤扣除的(一個(gè))；和T細(xì)胞淋巴瘤(兩個(gè))中的SDCMP4序列。
SDCMP3和SDCMP4基因顯示出與人單核細(xì)胞ASGPR的鼠對應(yīng)物(M-ASGPR)的顯著同源性。同源性在碳水化合物-識別結(jié)構(gòu)域中是重要的，該結(jié)構(gòu)域賦予鼠單核細(xì)胞ASGPR對半乳糖和N-乙酰化半乳糖胺(GalNAc)的特異性。Sato，等人(1992)J.Biochem.111331-336。此外，鼠單核細(xì)胞ASGPR在其胞質(zhì)溶膠結(jié)構(gòu)域中有YENL內(nèi)化信號。CRD序列的系統(tǒng)樹表明小鼠和人SDCMP3與SDCMP2的關(guān)系比與SDCMP3的關(guān)系更近。這些CRDs似乎相互間的關(guān)系比與肝ASGPR的CRD的關(guān)系更近。
鼠M-ASGPR作為半乳糖基化糖蛋白內(nèi)吞的受體(Ozaki，等人(1992)J.Biol.Chem.2679229-9235)，允許通過腫瘤殺傷性巨噬細(xì)胞對惡性細(xì)胞的識別(Kawakami，等人(1994)Jpn.J.Cancer Res.85744-749)。在該背景中，發(fā)現(xiàn)M-ASGPR在攜帶OV2944-HM-1轉(zhuǎn)移性卵巢腫瘤細(xì)胞的小鼠的肺轉(zhuǎn)移瘤中表達(dá)(Imai，等人(1995)Immunol.86591-598)。有趣的是，人M-ASGPR表現(xiàn)出對Tn抗原的顯著特異性(Suzuki，等人(1996)J.Immunol.156128-135)，該抗原具有一簇絲氨酸或蘇氨酸連接的末端GalNac，并且與人癌相關(guān)(Springer(1989)Mol.Immunol.261-5；andrntoft，等人(1990)Int.J.Cancer 45666-672)。
基于序列同源性，可以預(yù)測SDCMPs也作為半乳糖基化糖蛋白的內(nèi)吞受體。此外，通過甘露糖受體的配體內(nèi)化，另一C-型跨膜內(nèi)吞凝集素導(dǎo)致DC通過MHC II類途徑的高效抗原呈遞。Cella，等人(1997)Current Opinion Immunol.910-16。通過類比，SDCMPs可以在將內(nèi)化的配體導(dǎo)入抗原呈遞途徑中起類似作用。
從而，SDCMP4可能是在基于免疫的佐劑治療中的潛在高效靶標(biāo)以將抗原裝入DC從而增強(qiáng)向T細(xì)胞的呈遞。這可以用抗原的半乳糖基化形式，或者用偶聯(lián)抗原的抗-SDCMP4 mABs體外刺激DC來實(shí)現(xiàn)。通過抗原特異的T細(xì)胞活化可以體外測定呈遞效率。由于這種方法的內(nèi)在治療前景，這可以集中在腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的呈遞。尤其重要的是與惡性黑素瘤相關(guān)的TAA。
此外，人M-ASGPR對Tn抗原的特異性使得該癌TAA是選擇靶定SDCMP4的候選者。
如最近所表明的，外來抗原可被加工并以MHC I類途徑呈遞。見Porgador和Gilboa(1995)J.Exp.Med.182255-260；和Paglia，等人(1996)J.Exp.Med.183317-322。專門的受體可能在DC中執(zhí)行這種功能。
DC中的這些受體可被靶定以幫助產(chǎn)生TAA-特異的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，其具有重要的治療潛力，因?yàn)镃TL似乎與腫瘤排斥的誘導(dǎo)有關(guān)。
XV.結(jié)合對應(yīng)物的分離通過利用DC蛋白的結(jié)合特異性，就像利用抗體一樣，可以將DC蛋白用作特異結(jié)合試劑。將結(jié)合試劑如上面描述的，例如用熒光或其他物質(zhì)標(biāo)記，或者固定到用于淘選方法的基質(zhì)。
該DC蛋白用于篩選表現(xiàn)出結(jié)合的細(xì)胞系。使用標(biāo)準(zhǔn)染色技術(shù)檢測或分選細(xì)胞內(nèi)或表面表達(dá)的配體，或者通過淘選篩選表面表達(dá)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。通過各種染色或免疫熒光方法篩選細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。也見McMahan，等人(1991)EMBO J.102821-2832。
例如，在第0天，用每個(gè)小室1ml 10ng/ml溶于PBS的纖連蛋白室溫下預(yù)包被2-室permanox載玻片30分鐘。用PBS洗滌一次。然后將1.5ml生長培養(yǎng)基中的COS細(xì)胞以2-3×105個(gè)細(xì)胞/小室鋪板。37℃過夜孵育。
在第一天，對于每個(gè)樣品，制備溶于無血清DME的66mg/ml DEAE-葡聚糖、66mM氯喹，和4mg DNA溶液0.5ml。對于每一組，制備陽性對照，例如1和1/200稀釋的人受體-FLAG cDNA，和陰性模擬物。用無血清的DME洗滌細(xì)胞。加入DNA溶液并在37℃孵育5小時(shí)。除去培養(yǎng)基并加入DME中的10％DMSO 0.5ml并保持2.5分鐘。除去并用DME洗滌1次。加入1.5ml生長培養(yǎng)基并過夜孵育。
在第二天，更換培養(yǎng)基。在第3或4天，固定細(xì)胞并染色。用Hank’s緩沖鹽溶液(HBSS)洗滌細(xì)胞兩次并在4％多聚甲醛(PFA)/葡萄糖中固定5分鐘。用HBSS洗滌3次。所有液體都除去后，可以將載玻片保存在-80℃。對于每個(gè)小室，如下實(shí)施0.5ml孵育。用32ml/ml 1MNaN3加入HBSS/皂甙(0.1％)20分鐘。用HBSS/皂甙1×洗滌細(xì)胞。向細(xì)胞加入蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)/抗體復(fù)合體并孵育30分鐘。用HBSS/皂甙洗滌細(xì)胞兩次。如果適宜，加入第一抗體30分鐘。加入第二抗體，例如，以1/200稀釋的Vector抗-小鼠抗體，并孵育30分鐘。制備ELISA溶液，例如，Vector Elite ABC辣根過氧化物酶溶液，并預(yù)孵育30分鐘。每2.5ml HBSS/皂甙使用例如，一滴溶液A(抗生物素蛋白)和一滴溶液B(生物素)。用HBSS/皂甙洗滌細(xì)胞兩次。加入ABC HRP溶液并孵育30分鐘。用HBSS洗滌細(xì)胞兩次，再次洗滌2分鐘，其封閉細(xì)胞。然后加入Vector二氨基苯甲酸(DAB)5到10分鐘。每5毫升玻璃蒸餾水使用2滴緩沖液加4滴DAB加2滴H2O2。小心除去小室并在水中洗滌載玻片?？諝飧稍飵追昼?，然后加入1滴Crystal Mount和蓋玻片。85-90℃烘烤5分鐘。
備選地，使用結(jié)合試劑特異的其他單核細(xì)胞蛋白以親和純化或者篩選表達(dá)受體的細(xì)胞。見，例如，Sambrook，等人或Ausubel，等人。
另一策略是通過淘選篩選膜結(jié)合的受體。如上述構(gòu)建受體cDNA。該配體可被固定并用于固定表達(dá)細(xì)胞。使用識別例如，單核細(xì)胞蛋白融合構(gòu)建體的FLAG序列，或者使用針對第一抗體產(chǎn)生的抗體可以實(shí)現(xiàn)固定。循環(huán)使用選擇和擴(kuò)增可以富集適宜的克隆并最終分離表達(dá)配體的克隆。
通過單核細(xì)胞蛋白可以篩選噬菌體表達(dá)文庫。適宜的標(biāo)記技術(shù)，例如，抗-FLAG抗體，將允許特異標(biāo)記適宜的克隆。
如對本領(lǐng)域中技術(shù)人員顯而易見的，可以對本發(fā)明做出許多修飾和改變而不背離其精神和范圍。此處描述的特定實(shí)施方案僅通過實(shí)施例提供，并且本發(fā)明僅被所述權(quán)利要求書，以及這些權(quán)利要求的等價(jià)方案的完整范圍所限制。
序列表<110>Schering Corporation<120>分離的哺乳動(dòng)物膜蛋白基因和相關(guān)試劑<130>SF0802 QK WI<150>US 10/270,470<151>2002-10-11<160>10<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>850<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(108)..(593)<223>
<400>1gtccctgagc tctagcttct ttaaatgaag ctgagtctct gggcaacatc tttagggaga 60gaggtacaaa aggttcctgg accttctcaa cacagggagc ctgcata atg atg caa 116Met Met Gln1gag cag caa cct caa agt aca gag aaa aga ggc tgg ttg tcc ctg aga 164Glu Gln Gln Pro Gln Ser Thr Glu Lys Arg Gly Trp Leu Ser Leu Arg5 10 15ctc tgg tct gtg gct ggg att tcc att gca ctc ctc agt gct tgc ttc 212Leu Trp Ser Val Ala Gly Ile Ser Ile Ala Leu Leu Ser Ala Cys Phe20 25 30 35att gtg agc tgt gta gta act tac cat ttt aca tat ggt gaa act ggc 260Ile Val Ser Cys Val Val Thr Tyr His Phe Thr Tyr Gly Glu Thr Gly40 45 50aaa agg ctg tct gaa cta cac tca tat cat tca agt ctt acc tgc ttc 308Lys Arg Leu Ser Glu Leu His Ser Tyr His Ser Ser Leu Thr Cys Phe55 60 65agt gaa ggg aca aag gtg cca gcc tgg gga tgt tgc cca gct tct tgg 356Ser Glu Gly Thr Lys Val Pro Ala Trp Gly Cys Cys Pro Ala Ser Trp70 75 80aag tca ttt ggt tcc agt tgc tac ttc att tcc agt gaa gag aag gtt 404Lys Ser Phe Gly Ser Ser Cys Tyr Phe Ile Ser Ser Glu Glu Lys Val85 90 95tgg tct aag agt gag cag aac tgt gtt gag atg gga gca cat ttg gtt 452Trp Ser Lys Ser Glu Gln Asn Cys Val Glu Met Gly Ala His Leu Val100 105 110 115
gtg ttc aac aca gaa gca gag cag aat ttc att gtc cag cag ctg aat 500Val Phe Asn Thr Glu Ala Glu Gln Asn Phe Ile Val Gln Gln Leu Asn120 125 130gag tca ttt tct tat ttt ctg ggg ctt tca gac cca caa ggt aat aat 548Glu Ser Phe Ser Tyr Phe Leu Gly Leu Ser Asp Pro Gln Gly Asn Asn135 140 145aat tgg caa tgg att gat aag aca cct tat gag aaa aat gtc agg 593Asn Trp Gln Trp Ile Asp Lys Thr Pro Tyr Glu Lys Asn Val Arg150 155 160tgagtgcagt tctggggcct tgtttacata gaaaatctag ggaaattttg ttaggagtta653ctaataatgt taatattggt aattatgata acaggatcta acaattatta agcattacta713aggatatgca ttatctcact taaacttcat gaaaacttct ctttttatga actaatttta773cagataaaaa attaaataac ttgccccaaa tcaataaact aataagatga gaaactggat833gtcaactcca tgtcaag 850<210>2<211>162<212>PRT<213>人<400>2Met Met Gln Glu Gln Gln Pro Gln Ser Thr Glu Lys Arg Gly Trp Leu1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Trp Ser Val Ala Gly Ile Ser Ile Ala Leu Leu Ser20 25 30Ala Cys Phe Ile Val Ser Cys Val Val Thr Tyr His Phe Thr Tyr Gly35 40 45Glu Thr Gly Lys Arg Leu Ser Glu Leu His Sar Tyr His Ser Ser Leu50 55 60Thr Cys Phe Ser Glu Gly Thr Lys Val Pro Ala Trp Gly Cys Cys Pro65 70 75 60Ala Ser Trp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Cys Tyr Phe Ile Ser Ser Glu85 90 95Glu Lys Val Trp Ser Lys Ser Glu Gln Asn Cys Val Glu Met Gly Ala100 105 110His Leu Val Val Phe Asn Thr Glu Ala Glu Gln Asn Phe Ile Val Gln
115 120 125Gln Leu Asn Glu Ser Phe Ser Tyr Phe Leu Gly Leu Ser Asp Pro Gln130 135 140Gly Asn Asn Asn Trp Gln Trp Ile Asp Lys Thr Pro Tyr Glu Lys Asn145 150 155 160Val Arg<210>3<211>630<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>CDS<222>(1)..(627)<223>
<400>3atg gtg cag gaa aga caa tcc caa ggg aag gga gtc tgc tgg acc ctg 48Met Val Gln Glu Arg Gln Ser Gln Gly Lys Gly Val Cys Trp Thr Leu1 5 10 15aga ctc tgg tca gct gct gtg att tcc atg tta ctc ttg agt acc tgt 96Arg Leu Trp Ser Ala Ala Val Ile Ser Met Leu Leu Leu Ser Thr Cys20 25 30ttc att gcg agc tgt gtg gtg act tac caa ttt att atg gac cag ccc 144Phe Ile Ala Ser Cys Val Val Thr Tyr Gln Phe Ile Met Asp Gln Pro35 40 45agt aga aga cta tat gaa ctt cac aca tac cat tcc agt ctc acc tgc 192Ser Arg Arg Leu Tyr Glu Leu His Thr Tyr His Ser Ser Leu Thr Cys50 55 60ttc agt gaa ggg act atg gtg tca gaa aaa atg tgg gga tgc tgc cca 240Phe Ser Glu Gly Thr Met Val Ser Glu Lys Met Trp Gly Cys Cya Pro65 70 75 80aat cac tgg aag tca ttt ggc tcc agc tgc tac ctc att tct acc aag 288Asn His Trp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Cys Tyr Leu Ile Ser Thr Lys85 90 95gag aac ttc tgg agc acc agt gag cag aac tgt gtt cag atg ggg gct 336Glu Asn Phe Trp Ser Thr Ser Glu Gln Asn Cys Val Gln Met Gly Ala100 105 110cat ctg gtg gtg atc aat act gaa gcg gag cag aat ttc atc acc cag 384His Leu Val Val Ile Asn Thr Glu Ala Glu Gln Asn Phe Ile Thr Gln115 120 125cag ctg aat gag tca ctt tct tac ttc ctg ggt ctt tcg gat cca caa 432
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115 120 125Gln Leu Asn Glu Ser Leu Ser Tyr Phe Leu Gly Leu Ser Asp Pro Gln130 135 140Gly Asn Gly Lys Trp Gln Trp Ile Asp Asp Thr Pro Phe Ser Gln Asn145 150 155 160Val Arg Phe Trp His Pro His Glu Pro Asn Leu Pro Glu Glu Arg Cys165 170 175Val Ser Ile Val Tyr Trp Asn Pro Ser Lys Trp Gly Trp Asn Asp Val180 185 190Phe Cys Asp Ser Lys His Asn Ser Ile Cys Glu Met Lys Lys Ile Tyr195 200 205Leu<210>5<211>1018<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(160)..(900)<223>
<400>5atctggttga actacttaag cttaatttgt taaactccgg taagtaccta gcccacatga 60tttgactcag agattctctt ttgtccacag acagtcatct caggagcaga aagaaaagag120ctcccaaatg ctatatctat tcaggggctc tcaagaaca atg gaa tat cat cct 174Met Glu Tyr His Pro1 5gat tta gaa aat ttg gat gaa gat gga tat act caa tta cac ttc gac 222Asp Leu Glu Asn Leu Asp Glu Asp Gly Tyr Thr Gln Leu His Phe Asp10 15 20tct caa agc aat acc agg ata gct gtt gtt tca gag aaa gga tcg tgt 270Ser Gln Ser Asn Thr Arg Ile Ala Val Val Ser Glu Lys Gly Ser Cys25 30 35gct gca tct cct cct tgg cgc ctc att gct gta att ttg gga atc cta 318Ala Ala Ser Pro Pro Trp Arg Leu Ile Ala Val Ile Leu Gly Ile Leu40 45 50tgc ttg gta ata ctg gtg ata gct gtg gtc ctg ggt acc atg gct att 366
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<400>6Met Glu Tyr His Pro Asp Leu Glu Asn Leu Asp Glu Asp Gly Tyr Thr1 5 10 15Gln Leu His Phe Asp Ser Gln Ser Asn Thr Arg Ile Ala Val Val Ser20 25 30Glu Lys Gly Ser Cys Ala Ala Ser Pro Pro Trp Arg Leu Ile Ala Val35 40 45Ile Leu Gly Ile Leu Cys Leu Val Ile Leu Val Ile Ala Val Val Leu50 55 60Gly Thr Met Ala Ile Trp Arg Ser Asn Ser Gly Ser Asn Thr Leu Glu65 70 75 80Asn Gly Tyr Phe Leu Ser Arg Asn Lys Glu Asn His Ser Gln Pro Thr85 90 95Gln Ser Ser Leu Glu Asp Ser Val Thr Pro Thr Lys Ala Val Lys Thr100 105 110Thr Gly Val Leu Ser Ser Pro Cys Pro Pro Asn Trp Ile Ile Tyr Glu115 120 125Lys Ser Cys Tyr Leu Phe Ser Met Ser Leu Asn Ser Trp Asp Gly Ser130 135 140Lys Arg Gln Cys Trp Gln Leu Gly Ser Asn Leu Leu Lys Ile Asp Ser145 150 155 160Ser Asn Glu Leu Gly Phe Ile Val Lys Gln Val Ser Ser Gln Pro Asp165 170 175Asn Ser Phe Trp Ile Gly Leu Ser Arg Pro Gln Thr Glu Val Pro Trp180 185 190Leu Trp Glu Asp Gly Ser Thr Phe Ser Ser Asn Leu Phe Gln Ile Arg195 200 205Thr Thr Ala Thr Gln Glu Asn Pro Ser Pro Asn Cys Val Trp Ile His210 215 220Val Ser Val Ile Tyr Asp Gln Leu Cys Ser Val Pro Ser Tyr Ser Ile
25 230 235 240Cys Glu Lys Lys Phe Ser Met245<210>7<211>880<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(160)..(762)<223>
<400>7atctggttga actacttaag cttaatttgt taaactccgg taagtaccta gcccacatga 60tttgactcag agattctctt ttgtccacag acagtcatct caggagccga aagaaaagag120ctcccaaatg ctatatctat tcaggggctc tcaagaaca atg gaa tat cat cct 174Met Glu Tyr His Pro1 5gat tta gaa aat ttg gat gaa gat gga tat act caa tta cac ttc gac 222Asp Leu Glu Asn Leu Asp Glu Asp Gly Tyr Thr Gln Leu His Phe Asp10 15 20tct caa agc aat acc atg ata gct gtt gtt tca gag aaa gga tcg tgt 270Ser Gln Asr Asn Thr Met Ile Ala Val Val Ser Glu Lys Gly Ser Cys25 30 35gct gca tct cct cct tgg cgc ctc att gct gta att ttg gga atc cta 318Ala Ala Ser Pro Pro Trp Arg Leu Ile Ala Val Ile Leu Gly Ile Leu40 45 50tgc ttg gta ata ctg gtg ata gct gtg gtc ctg ggt acc atg ggg gtt 366Cys Leu Val Ile Leu Val Ile Ala Val Val Leu Gly Thr Met Gly Val55 60 65ctt tcc agc cct tgt cct cct aat tgg att ata tat gag aag agc tgt 414Leu Ser Ser Pro Cys Pro Pro Asn Trp Ile Ile Tyr Glu Lys Ser Cys70 75 80 85tat cta ttc agc atg tca cta aat tcc tgg gat gga agt aaa aga caa 462Tyr Leu Phe Ser Met Ser Leu Asn Ser Trp Asp Gly Ser Lys Arg Gln90 95 100tgc tgg caa ctg ggc tct aat ctc cta aag ata gac agc tca aat gaa 510Cys Trp Gln Leu Gly Ser Asn Leu Leu Lys Ile Asp Ser Ser Asn Glu105 110 115ttg gga ttt ata gta aaa caa gtg tct tcc caa cct gat aat tca ttt 558Leu Gly Phe Ile Val Lys Gln Val Ser Ser Gln Pro Asp Asn Ser Phe120 125 130tgg ata ggc ctt tct cgg ccc cag act gag gta cca tgg ctc tgg gag 606
Trp Ile Gly Leu Ser Arg Pro Gln Thr Glu Val Pro Trp Leu Trp Glu135 140 145gat gga tca aca ttc tct tct aac tta ttt cag atc aga acc aca gct654Asp Gly Ser Thr Phe Ser Ser Asn Leu Phe Gln Ile Arg Thr Thr Ala150 155 160 165acc caa gaa aac cca tct cca aat tgt gta tgg att cac gtg tca gtc702Thr Gln Glu Asn Pro Ser Pro Asn Cys Val Trp Ile His Val Ser Val170 175 180att tat gac caa ctg tgt agt gtg ccc tca tat agt att tgt gag aag750Ile Tyr Asp Gln Leu Cys Ser Val Pro Ser Tyr Ser Ile Cys Glu Lys185 190 195aag ttt tca atg taaggggaag ggtggagaag gagagagaaa tatgtgaggt802Lys Phe Ser Met200agttaaggag gacagaaaac agaacagaaa agagtaacag ctgagggtca agataaatgc 862agaaaatgtt tagagagc880<210>8<211>201<212>PRT<213>人<400>8Met Glu Tyr His Pro Asp Leu Glu Asn Leu Asp Glu Asp Gly Tyr Thr1 5 10 15Gln Leu His Phe Asp Ser Gln Ser Asn Thr Met Ile Ala Val Val Ser20 25 30Glu Lys Gly Ser Cys Ala Ala Ser Pro Pro Trp Arg Leu Ile Ala Val35 40 45Ile Leu Gly Ile Leu Cys Leu Val Ile Leu Val Ile Ala Val Val Leu50 55 60Gly Thr Met Gly Val Leu Ser Ser Pro Cys Pro Pro Asn Trp Ile Ile65 70 75 80Tyr Glu Lys Ser Cys Pyr Leu Phe Ser Met Ser Leu Asn Ser Trp Asp85 90 95Gly Ser Lys Arg Gln Cys Trp Gln Leu Gly Ser Asn Leu Leu Lys Ile100 105 110Asp Ser Ser Asn Glu Leu Gly Phe Ile Val Lys Gln Val Ser Ser Gln
115 120 125Pro Asp Asn Ser Phe Trp Ile Gly Leu Ser Arg Pro Gln Thr Glu Val130 135 140Pro Trp Leu Trp Glu Asp Gly Ser Thr Phe Ser Ser Asn Leu Phe Gln145 150 155 160Ile Arg Thr Thr Ala Thr Gln Glu Asn Pro Ser Pro Asn Cys Val Trp165 170 175Ile His Val Ser Val Ile Tyr Asp Gln Leu Cys Ser Val Pro Ser Tyr180 185 190Ser Ile Cys Glu Lys Lys Phe Ser Met195 200<210>9<211>1045<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(108)..(734)<223>
<400>9gtccctgagc tctagcttct ttaaatgaag ctgagtctct gggcaacatc tttagggaga 60gaggtacaaa aggttcctgg accttctcaa cacagggagc ctgcata atg atg caa 116Met Met Gln1gag cag caa cct caa agt aca gag aaa aga ggc tgg ttg tcc ctg aga 164Glu Gln Gln Pro Gln Ser Thr Glu Lys Arg Gly Trp Leu Ser Leu Arg5 10 15ctc tgg tct gtg gct ggg att tcc att gca ctc ctc agt gct tgc ttc 212Leu Trp Ser Val Ala Gly Ile Ser Ile Ala Leu Leu Ser Ala Cys Phe20 25 30 35att gtg agc tgt gta gta act tac cat ttt aca tat ggt gaa act ggc 260Ile Val Ser Cys Val Val Thr Tyr His Phe Thr Tyr Gly Glu Thr Gly40 45 50aaa agg ctg tct gaa cta cac tca tat cat tca agt ctc acc tgc ttc 308Lys Arg Leu Ser Glu Leu His Ser Tyr His Ser Ser Leu Thr Cys Phe55 60 65agt gaa ggg aca aag gtg cca gcc tgg gga tgt tgc cca gct tct tgg 356Ser Glu Gly Thr Lys Val Pro Ala Trp Gly Cys Cys Pro Ala Ser Trp70 75 80
aag tca ttt ggt tcc agt tgc tac ttc att tcc agt gaa gag aag gtt 404Lys Ser Phe Gly Ser Ser Cys Tyr Phe Ile Ser Ser Glu Glu Lys Val85 90 95tgg tct aag agt gag cag aac tgt gtt gag atg gga gca cat ttg gtt 452Trp Ser Lys Ser Glu Gln Asn Cys Val Glu Met Gly Ala His Leu Val100 105 110 115gtg ttc aac aca gaa gca gag cag aat ttc att gtc cag cag ctg aat 500Val Phe Asn Thr Glu Ala Glu Gln Asn Phe Ile Val Gln Gln Leu Asn120 125 130gag tca ttt tct tat ttt ctg ggg ctt tca gac cca caa ggt aat aat 548Glu Ser Phe Ser Tyr Phe Leu Gly Leu Ser Asp Pro Gln Gly Asn Asn135 140 145aat tgg caa tgg att gat aag aca cct tat gag aaa aat gtc aga ttt 596Asn Trp Gln Trp Ile Asp Lys Thr Pro Tyr Glu Lys Asn Val Arg Phe150 155 160tgg cac cta ggt gag ccc aat cat tct gca gag caa tgt gct tca ata 644Trp His Leu Gly Glu Pro Asn His Ser Ala Glu Gln Cys Ala Ser Ile165 170 175gtc ttc tgg aaa cct aca gga tgg ggc tgg aat gat gtt atc tgt gaa 692Val Phe Trp Lys Pro Thr Gly Trp Gly Trp Asn Asp Val Ile Cys Glu180 185 190 195act aga agg aat tca ata tgt gag atg aat aaa att tac cta 734Thr Arg Arg Asn Ser Ile Cys Glu Met Asn Lys Ile Tyr Leu200 205tgagtagaag cttaattgga aagaagagaa gaattactga cgtaattttt tccctgacgt794ctttaaaatt gaaccctatc atgaaatgat aatttcttcc tgaatttaca cataatcctt854atgttataga ggttcacaga aatggaaaga tacctgtttc cctttaatca atcttctcgt914ttcctctttt ccattaatga tagaatgcac ccttcctctc tttgttccat tctttcactt974gttattcatt tttttctttc ttcacacttc attacacaaa tatttattgt ttcagagact 1034gtactatttt g1045<210>10<211>209<212>PRT<213>人<400>10Met Met Gln Glu Gln Gln Pro Gln Ser Thr Glu Lys Arg Gly Trp Leu1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Trp Ser Val Ala Gly Ile Ser Ile Ala Leu Leu Ser20 25 30
Ala Cys Phe Ile Val Ser Cys Val Val Thr Tyr His Phe Thr Tyr Gly35 40 45Glu Thr Gly Lys Arg Leu Ser Glu Leu His Ser Tyr His Ser Ser Leu50 55 60Thr Cys Phe Ser Glu Gly Thr Lys Val Pro Ala Trp Gly Cys Cys Pro65 70 75 80Ala Ser Trp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Cys Tyr Phe Ile Ser Ser Glu85 90 95Glu Lys Val Trp Ser Lys Ser Glu Gln Asn Cys Val Glu Met Gly Ala100 105 110His Leu Val Val Phe Asn Thr Glu Ala Glu Gln Asn Phe Ile Val Gln115 120 125Gln Leu Asn Glu Ser Phe Ser Tyr Phe Leu Gly Leu Ser Asp Pro Gln130 135 140Gly Asn Asn Asn Trp Gln Trp Ile Asp Lys Thr Pro Tyr Glu Lys Asn145 150 155 160Val Arg Phe Trp His Leu Gly Glu Pro Asn His Ser Ala Glu Gln Cys165 170 175Ala Ser Ile Val Phe Trp Lys Pro Thr Gly Trp Gly Trp Asn Asp Val180 185 190Ile Cys Glu Thr Arg Arg Asn Ser Ile Cys Glu Met Asn Lys Ile Tyr195 200 205Leu
權(quán)利要求
1.分離的結(jié)合化合物，該化合物特異結(jié)合含有SEQ ID NO2、4、6、8或10的多肽。
2.權(quán)利要求1的結(jié)合化合物，其中該結(jié)合化合物是抗體或其抗體結(jié)合片段。
3.權(quán)利要求2的結(jié)合化合物，其中抗體結(jié)合片段是a)Fv片段；b)Fab片段；或c)Fab2片段。
4.權(quán)利要求2的結(jié)合化合物，其中抗體是a)多克隆抗體；b)單克隆抗體；或c)人源化抗體。
5.使用權(quán)利要求1的結(jié)合化合物的方法，該方法包括將結(jié)合化合物與含有抗原的樣品接觸以形成結(jié)合組合物抗原復(fù)合體。
6.權(quán)利要求4的方法，其中該a)樣品是生物樣品，包括體液；b)樣品是人；c)抗原在細(xì)胞上；d)抗原被進(jìn)一步純化；或e)方法提供了所述抗原的空間定位或分布。
7.含有權(quán)利要求1的結(jié)合組合物的檢測試劑盒，和a)關(guān)于所述試劑盒中試劑的使用或處理的使用說明材料；或b)隔室，其提供了所述試劑盒的結(jié)合組合物或其他試劑的隔離。
8.基本上純或分離的多肽，其特異結(jié)合權(quán)利要求1的結(jié)合化合物。
9.權(quán)利要求8的多肽，其中該多肽含有SEQ ID NO2、4、6、8或10。
10.使用權(quán)利要求8的多肽的方法，該方法包括將所述多肽與抗體在適于形成抗體多肽復(fù)合體的條件下接觸。
11.含有權(quán)利要求8的所述多肽的檢測試劑盒，和a)關(guān)于所述試劑盒中試劑的使用或處理的使用說明材料；或b)隔室，其提供了所述試劑盒的多肽或其他試劑的隔離。
12.編碼權(quán)利要求8的多肽的分離的或純化的核酸。
13.權(quán)利要求12的核酸，其含有SEQ ID NO1、3、5、7或9。
14.分離的或純化的核酸，其在嚴(yán)格條件下與權(quán)利要求12的核酸雜交。
15.含有權(quán)利要求12的核酸的表達(dá)載體。
16.含有權(quán)利要求15的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
17.權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞，其中宿主是a)哺乳動(dòng)物細(xì)胞；b)細(xì)菌細(xì)胞；c)昆蟲細(xì)胞；或d)酵母細(xì)胞。
18.產(chǎn)生多肽的方法，該方法包括將權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞在適宜條件下培養(yǎng)以表達(dá)該多肽并純化該多肽。
19.調(diào)節(jié)樹突細(xì)胞生理或功能的方法，該方法包括將細(xì)胞與SEQ IDNO2、4、6、8或10的激動(dòng)劑或拮抗劑接觸的步驟。
20.權(quán)利要求19的方法，其中拮抗劑是抗體。
21.權(quán)利要求19的方法，其中該接觸是與抗原，包括細(xì)胞表面抗原、MHC I類或MHC II類抗原相聯(lián)合。
全文摘要
描述了編碼來自靈長類的各種淋巴細(xì)胞蛋白的核酸、與其相關(guān)試劑，包括特異抗體，和純化的蛋白。還提供了使用所述試劑的方法和相關(guān)的診斷試劑盒。
文檔編號A61K39/395GK1886155SQ200380105581
公開日2006年12月27日 申請日期2003年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月11日
發(fā)明者L·查魯斯, A·B·荃, E·E·M·把特斯, D·M·戈曼, S·薩爾蘭德, S·J·E·勒伯格, J·H·小菲利普斯 申請人:先靈公司