專利名稱：細(xì)胞角蛋白19片段化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞角蛋白19片 段化學(xué)發(fā)光免疫分析定量測(cè)定試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
肺癌具有惡性程度高、病程發(fā)展快的特點(diǎn)。近年來其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，是 危害人類健康和導(dǎo)致人類死亡的常見腫瘤之一。肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)。 NSCLC是肺癌中最常見的一種，約占肺癌病 例的70%~80%，各期肺癌的五年存活率只有13%。因此提高肺癌的診斷水平， 對(duì)患者的及時(shí)治療和預(yù)后監(jiān)測(cè)具有重要意義。
可溶性細(xì)胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment, CYFRA21-1)是一種新 的腫瘤標(biāo)記物，尤其對(duì)非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer, NSCLC)的診斷有 重要意義。
細(xì)胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment)中的CYFRA21-1是一種分化特 異的蛋白質(zhì)，是一種等電點(diǎn)為5.2，相對(duì)分子質(zhì)量為40,000的酸性胞漿蛋白，屬于 細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白范疇，廣泛存在于上皮細(xì)胞，是組成細(xì)胞骨架的蛋白質(zhì)之一。由它 形成的細(xì)胞體中間絲的某些片段是可溶的，并且可以用兩種單克隆抗體(BM19.21 和KS19.1)識(shí)別出細(xì)胞角蛋白19的21和1兩個(gè)表位(抗原決定簇)。該片段即取 名為可溶性細(xì)胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment, CYFRA21-1)，它在正常 人血清中含量較低，在上皮源性惡性腫瘤時(shí)常有過量表達(dá)，并且由于患惡性腫瘤 時(shí)激活的蛋白酶加速細(xì)胞角蛋白19的降解，使得大量CYFRA21-1產(chǎn)生。在上皮 細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，激活的蛋白酶加速角蛋白的降解，使得大量角蛋白片段釋
放人血循環(huán)，尤其是CYFRA21-1在肺癌患者血循環(huán)中含量豐富，是近年來被推廣 的一種新型肺癌標(biāo)志物。
CYFRA21-1是細(xì)胞角蛋白19的片段，由細(xì)胞結(jié)構(gòu)中主要成分細(xì)胞角蛋白19 的兩個(gè)單克隆抗體(BM19.21和KS19.1)組成，它是一種可溶性酸性多肽。近年 來，國內(nèi)外學(xué)者利用針對(duì)細(xì)胞角蛋白19片段的兩種特異性單克隆抗體(BM19.21 和KS19.1)建立起了多種檢測(cè)各種體液或血液中細(xì)胞角蛋白19片段的特異性方法。 同時(shí)測(cè)定神經(jīng)特異烯醇化酶(NSE)和癌胚抗原(CEA)含量，可以顯著提高肺癌 診斷的特異性。
自從1959年，Yallow和Berson發(fā)明了免疫分析之后，免疫分析在臨床化學(xué)領(lǐng) 域中日益成為主要的分析工具。免疫分析可以分為以放射免疫分析(RIA)為代表 的第一代免疫分析技術(shù)，以酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)為代表的第二代免疫分析 技術(shù)，以化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)為代表的第三代免疫分析技術(shù)，以及新興起 的第四代微粒體發(fā)光免疫分析技術(shù)。
對(duì)CYFRA21-1的定量分析，目前常用的是放射免疫分析(RIA)和酶聯(lián)免疫 吸附分析(ELISA)，其中RIA必須用^I等放射性元素標(biāo)記，檢測(cè)設(shè)備復(fù)雜，必 須用專門的儀器測(cè)定，其放射性核素的半衰期短，不能長(zhǎng)期保存，同時(shí)也給實(shí)驗(yàn) 操作人員帶來了放射性傷害。ELISA檢測(cè)靈敏度不夠高，檢測(cè)范圍窄，影響因素 較多，易造成假陰性和假陽性等缺點(diǎn)也不能滿足臨床的要求，因此，化學(xué)發(fā)光免 疫分析方法(CLIA)應(yīng)運(yùn)而生。
20世紀(jì)70年代，Arakawe首次報(bào)道利用化學(xué)發(fā)光分析超微量物質(zhì)，尤其是臨 床分析微量的活性物質(zhì)，隨后化學(xué)發(fā)光在臨床上的應(yīng)用進(jìn)入一個(gè)飛速發(fā)展的時(shí)期。 化學(xué)發(fā)光免疫分析方法(CLIA)靈敏度高，可以達(dá)到10—18mol/L;快速，發(fā)光信
號(hào)在幾秒鐘內(nèi)產(chǎn)生；操作簡(jiǎn)便，測(cè)試過程中不使用有害試劑。化學(xué)發(fā)光免疫分析 法因標(biāo)記方法的不同而分為直接標(biāo)記法和化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法。
現(xiàn)有技術(shù)中的化學(xué)發(fā)光免疫分析定量試劑盒為封閉式全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)量系 統(tǒng)，需要昂貴的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x，從而限制了推廣使用，無法廣泛地應(yīng)用 于臨床診斷和科研工作。本發(fā)明是在酶聯(lián)免疫分析的基礎(chǔ)上應(yīng)用酶催化發(fā)光底物， 通過檢測(cè)發(fā)光底物產(chǎn)生的光信號(hào)代替酶聯(lián)免疫分析中的顯色底物，因而其靈敏度 大大提高，并且操作簡(jiǎn)便適用性廣，既可應(yīng)用于開放式的半自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x， 也可用于全自動(dòng)的測(cè)量系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)大批量快檢測(cè)，使用成本低，更易推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述問題提出并完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)胞角蛋白19片段化學(xué)發(fā)光免疫分析定量測(cè)定試 劑盒。
本發(fā)明的再一目的是提供一種制備上述試劑盒的方法。
根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞角蛋白19片段化學(xué)發(fā)光免疫分析定量測(cè)定試劑盒包括
1) 細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1校準(zhǔn)品；
2) 細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體包被的固相載體；
3) 酶標(biāo)記的細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體；以及
4) 上述酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆 抗體優(yōu)選為BM19.21和/或KS19.1。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管 或磁性顆粒。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述標(biāo)記酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述化學(xué)發(fā)光底物為1,2-二氧乙垸類衍生 物、魯米諾或異魯米諾。
優(yōu)選地，上述試劑盒中，所述1，2-二氧乙烷類衍生物為(金剛垸)-1，2-二 氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l， 2-二氧乙垸、 CSPD或CDP- Star。
本發(fā)明提供了一種制備上述試劑盒的方法，包括以下步驟
1) 配制細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1校準(zhǔn)品；
2) 以細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體包被固相載體；
3) 用酶標(biāo)記細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體；
4) 分裝上述細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1校準(zhǔn)品、酶標(biāo)記的細(xì)胞角蛋 白19片段CYFRA21-1單克隆抗體和該酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物；以及
5) 組裝為成品。
根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選，所述包被固相載體的步驟2)包括以下步驟 I)包被
采用0.05M pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液或0.046M pH值為4.6的檸檬酸 緩沖液與適當(dāng)濃度的細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體混合制成包被 液，并將其負(fù)載于固相載體上；
II) 用生理鹽水洗滌上述固相載體；以及
III) 封閉
配制封閉液，基于lOOOmL所述封閉液包含0.2g NaH2P04'2H20、 2.9g NaH2P04'12H20、 10gBSA禾H lmL生物防腐劑，所述封閉液的pH值為7.0 7.6,然后將所得封閉液負(fù)載于上述洗滌后的固相載體上。
具體地，所述包被方法可以包括
I) 包被
采用1000mL的0.05MpH值為9.6的碳酸鹽緩沖液包含1.59g的無水碳 酸鈉和2.94g的碳酸氫鈉去離子水溶液，或lOOOmL的0.046MpH值為4.6的 檸檬酸緩沖液包含4.44g的檸檬酸和7.3g的檸檬酸三鈉去離子水溶液制成緩 沖液，與適當(dāng)濃度的細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體混合制成包被 液，并將其負(fù)載于固相載體上；
II) 用生理鹽水洗滌上述固相載體；以及
III) 封閉
配制封閉液，基于lOOOmL所述封閉液包含0.2g NaH2P(V2H20、 2.9g NaH2P04'12H20、 10gBSA和lmL生物防腐劑，所述封閉液的pH值為7.0 7.6，然后將所得封閉液負(fù)載于上述洗滌后的固相載體上。在上述方法中，優(yōu)選，所述固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性 顆粒。
在上述方法中，優(yōu)選，所述酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
在上述方法中，優(yōu)選，所述化學(xué)發(fā)光底物為1,2-二氧乙烷類衍生物、魯 米諾或異魯米諾。
在上述方法中，優(yōu)選，所述1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-1,2-二氧 乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙垸、CSPD 或CDP- Star。
具體的上述試劑盒可以包括細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1校準(zhǔn)品、包被有 細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體的微孔板、酶標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光底物 液、洗漆緩沖液等。其中，所述細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1校準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)級(jí)， 純度不低于90%,包被的微孔板為48或96孔的微孔板條，標(biāo)記抗體的酶為偶聯(lián) 辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(ALP)，化學(xué)發(fā)光底物液為魯米諾(Luminol) 或3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-l ， 2-二氧乙垸 (AMPPD)，洗滌緩沖液為Tris-HCl。
本發(fā)明"細(xì)胞角蛋白19片段化學(xué)發(fā)光免疫分析定量測(cè)定試劑盒"可以檢測(cè) 出非小細(xì)胞肺癌病人體內(nèi)的細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1含量，根據(jù)細(xì)胞角蛋 白19片段CYFRA21-1含量的多少判斷治療效果及其病情的變化。它具有簡(jiǎn)便、 快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。該細(xì)胞角蛋白19片段化學(xué)發(fā)光免疫分析定量測(cè)定試 劑盒的各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到同類進(jìn)口試劑盒的分析法水平。并且，根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè) 系統(tǒng)為開放式操作，簡(jiǎn)便快速，不需要昂貴的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x，特別適合 廣大的中小醫(yī)院推廣使用，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價(jià)值的檢測(cè)手 段。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，酶標(biāo)記的抗體與載體上包被的抗體和被測(cè)樣品的細(xì)胞 角蛋白19片段CYFRA21-1形成"包被抗體-抗原-抗體-酶"的夾心復(fù)合物結(jié)構(gòu)， 因此本發(fā)明采用的"雙抗體夾心一步法"反應(yīng)模式，既有效地利用了化學(xué)發(fā)光技 術(shù)原理，又應(yīng)用酶催化發(fā)光底物，通過檢測(cè)發(fā)光底物產(chǎn)生的光信號(hào)代替酶聯(lián)免疫 分析中的顯色底物，因而具有與酶聯(lián)免疫分析同等的特異性，而靈敏度大大提高， 比現(xiàn)今的酶聯(lián)免疫吸附分析靈敏度提高約10倍，可為臨床診斷提供更為特異、快 速、可靠的依據(jù)。


圖1為實(shí)施例1所制備的試劑盒中的校準(zhǔn)品線性圖
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l制備本發(fā)明的細(xì)胞角蛋白19片段化學(xué)發(fā)光免疫分析定量測(cè)定試劑
一、酶標(biāo)細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體的制備
(1) 辣根過氧化物酶標(biāo)記細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體的制
備
溶解4.4mg HRP于lmL蒸餾水中，加入0.4mL過碘酸鈉(5Ommol/L)室溫 攪拌20min，經(jīng)lmmol/L醋酸鈉緩沖液，pH4.4透析后加入8mg的細(xì)胞角蛋白19 片段CYFRA21-1單克隆抗體，攪拌2h，最后用200mmol/L的NaBH4進(jìn)行還原， 經(jīng)0.02MPBS緩沖液透析后，加等體積甘油，一20'C以下保存。
(2) 堿性磷酸酶標(biāo)記細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體的制備
細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單抗用戊二醛法與堿性磷酸酶偶聯(lián)，對(duì)PBS 充分透析，加等體積甘油，一20'C以下保存。
二、 酶標(biāo)抗體濃度選定
試驗(yàn)證明，采用方陣法選擇酶標(biāo)抗體的工作濃度范圍為1:500- 50000。
三、 細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1校準(zhǔn)品的制備
本發(fā)明試劑盒中，細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1系列校準(zhǔn)品，以小牛血清 為基質(zhì)，將細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1抗原純品，以國家標(biāo)準(zhǔn)品為準(zhǔn)系列稀 釋而成。分裝濃度范圍為0、 1、 3、 9、 27、 81ng/mL的校準(zhǔn)品共6瓶。
四、 以細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體包被固相微孔板 (1)包被
采用0.05M pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液或0.046M pH值為4.6的檸檬酸 緩沖液與適當(dāng)濃度的細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體混合制成包被 液，并將其負(fù)載于固相載體上；
具體地，所述包被方法可以包括 無水碳酸鈉 1.59g 碳酸氫鈉 2.94g 去離子水 lOOOmL
溶解混勻后，調(diào)整pH值至9.6，加入5.0mg細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1 單克隆抗體混勻，然后加入微孔板各孔中，每孔110^L， 4'C過夜。
或者，
檸檬酸 4.44g 檸檬酸三鈉 7.3g去離子水 lOOOmL
溶解混勻后，調(diào)整pH值至4.6，加入5.0mg細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1 單克隆抗體混勻，然后加入微孔板各孔中，每孔110pL， 4'C過夜。
(2) 洗滌用生理鹽水洗三次。
(3) 封閉
NaH2P04.2H20 0.2g Na2HP04.12H20 2.9g BSA 10g Proclin 300 lmL
雙蒸水 定容至lOOOmL
將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，加雙蒸水定容，溶解混勻，測(cè)定pH值為
7.0。
每孔分別加入封閉液300pL，室溫放置3小時(shí)。甩掉封閉液，在吸水紙上拍干。 室溫除濕干燥24小時(shí)。立即進(jìn)行真空封袋。封袋后放置15分鐘檢查無漏氣，如 果有漏氣需重新封袋。貼簽后置2 8'C保存。
五、 酶標(biāo)單抗稀釋液
Tris 12.120g BSA 5g Proclin lmL 雙蒸水 lOOOmL
六、 化學(xué)發(fā)光底物
本發(fā)明所使用的辣根過氧化物酶(HRP)的化學(xué)發(fā)光底物液的配制方法
A液在雙蒸水中加入Tris和濃HCl配成O.IM pH值為8.5的Tris-HCl緩沖 液。在此緩沖液中加入4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的對(duì)碘苯酚。
B液在雙蒸水中加入檸檬酸三鈉和檸檬酸，配制成O.IM pH值為4.6的檸檬
酸緩沖液，在此溶液中加入200mg/mL的過氧化氫溶液。
使用方法使用前將A液與B液按1:1比例混合后使用。 本發(fā)明所使用的堿性磷酸酶(ALP)的化學(xué)發(fā)光底物液的配制方法
Tris24g
NaCl160g
KC14g
HCl15mL
雙蒸水lOOOmL
Proclin 300lmL
AMPPD200mL
七、洗滌緩沖液
Tris24g
NaCl160g
KC14g
HCl15mL
去離子水lOOOmL
調(diào)整pH值至7.4。
八、半成品及成品組成
上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品。抽出三份經(jīng)過特異性、精密性、靈敏度 及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成本發(fā)明的定量測(cè)定試劑盒。組裝成試劑盒后還需抽 檢合格后才能出廠。
本發(fā)明試劑盒中的固相抗體為提前包被好的，不需要現(xiàn)場(chǎng)包被；校準(zhǔn)品為液 體；標(biāo)記抗體也是已經(jīng)稀釋到工作濃度的工作溶液，均可以直接使用。校準(zhǔn)品/待 測(cè)樣品、酶標(biāo)記抗體溶液以及發(fā)光底物加樣體積均為50pL，實(shí)驗(yàn)過程中，不需要 調(diào)節(jié)加樣體積，最大程度的方便使用。以本發(fā)明上述測(cè)試方法按上述程序進(jìn)行測(cè) 定，所用時(shí)間短，方便，快速。
利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)范圍寬，操作簡(jiǎn) 單，無放射性污染，試劑盒成本低，臨床適用性強(qiáng)，更適用于我國臨床檢測(cè)篩查。
實(shí)施例2 3制備本發(fā)明的細(xì)胞角蛋白19片段化學(xué)發(fā)光免疫分析定量測(cè)定試
劑盒
除分別以塑料珠、磁性顆粒作為載體外，其余均以與實(shí)施例1相同的方法 制備本發(fā)明的定量測(cè)定試劑盒。
實(shí)施例4本發(fā)明的試劑盒的使用方法
在利用實(shí)施例1的試劑盒實(shí)驗(yàn)前需首先取出固相抗體、校準(zhǔn)品/檢測(cè)樣品、標(biāo) 記抗體溶液室溫放置15 30分鐘，使平衡到室溫；然后將恒溫溫箱或者水浴鍋調(diào) 至37°C;再后準(zhǔn)備好合適的微量加樣器及對(duì)應(yīng)吸頭并且檢查化學(xué)發(fā)光儀以及輔助
儀器如洗板機(jī)等是否正常工作。
利用本試劑盒按照實(shí)施例1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的操作步驟如下
1) 將實(shí)驗(yàn)需要的板條(巳包被好抗體，96/48孔可拆為12/6*8*1 L)放置在 板架上；
2) 反應(yīng)孔中分別加待測(cè)樣品和各濃度校準(zhǔn)品，校準(zhǔn)品每孔加0、 1、 3、 9、 27、 81ng/mL各50pL，每次試驗(yàn)設(shè)空白1孔，然后除空白孔外各孔加酶標(biāo)記抗體溶液 50nL;
3) 微量振蕩器上振蕩30秒混勻；
4) 37'C恒溫溫育60分鐘；
5) 棄去孔中溶液，用Tris-HCl洗液，自動(dòng)洗板機(jī)或者手工洗板5次，在吸水 紙上拍干；
6) 每孔加發(fā)光底物液5(HiL，用微量震蕩器充分振蕩混合均勻，室溫(20 28'C) 反應(yīng)30 90分鐘；
7) 化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)相對(duì)發(fā)光值(RLU)，測(cè)量時(shí)間1秒/孔；
8) 分別對(duì)校準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)RLU取對(duì)數(shù)，在建立的雙對(duì)數(shù)曲線上建立標(biāo)準(zhǔn) 曲線，以各待測(cè)血清RLU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出該血清的細(xì)胞角蛋白19片段 CYFRA21-1的濃度，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果(見附圖l);
9) 打印檢測(cè)結(jié)果報(bào)告。
實(shí)施例5本發(fā)明的試劑盒的方法學(xué)鑒定
按照本領(lǐng)域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對(duì)實(shí)施例1中制備的試劑盒進(jìn)行鑒定， 經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的試劑盒在用于細(xì)胞角蛋白19片段(CYFRA21-1) 濃度水平測(cè)定時(shí)，該方法學(xué)指標(biāo)如下
檢測(cè)范圍0 81ng/mL;
靈敏度最小檢出限為0.10ng/mL;
精密度分析內(nèi)精密度(高、中、低三個(gè)質(zhì)量控制范圍)均小于7% (n=10)， 分析間精密度(高、中、低三個(gè)質(zhì)量控制范圍)均小于7% (n-10);
準(zhǔn)確性加標(biāo)回收率在90 110%之間；
特異性與CEA、 AFP、 CA199等CA系列常見腫瘤標(biāo)志物交叉反應(yīng)率不
高于0.5%; 、
穩(wěn)定性各試劑組分置37'C，考察6天后，各組分仍穩(wěn)定。
本發(fā)明的試劑盒所用樣品量少， 一次檢測(cè)只要5(^L，體外檢測(cè)對(duì)測(cè)試對(duì)象沒 有任何毒副作用。同時(shí)本發(fā)明采用的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法，不產(chǎn)生放射性污 染，各指標(biāo)也優(yōu)于目前廣泛應(yīng)用的酶聯(lián)免疫吸附分析方法(ELISA)。利用本發(fā)明 方法進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)范圍寬，操作簡(jiǎn)單，無放射性污染， 試劑盒成本低，臨床適用性強(qiáng)，更適用于我國臨床檢測(cè)篩査實(shí)驗(yàn)室。因此本發(fā)明 為臨床檢測(cè)細(xì)胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)，輔助診斷非小細(xì)胞肺癌以及手術(shù) 后觀察提供了一種更準(zhǔn)確，特異，方便，快捷的方法。
實(shí)施例6使用本發(fā)明的試劑盒與國外公司進(jìn)行臨床診斷的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的對(duì)照 本發(fā)明試劑和美國DRG公司ELISA系列檢測(cè)試劑盒細(xì)胞角蛋白19片段 (CYFRA21-1)試劑對(duì)1240份臨床血清樣品檢測(cè)結(jié)果總符合率達(dá)99.8%，數(shù)據(jù)如下
本發(fā)明試劑檢測(cè)結(jié)果
_=_+ 合計(jì)
DRG公司試劑檢測(cè)結(jié)果 一759 4 763
+ 3 454 457
合計(jì) 762 458 1240
從所列出兩種試劑檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)分析，本發(fā)明試劑檢測(cè)結(jié)果陰性中有3份陽 性，陽性結(jié)果中有4份陰性和DRG試劑檢測(cè)結(jié)果不符，這一差異可能由于試劑采 用的抗原/抗體材料不同，及抗原/抗體的結(jié)合位點(diǎn)不同而引起的，本發(fā)明試劑盒的
靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性與同類進(jìn)口試劑盒無明顯差異；便于推廣應(yīng)用，安全可
權(quán)利要求
1、一種細(xì)胞角蛋白19片段化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1校準(zhǔn)品；2)細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體包被的固相載體；3)酶標(biāo)記的細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體；以及4)上述酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物。
2、 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述細(xì)胞角蛋白19片段 CYFRA21-1單克隆抗體優(yōu)選為BM19.21和/或KS19.1。
3、 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述固相載體為微孔板、 塑料珠、塑料管或磁性顆粒。
4、 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述酶為堿性磷酸酶或 辣根過氧化物酶。
5、 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物為1,2-二氧乙垸類衍生物、魯米諾或異魯米諾。
6、 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述1,2-二氧乙烷類衍 生物為(金剛烷)-l，2-二氧乙垸、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基) 苯基-1， 2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。
7、 一種制備權(quán)利要求l所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟1) 配制細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1校準(zhǔn)品；2) 以細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體包被固相載體； 3) 用酶標(biāo)記細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體；4) 分裝上述細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1校準(zhǔn)品、酶標(biāo)記的細(xì)胞角蛋 白19片段CYFRA21-1單克隆抗體和該酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物；以及5) 組裝為成品。
8、 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞角蛋白19片段 CYFRA21-1單克隆抗體優(yōu)選為BM19.21禾口/或KS19.1。
9、 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述包被固相載體的步驟 2)包括以下步驟I) 包被采用0.05M pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液或0.046M pH值為4.6的檸檬酸 緩沖液與適當(dāng)濃度的細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體混合制成包被 液，并將其負(fù)載于固相載體上；II) 用生理鹽水洗滌上述固相載體；以及III) 封閉配制封閉液，基于1000mL所述封閉液包含0.2g NaH2P(V2H20、 2.9g NaH2P04'12H20、 10gBSA和lmL生物防腐劑，所述封閉液的pH值為7.0 7.6，然后將所得封閉液負(fù)載于上述洗漆后的固相載體上。
10、 如權(quán)利要求7或9所述的方法，其特征在于，所述固相載體為微孔 板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。
11、 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述酶為堿性磷酸酶或辣 根過氧化物酶。
12、 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物為1，2-二氧乙垸類衍生物、魯米諾或異魯米諾。
13、 如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述1,2-二氧乙烷類衍 生物為(金剛垸)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基) 苯基-1， 2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞角蛋白19片段化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒及其制備方法。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括1)細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1校準(zhǔn)品；2)細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體包被的固相載體；3)酶標(biāo)記的細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體；以及4)上述酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物。進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明制備上述試劑盒的方法包括以下步驟1)配制細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1校準(zhǔn)品；2)以細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體包被固相載體；3)用酶標(biāo)記細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1單克隆抗體；4)分裝上述校準(zhǔn)品、酶標(biāo)記物和化學(xué)發(fā)光底物；以及5)組裝為成品。本發(fā)明的試劑盒具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/76GK101377501SQ20071012116
公開日2009年3月4日 申請(qǐng)日期2007年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月31日
發(fā)明者應(yīng)希堂, 林金明, 栩 王, 根 石, 胡國茂 申請(qǐng)人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司