專利名稱：用于增強(qiáng)認(rèn)知能力的含有花生四烯酸或其與二十二碳六烯酸的組合的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了具有預(yù)防健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)降低或具有改善或增強(qiáng)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)的作用的食品和飲料以及其制備方法，所說(shuō)的食品和飲料包含作為活性成分的花生四烯酸和/或含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物。更具體地講，本發(fā)明提供了具有預(yù)防健康人的認(rèn)知能力、對(duì)選自聽(tīng)覺(jué)刺激、視覺(jué)刺激、味覺(jué)刺激、嗅覺(jué)刺激和軀體感覺(jué)刺激事件感知水平和/或辨別能力的正常響應(yīng)降低或具有改善或增強(qiáng)該正常響應(yīng)的作用的食品和飲料以及其制備方法，所說(shuō)的食品和飲料包含一種或多種選自花生四烯酸、花生四烯酸醇酯和包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的一部分或全部的甘油三酯、磷脂或糖脂的物質(zhì)作為活性成分。
背景技術(shù)：
認(rèn)知是對(duì)外部環(huán)境中的信息進(jìn)行選擇并對(duì)其進(jìn)行清楚確定的過(guò)程，更具體地講，是通過(guò)感覺(jué)器官將外部刺激如視覺(jué)、聽(tīng)覺(jué)、嗅覺(jué)、味覺(jué)和軀體感覺(jué)刺激傳遞到腦并且通過(guò)腦的多個(gè)區(qū)域的協(xié)同作用對(duì)其處理和精確確定的過(guò)程。認(rèn)知能力包括信息處理速度(轉(zhuǎn)化外部刺激的速度)和信息處理資源的數(shù)量(對(duì)于外部刺激進(jìn)行信息處理的資源分配水平)兩個(gè)因素，因此，本發(fā)明對(duì)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)降低的預(yù)防、對(duì)該響應(yīng)的改善或增強(qiáng)應(yīng)被理解為指的是預(yù)防諸如注意力、記憶力、知覺(jué)、語(yǔ)言、計(jì)算能力等等之類的正常功能降低、對(duì)其改善或增強(qiáng)，而與受損功能的改善不同。
在認(rèn)知功能受損方面已經(jīng)研究和開(kāi)發(fā)了許多治療劑。但是，不幸地是，還沒(méi)有找到可以有效預(yù)防健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)的降低、改善或增強(qiáng)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)的化合物。即，雖然測(cè)定認(rèn)知功能受損和對(duì)改善作用進(jìn)行評(píng)估的方法是已知的(見(jiàn)，例如，Nishimura，T.，Takeda，M.，“阿耳茨海默氏癡呆的診斷性影像學(xué)”，第27-36頁(yè)，Medical View Publications(2/10/2001))，但是該類方法并不能對(duì)正常響應(yīng)降低的預(yù)防、對(duì)該響應(yīng)的改善或增強(qiáng)進(jìn)行評(píng)估。因此，需要一種可以有效對(duì)健康入認(rèn)知能力的正常響應(yīng)客觀進(jìn)行評(píng)估的方法以對(duì)用于預(yù)防健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)降低、對(duì)其進(jìn)行改善或增強(qiáng)的藥物進(jìn)行客觀研制和開(kāi)發(fā)。
注意力最近集中在作為用于對(duì)認(rèn)知能力進(jìn)行客觀評(píng)估的生理指標(biāo)的事件相關(guān)腦電位。可以通過(guò)與人頭皮相連的電極記錄神經(jīng)元所表現(xiàn)出來(lái)的電活動(dòng)。背景腦波一般是連續(xù)的電活動(dòng)，其可以根據(jù)覺(jué)醒水平而變化。還存在一種短暫的微小的動(dòng)作電位，其可以根據(jù)給定的指明事件而變化。這種動(dòng)作電位目前被稱為“事件相關(guān)腦電位”，并且被解釋為由內(nèi)部或外部刺激所誘導(dǎo)的電位。事件相關(guān)腦電位——一種約0.1μV至幾十μV的微小電位變化由一系列正波和負(fù)波所組成。這一系列電位變化中出現(xiàn)在對(duì)刺激事件而言約300msec附近的正波與認(rèn)知功能有關(guān)并且被稱為P300。對(duì)于刺激事件而言出現(xiàn)P300所需的時(shí)間被稱為P300潛伏期并且表示了信息處理速度(轉(zhuǎn)化外部刺激的速度)，而從基線算起的峰高度被稱為P300振幅并表示了信息處理資源的數(shù)量(對(duì)外部刺激進(jìn)行信息處理的資源分配水平)(見(jiàn)，例如，Mitamura，S.，“現(xiàn)代療法”，第18卷，第4期，第618-621頁(yè)，LifeMedicom(2/10/2001))。因此，可以通過(guò)測(cè)量事件相關(guān)腦電位對(duì)人的認(rèn)知響應(yīng)進(jìn)行客觀測(cè)量。
外部刺激是通過(guò)感覺(jué)器官傳送到腦的，并且腦是脂肪質(zhì)樣組織，約1/3的白質(zhì)和1/4的灰質(zhì)由磷脂組成。因?yàn)榻M成腦細(xì)胞膜的磷脂的大多數(shù)多不飽和脂肪酸是花生四烯酸和二十二碳六烯酸，所以有人提出這些多不飽和脂肪酸可能在增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶能力以及預(yù)防或改善老年癡呆方面起著一定的作用?；ㄉ南┧岷投剂┧嵩趧?dòng)物中不能從頭合成，因此必需直接或間接(以花生四烯酸的亞油酸前體或二十二碳六烯酸的α-亞麻酸前體形式)從食物中攝取。因此，注意力集中于通過(guò)外部供給花生四烯酸和二十二碳六烯酸來(lái)增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶能力的作用和防止和改善老年癡呆的作用。在魚(yú)油中發(fā)現(xiàn)有大量二十二碳六烯酸，已經(jīng)進(jìn)行了許多研究來(lái)研究其對(duì)腦功能改善的作用，同時(shí)這些發(fā)明已經(jīng)公開(kāi)了其作為學(xué)習(xí)能力增強(qiáng)劑、記憶力增強(qiáng)劑、癡呆預(yù)防劑、癡呆治療劑、抗癡呆劑或具有改善腦功能作用的功能性食品的應(yīng)用(見(jiàn)，例如，未進(jìn)行審查的公開(kāi)號(hào)為7-82146的日本專利、未進(jìn)行審查的公開(kāi)號(hào)為5-117147的日本專利和未進(jìn)行審查的公開(kāi)號(hào)為2-49723的日本專利)。此外，如未進(jìn)行審查的公開(kāi)號(hào)為2003-48831的日本專利所述(其
公開(kāi)日為2003年2月21日，標(biāo)題為“具有預(yù)防或改善由腦機(jī)能減退所造成的情況或疾病作用的組合物”)，根據(jù)將花生四烯酸和/或包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物給藥于進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)的老年動(dòng)物所得到的結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人最近證實(shí)花生四烯酸和/或包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物可以改善與年齡有關(guān)的學(xué)習(xí)能力降低。但是，該特定的發(fā)明是針對(duì)腦功能降低的，并且沒(méi)有公開(kāi)對(duì)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)的作用。
已經(jīng)進(jìn)行了一些嘗試來(lái)根據(jù)事件相關(guān)腦電位來(lái)測(cè)定一些化合物對(duì)認(rèn)知響應(yīng)的改善作用。Miyanaga，K.驗(yàn)證了DHA對(duì)腦功能的藥理學(xué)作用，在給26名健康受試者口服使用包含2400mg DHA的膠囊前后測(cè)量了事件相關(guān)腦電位，發(fā)現(xiàn)P300潛伏期顯著縮短，P300振幅顯著增加(見(jiàn)Miyanaga，K.，″Shoku no Kagaku″[食品科學(xué)]第84-96頁(yè)，Korin Books(1999))。但是，由于缺乏與安慰劑樣品的比較結(jié)果，沒(méi)有確定血液DHA水平和P300結(jié)果之間的相關(guān)性。在每天將包含900mg DHA的膠囊給藥于97名健康的老年受試者給藥6個(gè)月的長(zhǎng)期給藥試驗(yàn)中，沒(méi)有觀察到P300發(fā)生變化，因此，使得DHA的功效并不確定。
因此，雖然認(rèn)為二十二碳六烯酸表現(xiàn)出改善學(xué)習(xí)能力的作用，但是在作為認(rèn)知能力的指標(biāo)的事件相關(guān)腦電位方面沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有效結(jié)果的事實(shí)意味著仍然不清楚花生四烯酸和/或含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物對(duì)于健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)的改善、增強(qiáng)或?qū)ζ浣档偷念A(yù)防是否有效。
本發(fā)明的公開(kāi)本發(fā)明要解決的問(wèn)題因此，一直迫切希望研制可以改善或增強(qiáng)作為認(rèn)知能力的兩個(gè)因素的信息處理速度(轉(zhuǎn)化外部刺激的速度)和信息處理資源數(shù)量(對(duì)外部刺激進(jìn)行信息處理的資源分配水平)的正常響應(yīng)或預(yù)防其降低的化合物，并且所說(shuō)的化合物十分適于作為具有極小副作用的藥物以及食品。
解決該問(wèn)題的方法因此，本發(fā)明提供了具有預(yù)防健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)降低或具有改善或增強(qiáng)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)的作用的食品和飲料以及其制備方法，所說(shuō)的食品和飲料包含作為活性成分的花生四烯酸和/或含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物。更具體地講，本發(fā)明提供了具有預(yù)防健康人的認(rèn)知能力、對(duì)事件(聽(tīng)覺(jué)刺激、視覺(jué)刺激、味覺(jué)刺激、嗅覺(jué)刺激、軀體感覺(jué)刺激)的感知水平和/或辨別能力的正常響應(yīng)降低或具有改善或增強(qiáng)該正常響應(yīng)的作用的食品和飲料以及其制備方法，所說(shuō)的食品和飲料包含一種或多種選自花生四烯酸、花生四烯酸醇酯和包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的一部分或全部的甘油三酯、磷脂或糖脂的物質(zhì)作為活性成分。
由于為了說(shuō)明花生四烯酸和/或包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物對(duì)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)的改善或增強(qiáng)或?qū)ζ浣档偷念A(yù)防作用而進(jìn)行的勤勉的研究，在用事件相關(guān)腦電位作為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的發(fā)明人令人吃驚地發(fā)現(xiàn)了花生四烯酸和/或包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物的一種作用。
本發(fā)明的發(fā)明人還成功實(shí)現(xiàn)了微生物工業(yè)生產(chǎn)包含至少10重量％花生四烯酸的甘油三酯，并且在本發(fā)明的作用試驗(yàn)中對(duì)這些甘油三酯的作用進(jìn)行了說(shuō)明。
本發(fā)明的發(fā)明人還成功實(shí)現(xiàn)了酶生產(chǎn)包含在1，3-位上結(jié)合有中鏈脂肪酸并且在2-位上結(jié)合有花生四烯酸的甘油三酯的油脂，并在本發(fā)明的作用試驗(yàn)中對(duì)這些甘油三酯的作用進(jìn)行了說(shuō)明。
因此，本發(fā)明提供了具有預(yù)防健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)降低或具有改善或增強(qiáng)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)的作用的食品和飲料以及其制備方法，所說(shuō)的食品和飲料包含作為活性成分的花生四烯酸和/或含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物。更具體地，本發(fā)明提供了具有預(yù)防健康人的認(rèn)知能力、對(duì)事件(聽(tīng)覺(jué)刺激、視覺(jué)刺激、味覺(jué)刺激、嗅覺(jué)刺激、軀體感覺(jué)刺激)的感知水平和/或辨別能力的正常響應(yīng)降低或具有改善或增強(qiáng)該正常響應(yīng)的作用的食品和飲料以及其制備方法，所說(shuō)的食品和飲料包含一種或多種選自花生四烯酸、花生四烯酸醇酯和包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的一部分或全部的甘油三酯、磷脂或糖脂的物質(zhì)作為活性成分。
根據(jù)本發(fā)明，可能提供具有改善或增強(qiáng)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)或預(yù)防其降低的作用的食品和飲料以及其制備方法，所說(shuō)的食品和飲料包含作為活性成分的花生四烯酸和/或含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物，因此本發(fā)明在現(xiàn)代社會(huì)中特別有用。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是表示攝食包含花生四烯酸的食用油膠囊和包含橄欖油的膠囊(安慰劑膠囊)之前和之后血清磷脂中花生四烯酸水平變化的柱狀圖。
圖2是表示攝食包含花生四烯酸的食用油膠囊和包含橄欖油的膠囊(安慰劑膠囊)之前和之后P300潛伏期變化的線狀圖。
圖3是表示攝食包含花生四烯酸的食用油膠囊和包含橄欖油的膠囊(安慰劑膠囊)之前和之后P300振幅變化的線狀圖。
圖4是兩副表示P300(P300潛伏期和振幅)和血清磷脂中花生四烯酸水平之間相關(guān)性的點(diǎn)狀圖。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及具有預(yù)防健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)降低或具有改善或增強(qiáng)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)的作用的食品和飲料以及其制備方法，所說(shuō)的食品和飲料包含作為活性成分的花生四烯酸和/或含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物。
本發(fā)明的組合物具有改善或增強(qiáng)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)或預(yù)防其降低的作用，或者說(shuō)，其具有預(yù)防健康人對(duì)事件(聽(tīng)覺(jué)刺激、視覺(jué)刺激、味覺(jué)刺激、嗅覺(jué)刺激、軀體感覺(jué)刺激)的感知水平的正常響應(yīng)降低或改善或增強(qiáng)該正常響應(yīng)的作用并且具有預(yù)防健康人對(duì)事件(聽(tīng)覺(jué)刺激、視覺(jué)刺激、味覺(jué)刺激、嗅覺(jué)刺激、軀體感覺(jué)刺激)的辨別能力的正常響應(yīng)降低或改善或增強(qiáng)該響應(yīng)的作用，并且能在食品或飲料、藥物、準(zhǔn)藥物等等中表現(xiàn)出其作用。改善或增強(qiáng)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)或預(yù)防其降低的作用對(duì)于作為指定用于防止正常功能如注意力、記憶力、知覺(jué)、語(yǔ)言、計(jì)算等等的降低或改善或增強(qiáng)這些正常功能的食品或飲料、藥物和準(zhǔn)藥物而言也是有效的，并且對(duì)于作為指定用于維持或增強(qiáng)專心、維持注意力、使頭腦清醒或激發(fā)記憶、返老還童等等的食品或飲料、健康食品、功能性食品、特殊的健康護(hù)理食品、嬰兒食品、老年食品等等也是有效的。
除了游離花生四烯酸外，本發(fā)明的活性成分還可以是任何含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物。含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物包括花生四烯酸鹽如鈣和鈉鹽，或花生四烯酸醇酯如花生四烯酸甲酯、花生四烯酸乙酯等等。還可以使用包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的一部分或全部的甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯、磷脂或糖脂。
對(duì)于用于食品而言，花生四烯酸優(yōu)選地為甘油三酯或磷脂的形式，并且尤其是甘油三酯。雖然已知實(shí)際上不存在天然來(lái)源的包含花生四烯酸的甘油三酯(或包含含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的一部分或全部的甘油三酯的甘油三酯)，但本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)成功使得可以在工業(yè)上使用包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的甘油三酯，并且通過(guò)長(zhǎng)期給人使用和對(duì)事件相關(guān)腦電位(其使得對(duì)認(rèn)知能力可以進(jìn)行客觀評(píng)估)進(jìn)行分析第一次闡明了本發(fā)明的活性成分對(duì)人的作用，并證明了其具有改善或增強(qiáng)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)或預(yù)防其降低的作用。
因此，根據(jù)本發(fā)明，可以使用包括其一部分或所有組成脂肪酸是花生四烯酸的甘油三酯的甘油三酯作為本發(fā)明的活性成分(包含花生四烯酸的甘油三酯)。對(duì)于用于食品的應(yīng)用而言，該包含花生四烯酸的甘油三酯優(yōu)選地是其中花生四烯酸的比例為該甘油三酯總脂肪酸的至少20重量％(W/W)，優(yōu)選至少30重量％并且更優(yōu)選至少40重量％的油脂(甘油三酯)。因此，根據(jù)本發(fā)明，可以使用通過(guò)對(duì)能產(chǎn)生所說(shuō)物質(zhì)的微生物進(jìn)行培養(yǎng)而獲得的包含花生四烯酸的油脂(甘油三酯)。
作為能產(chǎn)生包含花生四烯酸的油脂(甘油三酯)的微生物的實(shí)例，可提及的微生物有屬于被孢霉屬、耳霉屬、腐霉屬、疫腐霉、青霉菌屬、分支孢子菌屬、白霉屬、鐮孢菌屬、曲霉屬、紅酵母屬、蟲(chóng)霉屬、Echinosporangium或水霉屬的微生物。就屬于被孢霉屬亞屬的微生物而言，可提及的有Mortierella elongata、Mortierella exigua、Mortierellahygrophila、Mortierella alpina等等。可提及的菌株尤其是如Mortierellaelongata IFO8570、Mortierella exigua IFO8571、Mortierella hygrophilaIFO5941、Mortierella alpina IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等等。
這些菌株都可以不受限制地得自發(fā)酵研究所，大阪(IFO)、美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)和真菌菌種保藏中心(CBS)。此外，還可以使用由本發(fā)明人的研究小組從土壤中分離出來(lái)的菌株Mortierella elongataSAM0219(FERM P-8703)(FERM BP-1239)。
對(duì)于本發(fā)明所用菌株的培養(yǎng)而言，將通過(guò)預(yù)培養(yǎng)獲得的種子培養(yǎng)溶液的孢子、菌絲或細(xì)胞在用于進(jìn)行主培養(yǎng)的液體或固體培養(yǎng)基中接種。在液體培養(yǎng)基的情況中，所用的碳源可以是任何常用的物質(zhì)如葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、甘油或甘露醇，但是并不僅限于這些物質(zhì)。就氮源而言，可以使用有機(jī)氮源，包括天然氮源如蛋白胨、酵母提取物、麥芽提取物、肉類提取物、酪蛋白氨基酸、玉米漿、大豆蛋白、脫脂大豆、棉子粉等等，以及脲和無(wú)機(jī)氮源如硝酸鈉、硝酸銨和硫酸銨。如果必需的話，還可以使用痕量的營(yíng)養(yǎng)源，包括無(wú)機(jī)鹽如磷酸鹽、硫酸鎂、硫酸鐵和硫酸銅或維生素。只要其濃度不會(huì)抑制微生物生長(zhǎng)，對(duì)這些培養(yǎng)基組分就沒(méi)有特別的限制。實(shí)際上，所加入碳源的量一般為總量的0.1-40重量％(W/V)并且優(yōu)選地為1-25重量％(W/V)。最初加入的氮源可以為0.1-10重量％(W/V)并且優(yōu)選地為0.1-6重量％(W/V)，如果需要的話，在培養(yǎng)期間可以再加入氮源。
可以通過(guò)控制培養(yǎng)基中碳源的濃度來(lái)制備用作本發(fā)明活性成分的包含至少45重量％(W/W)花生四烯酸的油脂(甘油三酯)。在培養(yǎng)最多2-4天時(shí)，該培養(yǎng)產(chǎn)生處于生長(zhǎng)期的細(xì)胞，并且在培養(yǎng)2-4天后產(chǎn)生油/脂肪累積期的細(xì)胞。最初的碳源濃度為1-8重量％，并且優(yōu)選地為1-4重量％，并且僅在細(xì)胞生長(zhǎng)期和油/脂肪累積期的最初時(shí)期連續(xù)加入碳源，高至2-20重量％，優(yōu)選5-15重量％總的連續(xù)碳源加入量。在細(xì)胞生長(zhǎng)期和油/脂肪累積期的初期連續(xù)加入碳源是以最初的氮源濃度為基礎(chǔ)的，從培養(yǎng)第7天起，優(yōu)選從培養(yǎng)第6天起，并且更優(yōu)選從培養(yǎng)第4天起培養(yǎng)基中碳源濃度為0，從而獲得作為本發(fā)明活性成分的包含至少45重量％花生四烯酸的油脂(甘油三酯)。
產(chǎn)生花生四烯酸的微生物的培養(yǎng)溫度將隨著微生物的不同而不同，但是可以為5-40℃，并且優(yōu)選地為20-30℃，或者對(duì)于生長(zhǎng)而言可以將細(xì)胞在20-30℃下進(jìn)行培養(yǎng)并在5-20℃下繼續(xù)培養(yǎng)以產(chǎn)生不飽和脂肪酸。還可以用該類溫度控制來(lái)增加所產(chǎn)生的脂肪酸中多不飽和脂肪酸的比例。培養(yǎng)基的pH可以為4-10并且優(yōu)選地為5-9，并且所說(shuō)的培養(yǎng)方法可以是浸沒(méi)培養(yǎng)、震蕩培養(yǎng)或靜態(tài)培養(yǎng)。該培養(yǎng)通常進(jìn)行2-30天，優(yōu)選5-20天并且更優(yōu)選5-15天。
作為增加包含花生四烯酸的油脂(甘油三酯)中花生四烯酸的比例的方法，除控制培養(yǎng)基中的碳源濃度外，還可以對(duì)包含花生四烯酸的油脂進(jìn)行選擇性水解，從而得到富含花生四烯酸的油脂。選擇性水解所用的脂肪酶對(duì)于甘油三酯部位是非特異性的，并且，因?yàn)樗饣钚耘c雙鍵的數(shù)目成比例地降低，所以除多不飽和脂肪酸的脂肪酸酯鍵之外的脂肪酸酯鍵被水解。此外，在所產(chǎn)生的PUFA甘油三酯之間還會(huì)發(fā)生酯交換，從而產(chǎn)生了具有增加的多不飽和脂肪酸的甘油三酯(見(jiàn)，例如，“花生四烯酸的增加用Candida cylindracea脂肪酶對(duì)得自被孢霉屬的單細(xì)胞油的選擇性水解”，J.Am.Oil Chem.Soc.，72，第1323-1327頁(yè)，AOCS Press(1998))。因此，通過(guò)對(duì)包含花生四烯酸的油脂選擇性水解而獲得的富含花生四烯酸的油脂(甘油三酯)可以用作本發(fā)明的活性成分。對(duì)于本發(fā)明包含花生四烯酸的油脂(甘油三酯)中的總脂肪酸而言優(yōu)選更高比例的花生四烯酸以將其它脂肪酸的作用最小化，但是對(duì)于高比例并沒(méi)有限定，并且實(shí)際上，對(duì)于用于食品的應(yīng)用而言，花生四烯酸的絕對(duì)量可能會(huì)造成一定的問(wèn)題，但是實(shí)際上可以使用包含10重量％或更高含量花生四烯酸的油脂(甘油三酯)。
因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明，甘油三酯可包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的一部分或全部，所以可以使用在1，3-位上結(jié)合有中鏈脂肪酸并且在2-位上結(jié)合有花生四烯酸的甘油三酯。還可以使用包含至少5摩爾百分比、優(yōu)選至少10摩爾百分比、更優(yōu)選至少20摩爾百分比并且最優(yōu)選至少30摩爾百分比的在1，3-位上結(jié)合有中鏈脂肪酸并且在2-位上結(jié)合有花生四烯酸的甘油三酯的油脂(甘油三酯)。在該甘油三酯的1，3-位上結(jié)合的中鏈脂肪酸可以選自6至12個(gè)碳的脂肪酸。作為6至12個(gè)碳的脂肪酸的實(shí)例，可提及的有辛酸和癸酸，優(yōu)選1，3-辛?；?2-花生四烯?；?甘油(在下文被稱為“8A8”)。
在1，3-位上結(jié)合有中鏈脂肪酸和在2-上結(jié)合有花生四烯酸的甘油三酯最適宜作為用于嬰兒或老人的油脂(甘油三酯)。在進(jìn)入小腸時(shí)，所攝食的油脂(甘油三酯)通?？梢员灰戎久杆?，并且因?yàn)橐戎久甘?，3-位特異型的，所以對(duì)甘油三酯的1，3-位裂解從而產(chǎn)生兩個(gè)游離脂肪酸分子，同時(shí)產(chǎn)生一個(gè)2-單?；视王?MG)分子。因?yàn)?-MG具有十分高的膽汁酸溶解度并且吸收性很高，所以通常認(rèn)為2-位脂肪酸可以被更好的吸收。當(dāng)溶解于膽汁酸中時(shí)，2-MG也表現(xiàn)出表面活性劑的作用，因此，可以起到增加游離脂肪酸吸收的作用。游離脂肪酸和2-MG然后與膽固醇或磷脂形成膽汁酸復(fù)合體膠團(tuán)并且被小腸上皮細(xì)胞吸收，導(dǎo)致三酰甘油的再合成并且最后以乳糜微粒的形式被釋放到淋巴中。但是，胰脂肪酶的脂肪酸特性對(duì)飽和脂肪酸最高，而對(duì)花生四烯酸的裂解效率較低。另一個(gè)問(wèn)題是嬰兒和老人的胰脂肪酶活性較低，從而使得理想的油脂(甘油三酯)是在1，3-位上結(jié)合有中鏈脂肪酸并且在2-位上結(jié)合有花生四烯酸的甘油三酯。
在1，3-位上結(jié)合有中鏈脂肪酸并且在2-位上結(jié)合有花生四烯酸的甘油三酯的一種特定制備方法是一種在存在包含花生四烯酸的油脂(甘油三酯)和中鏈脂肪酸的情況下使脂肪酶僅作用于甘油三酯的1，3-酯鍵上的制備方法。
用作起始材料的油或脂肪(甘油三酯)包括含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的甘油三酯，并且當(dāng)對(duì)于甘油三酯的總脂肪酸而言花生四烯酸的比例高時(shí)，使用30-50℃并且優(yōu)選40-50℃的溫度(其高于20-30℃的普通酶反應(yīng)溫度)，以防止由于未反應(yīng)的油或脂肪(甘油三酯起始材料和其中僅1，3-位脂肪酸中的一種是中鏈脂肪酸的甘油三酯)增加而使得反應(yīng)收率降低。
就特定作用于甘油三酯的1，3-位酯鍵上的脂肪酶而言，可提及的是由屬于下面種屬的微生物所產(chǎn)生的脂肪酶根霉菌屬、根毛霉屬、曲霉屬等等以及豬胰脂肪酶。該類脂肪酶可以是可通過(guò)商業(yè)途徑獲得的酶。其實(shí)例包括Rhizopus delemar脂肪酶(Talipase，Tanabe Seiyaku的產(chǎn)品)、Rhizomucor miehei脂肪酶(Ribozyme IM，Novo Nordisk Co.，Ltd.)和黑曲霉素脂肪酶(脂肪酶A，Amano Enzyme Co.，Ltd.的產(chǎn)品)，對(duì)于這些酶沒(méi)有特定限制，可以使用任何1，3-位特異型脂肪酶。
所用脂肪酶的形式優(yōu)選地是被固定在固定支撐物上的脂肪酶，以使得該酶在反應(yīng)溫度為30℃或更高，優(yōu)選40℃或更高時(shí)具有熱穩(wěn)定性從而增加反應(yīng)效率。用多孔樹(shù)脂作為固定支撐物，可提及的有具有至少約100埃的小孔的離子交換樹(shù)脂支撐物，如Dowex MARATHON WBA(DowChemical的商標(biāo))。
將所說(shuō)的固定支撐物混懸于重量為其0.5至20倍的1，3-位特異型脂肪酶的水溶液中，并在攪拌的情況下向該混懸液中緩慢加入該混懸液2至5倍量的冷丙酮(例如，-80℃)從而形成沉淀。將該沉淀減壓干燥，制得被固定的酶。作為一種更簡(jiǎn)單的方法，將該固定支撐物0.05至0.4倍量的1，3-位特異型脂肪酶溶解于最少量的水中，然后在攪拌的情況下將該溶液與固定支撐物混合，將該混合物減壓干燥，制得被固定的酶。這種方法使得約90％的脂肪酶在絕對(duì)不表現(xiàn)出酯交換活性的情況下被固定在該支撐物上，因此，通過(guò)在包含1至10重量％(W/V)水的底物(原料油或脂肪和中鏈脂肪酸)，并且優(yōu)選在包含1至3重量％水的底物中進(jìn)行預(yù)處理可以將被固定的酶活化并用于最有效的生產(chǎn)。
向該反應(yīng)系統(tǒng)中加入的水的量十分重要，其取決于酶的類型，這是因?yàn)樵诓淮嬖谒那闆r下不會(huì)進(jìn)行酯交換，而過(guò)量的水會(huì)造成水解并且使得甘油酯收率降低(因?yàn)樵谒鈺r(shí)產(chǎn)生甘油二酯和甘油單酯)。但是，在該類情況中，可以用通過(guò)預(yù)處理活化的被固定酶來(lái)降低向該反應(yīng)系統(tǒng)中加入水的數(shù)量的重要性，使得既使在不包含水的系統(tǒng)中也可以有效發(fā)生酯交換反應(yīng)。此外，還可以選擇酶試劑的類型以使得可以省略預(yù)處理。
因此，通過(guò)使用耐熱的被固定的酶和增加酶反應(yīng)溫度，可以在不降低反應(yīng)功效的情況下(既使在1，3-位特異型脂肪酶的反應(yīng)活性低的包含花生四烯酸的油脂(甘油三酯)的情況中也可以)有效制備在1，3-位上結(jié)合有中鏈脂肪酸并且在2-位上結(jié)合有花生四烯酸的甘油三酯。
制備具有預(yù)防健康人認(rèn)知能力的正常響應(yīng)降低或增強(qiáng)或改善該正常響應(yīng)的作用的食品和飲料的方法包括單獨(dú)使用花生四烯酸和/或含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物或其與基本不包含或僅包含痕量花生四烯酸的食品或飲料的混合物。在這里，“痕量”指的是在食品或飲料中存在花生四烯酸，但是如果該食品組合物被個(gè)體攝食時(shí)，該花生四烯酸的量不會(huì)達(dá)到本發(fā)明下文所述的花生四烯酸的每日攝取量。
對(duì)作為食品、飲料、藥物和準(zhǔn)藥物中的原料和添加劑的應(yīng)用而言，包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的一部分或全部的油脂(甘油三酯)具有無(wú)限的可能性。此外，在其應(yīng)用目的或數(shù)量方面沒(méi)有限制。
作為食品組合物的實(shí)例，可提及的有普通食品以及功能性食品、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑、用于早產(chǎn)兒的加工乳、用于嬰兒的加工乳、嬰兒食品、母親產(chǎn)品或老年食品。作為包含油脂的食品的實(shí)例，可提及的有最初就包含油脂的天然食品，如肉、魚(yú)和堅(jiān)果；在制備過(guò)程中添加油脂的食品，如湯；用油脂作為加熱介質(zhì)的食品，如油炸圈餅；油或脂肪類食品如黃油；在加工過(guò)程中加入油脂進(jìn)行處理的食品，如餅干；或在最后的加工過(guò)程中用油脂噴涂或涂布的食品，如硬烤餅干(hard biscuits)。其還可以加入到不含油脂的農(nóng)業(yè)食品、發(fā)酵食品、家畜飼料、海產(chǎn)品或飲料中。其還可以是功能性食品、藥物或準(zhǔn)藥物的形式，并且例如可以是腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物、粉劑、顆粒、錠劑、口服溶液、混懸液、乳劑、糖漿等形式。
除本發(fā)明的活性成分外，本發(fā)明的組合物還可以包含食品和飲料、藥物或準(zhǔn)藥物領(lǐng)域常用的各種載體和添加劑。其特別優(yōu)選包含抗氧化劑以防止本發(fā)明活性成分的氧化。就抗氧化劑而言，可提及的有天然抗氧化劑如生育酚、黃酮衍生物、葉甜素、曲酸、沒(méi)食子酸衍生物、兒茶酚、峰斗素(fukiic acid)、棉酚、吡嗪衍生物、芝麻酚、愈創(chuàng)醇(guaiaol)、愈創(chuàng)木酸、對(duì)-香豆酸、去甲二氫愈創(chuàng)木酸、甾醇、萜類、核酸堿、類胡蘿卜素、木酚素等等，以及合成抗氧化劑如抗壞血酸棕櫚酸酯、抗壞血酸硬脂酸酯、丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)、單-叔-丁基氫醌(TBHQ)和4-羥基甲基-2，6-二-叔-丁基苯酚(HMBP)。就生育酚而言，可提及的有α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、ε-生育酚、ξ-生育酚、η-生育酚和生育酚酯(醋酸生育酚等等)。作為類胡蘿卜素的實(shí)例，可提及的有β-胡蘿卜素、斑蝥黃(cantaxanthin)、蝦青素等等。
除本發(fā)明的活性成分外，作為本發(fā)明組合物中所用的支撐物，可提及的有各種類型的載體支撐物、增量劑、稀釋劑、填充劑、分散劑、賦形劑、粘合劑溶劑(例如，水、乙醇或植物油)、增助劑、緩沖劑、促溶出劑、膠凝劑、助懸劑、小麥面粉、米粉、淀粉、玉米淀粉、多糖、乳蛋白、膠原、米糠油、卵磷脂等等。作為添加劑的實(shí)例，可提及的有維生素、甜味劑、有機(jī)酸、著色劑、矯味劑、減濕劑、纖維、電解質(zhì)、礦物、營(yíng)養(yǎng)物、抗氧化劑、防腐劑、芳香劑、增濕劑、可食用的天然提取物、植物提取物等等，但是并不限于這些物質(zhì)。
該花生四烯酸或含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物的主要藥物組分是花生四烯酸。據(jù)報(bào)道，花生四烯酸從食物中的日攝取量在日本Kanto區(qū)為0.14g，在日本Kansai區(qū)為0.19-0.20g(見(jiàn)“Shishitsu Eiyogaku”[脂類營(yíng)養(yǎng)]4，日本脂類營(yíng)養(yǎng)協(xié)會(huì)編輯委員會(huì)主編，第73-82頁(yè)(1995)ISN1343-4594 CODENSHEIFG)，因此，必需以相應(yīng)的數(shù)量或更高的數(shù)量攝取花生四烯酸。因此，對(duì)于成人(例如60kg體重)，就花生四烯酸而言，本發(fā)明的花生四烯酸或含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物的日攝取量為0.001-20g，優(yōu)選0.01-10g，更優(yōu)選0.05-5g并且最優(yōu)選0.1-2g。
當(dāng)本發(fā)明的活性成分以食品或飲料產(chǎn)品的形式使用時(shí)，食品中花生四烯酸的絕對(duì)量也很重要。但是，因?yàn)槭称坊蝻嬃现械慕^對(duì)數(shù)量還會(huì)根據(jù)所攝食的食品或飲料的數(shù)量而變化，所以以花生四烯酸計(jì)，所說(shuō)的產(chǎn)品優(yōu)選地以至少0.0003重量％，優(yōu)選至少0.003重量％且更優(yōu)選至少0.03重量％的量包含含有包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的一部分或全部的甘油三酯的甘油三酯。當(dāng)向食品或飲料中加入在1，3-位上結(jié)合有中鏈脂肪酸并且在2-位上結(jié)合有花生四烯酸的甘油三酯時(shí)，該在1，3-位上結(jié)合有中鏈脂肪酸并且在2-位上結(jié)合有花生四烯酸的甘油三酯的數(shù)量為至少0.001重量％，優(yōu)選至少0.01重量％并且更優(yōu)選至少0.1重量％。
當(dāng)本發(fā)明的組合物被用作藥品時(shí)，其可以用常用的藥物制造方法例如日本藥典中所描述的方法或以其為基礎(chǔ)的方法來(lái)進(jìn)行制備。
當(dāng)本發(fā)明的組合物被用作藥品時(shí)，對(duì)該組合物中活性成分的含量沒(méi)有特定限制，只要其能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的即可，并且混合比例可以是被認(rèn)為適宜的比例。
當(dāng)本發(fā)明的組合物用作藥品時(shí)，其優(yōu)選地以單位劑量進(jìn)行給藥，特別優(yōu)選口服給藥。本發(fā)明組合物的劑量將根據(jù)患者的年齡、體重和癥狀以及給藥次數(shù)的不同而不同，例如，本發(fā)明的花生四烯酸和/或含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物通常每天以約0.001-20g，優(yōu)選約0.01-10g，更優(yōu)選約0.05-5g并且最優(yōu)選約0.1-2g的量(以花生四烯酸計(jì))給藥于成人(約60kg)，其可以以每天給藥1至3次的分割劑量形式進(jìn)行給藥。
腦磷脂膜的主要脂肪酸是花生四烯酸和二十二碳六烯酸，因此，考慮到維持平衡，本發(fā)明的組合物優(yōu)選地是花生四烯酸和二十二碳六烯酸的組合。一般來(lái)講，花生四烯酸(n-6不飽和脂肪酸)和二十二碳六烯酸(n-3不飽和脂肪酸)是由相同的酶分別由亞油酸和α-亞麻酸生物合成的。因此，當(dāng)花生四烯酸被單獨(dú)給藥時(shí)，二十二碳六烯酸的生物合成被抑制。相反，當(dāng)二十二碳六烯酸被單獨(dú)給藥時(shí)，花生四烯酸的生物合成被抑制。為了避免該類失衡，優(yōu)選地聯(lián)合使用花生四烯酸和二十二碳六烯酸。此外，因?yàn)槟X磷脂膜中二十碳五烯酸的比例很低，所以該組合優(yōu)選實(shí)際上不含二十碳五烯酸。因此，其優(yōu)選不包含二十碳五烯酸，或僅包含最多1％的二十碳五烯酸。該組合物更優(yōu)選實(shí)際上不與花生四烯酸和二十二碳六烯酸一起包含二十碳五烯酸。該花生四烯酸和二十二碳六烯酸的組合還優(yōu)選具有0.1-15并且優(yōu)選0.25-10的花生四烯酸/二十二碳六烯酸比例(重量比)。更優(yōu)選包含不高于花生四烯酸的1/5(重量比)的二十碳五烯酸的食品和飲料。
用于食品或飲料、健康食品、功能性食品、特殊的健康護(hù)理食品、嬰兒食品、老年食品等等的本發(fā)明的食品組合物包括使用用于說(shuō)明或表明該組合物的組成和/或組分具有改善或增強(qiáng)認(rèn)知能力或預(yù)防其降低的作用，或者換句話說(shuō)，說(shuō)明其具有改善或增強(qiáng)健康人感知水平的正常響應(yīng)或預(yù)防其降低的作用、預(yù)防健康人對(duì)事件(聽(tīng)覺(jué)刺激、視覺(jué)刺激、味覺(jué)刺激、嗅覺(jué)刺激、軀體感覺(jué)刺激)的辨別能力的正常響應(yīng)降低或改善或增強(qiáng)該響應(yīng)的作用和改善或增強(qiáng)正常功能如注意力、記憶力、知覺(jué)、語(yǔ)言、計(jì)算等等或預(yù)防其降低的作用、以及具有維持或增強(qiáng)專心、維持注意力、使頭腦清醒或激發(fā)記憶、返老還童等等作用的包裝容器和/或食品組合物銷售工具(例如，小冊(cè)子等等)進(jìn)行銷售的這些產(chǎn)品。
實(shí)施例現(xiàn)在將用下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的解釋，但是應(yīng)當(dāng)清楚的是，并不是要用這些實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
實(shí)施例1含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的甘油三酯的制備方法用Mortierella alpina作為制備花生四烯酸的菌株。在一個(gè)10kL的培養(yǎng)容器中制備6kL的包含1.8％葡萄糖、3.1％脫脂豆粉、0.1％豆油、0.3％KH2PO4、0.1％Na2SO4、0.05％CaCl2·2H2O和0.05％MgCl2·6H2O的培養(yǎng)基，將其最初的pH調(diào)至6.0。在接種30L培養(yǎng)溶液后，將其在26℃的溫度、360m3/h通風(fēng)速度和200kPa內(nèi)部壓力的條件下浸沒(méi)培養(yǎng)8天。調(diào)整轉(zhuǎn)速以將溶解的氧濃度維持在10-15ppm。在最多第4天時(shí)，還可以通過(guò)加料將該培養(yǎng)基的葡萄糖濃度調(diào)節(jié)至1-2.5％的范圍內(nèi)，并且其后將其調(diào)至0.5-1％(其中的百分比是以重量為基礎(chǔ)的(W/V))。在該培養(yǎng)結(jié)束后，過(guò)濾，干燥，收集包含含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的甘油三酯的細(xì)胞，通過(guò)己烷萃取由所獲得的細(xì)胞得到該油/脂肪，然后將該食用油/脂肪純化(脫膠、脫酸、蒸汽蒸餾、脫色)，得到150kg包含花生四烯酸的甘油三酯(花生四烯酸結(jié)合在該甘油三酯的任何位置上)。將所得的油/脂肪(甘油三酯)甲酯化并用氣相色譜對(duì)所得的脂肪酸甲酯進(jìn)行分析，表明花生四烯酸的比例為總脂肪酸的40.84％。棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、γ-亞麻酸和雙高-γ-亞麻酸的含量分別為11.63％、7.45％、7.73％、9.14％、2.23％和3.27％。將該包含花生四烯酸的油/脂肪(甘油三酯)乙酯化，用普通的高效液相色譜法將99％的花生四烯酸乙酯從該包含40％花生四烯酸乙酯的脂肪酸乙酯混合物中分離出來(lái)并對(duì)其進(jìn)行純化。
實(shí)施例2包含至少5％在1，3-位上結(jié)合有中鏈脂肪酸并且在2-位上結(jié)合有花生四烯酸的甘油三酯(8A8)的甘油三酯的制備在將100g離子交換樹(shù)脂支撐物(Dowex MARATHON WBATM.DowChemical)混懸于80ml 12.5％Rhizopus delemar脂肪酶水溶液(Talipase粉末，Tanabe Seiyaku的產(chǎn)品)中后，將該混懸液減壓干燥，得到被固定的脂肪酶。
接下來(lái)，在攪拌(130rpm)的情況下，將80g得自實(shí)施例1的包含40重量％花生四烯酸的甘油三酯(TGA40S)、160g辛酸、12g上述被固定的脂肪酶和4.8ml水在30℃下反應(yīng)48小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，將該反應(yīng)混合物取出，得到被活化的被固定的脂肪酶。
將10g被固定的酶(Rhizopus delemar脂肪酶，支撐物DowexMARATHON WBATM)裝配到一根有夾套的玻璃柱(1.8×12.5cm，體積為31.8ml)中，使包含得自實(shí)施例1的TGA40S和辛酸(比例為1∶2)的混合油以固定的流速(4ml/h)通過(guò)該柱以進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)，得到400g發(fā)生發(fā)應(yīng)的油/脂肪。柱溫為40-41℃。用分子蒸餾從該進(jìn)行了反應(yīng)的油/脂肪中除去未反應(yīng)的辛酸和游離脂肪酸，并對(duì)該食用油/脂肪進(jìn)行純化(脫膠、脫酸、蒸汽蒸餾、脫色)，得到包含8A8的油/脂肪(甘油三酯)。用氣相色譜和高效液相色譜測(cè)得所得的包含8A8的油/脂肪(甘油三酯)的8A8含量為31.6％。(8P8、8O8、8L8、8G8和8D8的比例分別為0.6、7.9、15.1、5.2和4.8％。結(jié)合在該甘油三酯2-位上的脂肪酸P、O、L、G和D分別表示棕櫚酸、油酸、亞油酸、γ-亞麻酸和雙高-γ-亞麻酸，8P8是1，3-辛酰基-2-棕櫚?；?甘油，8O8是1，3-辛酰基-2-油?；?甘油，8L8是1，3-辛酰基-2-亞油?；?甘油，8G8是1，3-辛?；?2-γ-亞麻?；?甘油，8D8是1，3-辛?；?2-雙高-γ-亞麻?；?甘油)。用高效液相色譜根據(jù)已經(jīng)確立的方案進(jìn)行分離和純化，由該包含8A8的油/脂肪(甘油三酯)得到96摩爾百分比的8A8。
實(shí)施例3試驗(yàn)?zāi)z囊的制備在50-60℃下向100重量份的明膠和35重量份的食品級(jí)甘油中加入水使其溶解從而制備一種粘度為2000cp的明膠包覆物。然后，將0.05重量％的維生素E油與得自實(shí)施例1的包含花生四烯酸的油/脂肪(甘油三酯)混合，制得填充內(nèi)含物1。另外，將0.05重量％維生素E油與得自實(shí)施例2的包含32摩爾百分比8A8的油/脂肪(甘油三酯)混合從而制得填充內(nèi)含物2。用常規(guī)方法將填充內(nèi)含物1模塑成形并將膠囊干燥，從而制得每粒膠囊包含200mg填充物的軟膠囊(包含花生四烯酸的食用油膠囊)，同時(shí)也用普通方法將填充內(nèi)含物2模塑成形并將膠囊干燥，從而制得每個(gè)膠囊包含200mg填充物的軟膠囊(包含8A8的食用油膠囊)。還制造包含橄欖油作為填充內(nèi)含物的軟膠囊作為人試驗(yàn)的安慰劑膠囊。
實(shí)施例4用于測(cè)定對(duì)健康個(gè)體認(rèn)知響應(yīng)的作用的包含花生四烯酸的食用油膠囊攝食試驗(yàn)根據(jù)日本臨床神經(jīng)生理學(xué)協(xié)會(huì)誘發(fā)電位實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)確定的誘發(fā)電位測(cè)量方針通過(guò)聽(tīng)力(或聽(tīng)覺(jué)辨別)任務(wù)測(cè)量事件相關(guān)腦電位(ERP)。具體地講，用聽(tīng)覺(jué)的OB刺激序列(Oddball paradigm)來(lái)進(jìn)行ERP測(cè)量并且用1000Hz和2000Hz頻率下兩種不同的純音對(duì)試驗(yàn)受試者的兩個(gè)耳朵進(jìn)行刺激，所說(shuō)的純音是通過(guò)耳機(jī)以1∶4的比例和隨機(jī)的次序發(fā)出的，并且教導(dǎo)該個(gè)體當(dāng)聽(tīng)到2000Hz的音調(diào)時(shí)壓下所提供的按鈕并對(duì)所聽(tīng)到的次數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。該音調(diào)的強(qiáng)度為90dB，持續(xù)時(shí)間為100msec并且刺激間的時(shí)間間隔是在1000-3000msec之間隨意選取的。實(shí)際試驗(yàn)中刺激的數(shù)目大約為每次試驗(yàn)200次并且該試驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間為約10分鐘。在2次試驗(yàn)中進(jìn)行該測(cè)定并且測(cè)量事件相關(guān)腦電位。用Ag-AgCl電極記錄腦電圖(EEG)，所說(shuō)電極的電阻不高于5kΩ，將其沿著頭皮的中線放在三個(gè)點(diǎn)上(Fz、Cz和Pz，根據(jù)國(guó)際10-20個(gè)位移)，并且在兩個(gè)耳垂上放置參考電極。
將從感知到低頻聽(tīng)覺(jué)刺激(在這種實(shí)驗(yàn)中為2000Hz的音調(diào))開(kāi)始250-600msec之間的最大正電位確定為固有組件P300，其會(huì)在選擇性注意或認(rèn)知響應(yīng)的評(píng)估中發(fā)生變化，將從刺激開(kāi)始時(shí)算起的時(shí)間記錄為P300潛伏期(刺激傳遞速度)并將從基線算起的電位高度記錄為P300振幅(信息處理資源的數(shù)量)。
遵照赫爾辛基宣言的精神進(jìn)行本發(fā)明的人類試驗(yàn)。
在對(duì)允許參與試驗(yàn)的條件進(jìn)行解釋后，將12名符合要求的健康個(gè)體(不服藥、沒(méi)有異常的血液試驗(yàn)結(jié)果并且用顱CT掃描測(cè)定時(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)梗塞)分成A和B兩組(An＝7，Bn＝5)。在一個(gè)月內(nèi)，給A組每天服用三粒實(shí)施例3制備的包含花生四烯酸的食用油膠囊(80mg花生四烯酸/膠囊)，花生四烯酸的日攝取量為240mg，而給B組使用三粒安慰劑膠囊。在服用膠囊前和服用膠囊后，測(cè)量事件相關(guān)腦電位，并對(duì)P300潛伏期和振幅進(jìn)行分析。然后，A組和B組中的參與者都經(jīng)歷一個(gè)月不服用膠囊的洗脫期。在該洗脫期后，給A組服用安慰劑膠囊并給B組服用包含花生四烯酸的食用油膠囊，服用一個(gè)月，用相同的方式測(cè)量服用膠囊前和服用膠囊后事件相關(guān)腦電位(雙盲的交叉試驗(yàn))。
在測(cè)量事件相關(guān)腦電位時(shí)采血，并用Folch法將總脂質(zhì)從各參加者的血清中萃取出來(lái)。用薄層色譜對(duì)該脂質(zhì)進(jìn)行分離，收集包含磷脂的級(jí)分，通過(guò)與乙醇一起共沸蒸餾除去水，在用10％HCl-甲醇將其轉(zhuǎn)化成脂肪酸甲酯后用氣相色譜對(duì)其進(jìn)行分析以測(cè)定血清磷脂的花生四烯酸含量。
圖1顯示了在服用膠囊前和服用膠囊后血清磷脂中花生四烯酸含量的變化。服用包含花生四烯酸的食用油膠囊的個(gè)體的血清磷脂的花生四烯酸含量在服用了該包含花生四烯酸的食用油膠囊后顯著增加，而服用安慰劑膠囊的個(gè)體的血清磷脂的花生四烯酸含量在服用安慰劑膠囊前和服用后沒(méi)有變化。
圖2和圖3顯示了在服用膠囊前和服用膠囊后P300潛伏期和振幅的變化。與安慰劑膠囊相比，服用包含花生四烯酸的食用油膠囊時(shí)P300潛伏期被顯著縮短了12.3msec并且P300振幅被顯著增加了1.9μV。已知P300潛伏期每年正?？s短1.8msec并且P300振幅每年降低0.2μV(GoodinDS等人，1978)，因此，本試驗(yàn)的結(jié)果表明以P300潛伏期計(jì)，個(gè)體認(rèn)知響應(yīng)的平均復(fù)壯為6.8年，以P300振幅計(jì)為9.5年。
然后，通過(guò)以總共使用48個(gè)數(shù)據(jù)(其是通過(guò)測(cè)量12名個(gè)體，每名個(gè)體測(cè)量4次獲得的)的最小二乘法為基礎(chǔ)的一級(jí)曲線(圖4)來(lái)測(cè)定P300(P300潛伏期和P300振幅)與血清花生四烯酸水平(磷脂)之間的相關(guān)性。對(duì)于P300潛伏期而言，發(fā)現(xiàn)與花生四烯酸水平之間有顯著的相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)R＝-0.27)，花生四烯酸水平增加導(dǎo)致潛伏期縮短。對(duì)于P300振幅而言，發(fā)現(xiàn)與花生四烯酸水平之間也有顯著的相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)R＝-0.49)，花生四烯酸水平增加產(chǎn)生較大的P300振幅。這提供了通過(guò)攝食包含花生四烯酸的食用油可以改善認(rèn)知響應(yīng)的第一個(gè)實(shí)證，以及花生四烯酸可以引起該作用的第一份證據(jù)。
實(shí)施例5用于測(cè)定對(duì)健康個(gè)體認(rèn)知響應(yīng)的作用的包含8A8的食用油膠囊攝食試驗(yàn)以與實(shí)施例4相同的方式對(duì)允許參與試驗(yàn)的條件進(jìn)行解釋后，將16名符合要求的健康個(gè)體(不服藥、沒(méi)有異常的血液試驗(yàn)結(jié)果并且用顱CT掃描測(cè)定時(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)梗塞)分成A和B兩組(各組的n＝8)。在一個(gè)月內(nèi)，每天給A組服用三粒實(shí)施例3制得的包含8A8的食用油膠囊(72mg花生四烯酸/膠囊)而給B組服用三粒安慰劑膠囊，在測(cè)量事件相關(guān)腦電位并記錄在服用膠囊前和服用后的潛伏期和振幅(雙盲試驗(yàn))后發(fā)現(xiàn)由于服用包含8A8的食用油膠囊而使得P300潛伏期顯著縮短了16.3msec并且P300振幅顯著增加了2.4μV。這些結(jié)果表明以P300潛伏期計(jì)，個(gè)體認(rèn)知響應(yīng)的平均復(fù)壯為9.1年，以P300振幅計(jì)為12.0年。
實(shí)施例6包含含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的油/脂肪(甘油三酯)的膠囊的制備在50-60℃下向100重量份的明膠和35重量份的食品級(jí)甘油中加入水使其溶解從而制備一種粘度為2000cp的明膠包覆物。然后，將50重量％實(shí)施例1所獲得的包含花生四烯酸的油/脂肪(甘油三酯)與50重量％的魚(yú)油(分別以占總脂肪酸5.1％和26.5％的比例包含二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的金槍魚(yú)油)進(jìn)行混合，然后將其與0.05重量％維生素E油相結(jié)合從而制得填充內(nèi)含物3。另外，將80重量％包含花生四烯酸的油/脂肪(甘油三酯)與20重量％魚(yú)油(分別以占總脂肪酸5.1％和26.5％的比例包含二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的金槍魚(yú)油)混合，然后將其與0.05重量％維生素E油混合從而制得填充內(nèi)含物4。還將得自實(shí)施例1的99％花生四烯酸乙酯與0.05重量％維生素E油混合從而獲得填充內(nèi)含物5。用普通方法將填充內(nèi)含物3-5模塑成型并將膠囊干燥，從而制得每粒膠囊包含200mg填充物的軟膠囊。
實(shí)施例7在油性輸液中的應(yīng)用在將400g得自實(shí)施例2的包含96％8A8的油/脂肪(甘油三酯)、48g精制的蛋黃卵磷脂、20g油酸、100g甘油和40ml 0.1N苛性鈉混合并用勻漿器將該混合物進(jìn)行分散后，向其中加入注射用蒸餾水至4升。用高壓噴霧型乳化器對(duì)其進(jìn)行乳化，制得一種脂質(zhì)乳劑。以200ml一份的量將該脂質(zhì)乳劑分裝到塑料袋中并將其在121℃下用高壓蒸汽滅菌處理20分鐘，從而制得油狀輸液。
實(shí)施例8在果汁中的應(yīng)用將2g β-環(huán)糊精加入到20ml 20％乙醇水溶液中，然后在用攪拌器進(jìn)行攪拌的同時(shí)向其中加入100mg得自實(shí)施例1的包含花生四烯酸的甘油三酯(包含0.05％維生素E)，然后將該混合物在50℃下保溫2小時(shí)。在將其冷卻至室溫后(約1小時(shí))，在連續(xù)攪拌的情況下將其在4℃下繼續(xù)保溫10小時(shí)。通過(guò)離心分離回收產(chǎn)生的沉淀，并且在用正己烷進(jìn)行洗滌后，將其冷凍干燥，得到1.8g環(huán)糊精包合的包含含有花生四烯酸的甘油三酯的化合物。將1g該粉末與10L果汁均勻混合，制得包含含有花生四烯酸的甘油三酯的果汁。
權(quán)利要求
1.一種具有預(yù)防健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)降低或具有改善或增強(qiáng)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)的作用的組合物，其包含花生四烯酸和/或含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所說(shuō)的含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物是花生四烯酸醇酯或包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的一部分或全部的甘油三酯、磷脂或糖脂。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所說(shuō)的包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的一部分或全部的甘油三酯是一種在1，3-位上結(jié)合有中鏈脂肪酸并且在2-位上結(jié)合有花生四烯酸的甘油三酯。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中所說(shuō)的中鏈脂肪酸選自6至12個(gè)碳原子的脂肪酸。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中所說(shuō)的中鏈脂肪酸選自8個(gè)碳原子的脂肪酸。
6.一種具有預(yù)防健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)降低或具有改善或增強(qiáng)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)的作用的組合物，其包含含有包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的一部分或全部的甘油三酯的甘油三酯。
7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于含有包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的一部分或全部的甘油三酯的甘油三酯的花生四烯酸含量為該甘油三酯中總脂肪酸含量的至少10重量％。
8.如權(quán)利要求6或7所述的組合物，其中所說(shuō)的含有包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的一部分或全部的甘油三酯的甘油三酯是從屬于被孢霉屬的微生物中提取的。
9.如權(quán)利要求6至8中任意一項(xiàng)所述的組合物，其中所說(shuō)的包括包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的一部分或全部的甘油三酯的甘油三酯是不包含二十碳五烯酸或包含不高于1％二十碳五烯酸的甘油三酯。
10.一種具有預(yù)防健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)降低或具有改善或增強(qiáng)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)的作用的組合物，其包含含有至少5摩爾百分比在1，3-位上結(jié)合有中鏈脂肪酸并且在2-位上結(jié)合有花生四烯酸的甘油三酯的甘油三酯。
11.如權(quán)利要求10所述的組合物，其中所說(shuō)的中鏈脂肪酸選自6至12個(gè)碳原子的脂肪酸。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其中所說(shuō)的中鏈脂肪酸選自8個(gè)碳原子的脂肪酸。
13.如權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)所述的具有預(yù)防健康人作為認(rèn)知能力的對(duì)于選自聽(tīng)覺(jué)刺激、視覺(jué)刺激、嗅覺(jué)刺激、味覺(jué)刺激和軀體感覺(jué)刺激的事件的處理速度或響應(yīng)速度的正常響應(yīng)降低或改善或增強(qiáng)該正常響應(yīng)的作用的組合物。
14.如權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)所述的具有預(yù)防健康人作為認(rèn)知能力的對(duì)于選自聽(tīng)覺(jué)刺激、視覺(jué)刺激、嗅覺(jué)刺激、味覺(jué)刺激和軀體感覺(jué)刺激的事件的注意力正常響應(yīng)降低或改善或增強(qiáng)該正常響應(yīng)的作用的組合物。
15.如權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)所述的具有預(yù)防健康人作為認(rèn)知能力的感知水平的正常響應(yīng)降低或改善或增強(qiáng)該正常響應(yīng)的作用的組合物。
16.如權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)所述的具有預(yù)防健康人作為認(rèn)知能力的對(duì)于選自聽(tīng)覺(jué)刺激、視覺(jué)刺激、嗅覺(jué)刺激、味覺(jué)刺激和軀體感覺(jué)刺激的事件的辨別能力正常響應(yīng)降低或改善或增強(qiáng)該正常響應(yīng)的作用的組合物。
17.如權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)所述的具有縮短作為認(rèn)知能力的響應(yīng)指標(biāo)的事件相關(guān)腦電位(P300)的P300潛伏期的作用的組合物。
18.如權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)所述的具有增加作為認(rèn)知能力的響應(yīng)指標(biāo)的事件相關(guān)腦電位(P300)的P300振幅的作用的組合物。
19.如權(quán)利要求1至18中任意一項(xiàng)所述的組合物，其中所說(shuō)的組合物是食品組合物或藥物組合物。
20.一種食品組合物，其含有可以使成人每天攝入0.001-20g花生四烯酸的量包含花生四烯酸和/或含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物的。
21.如權(quán)利要求20所述的食品組合物，其中所說(shuō)的含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物是花生四烯酸醇酯或包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的一部分或全部的甘油三酯、磷脂或糖脂。
22.如權(quán)利要求21所述的食品組合物，其中所說(shuō)的包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的一部分或全部的甘油三酯是一種在1，3-位上結(jié)合有中鏈脂肪酸并且在2-位上結(jié)合有花生四烯酸的甘油三酯。
23.如權(quán)利要求22所述的食品組合物，其中所說(shuō)的中鏈脂肪酸選自6至12個(gè)碳原子的脂肪酸。
24.如權(quán)利要求23所述的食品組合物，其中所說(shuō)的中鏈脂肪酸選自8個(gè)碳原子的脂肪酸。
25.一種食品組合物，其特征在于該組合物包含至少0.001重量％的在1，3-位上結(jié)合有中鏈脂肪酸并且在2-位上結(jié)合有花生四烯酸的甘油三酯。
26.如權(quán)利要求25所述的食品組合物，其中所說(shuō)的中鏈脂肪酸選自6至12個(gè)碳原子的脂肪酸。
27.如權(quán)利要求26所述的食品組合物，其中所說(shuō)的中鏈脂肪酸選自8個(gè)碳原子的脂肪酸。
28.如權(quán)利要求20至27中任意一項(xiàng)所述的組合物，其中所說(shuō)的食品組合物是功能性食品、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑食品、特殊的健康護(hù)理食品或老年食品。
29.如權(quán)利要求1至28中任意一項(xiàng)所述的組合物，其還包含二十二碳六烯酸和/或含有二十二碳六烯酸作為組成脂肪酸的化合物。
30.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所說(shuō)的含有二十二碳六烯酸作為組成脂肪酸的化合物是二十二碳六烯酸醇酯或包含二十二碳六烯酸作為組成脂肪酸的一部分或全部的甘油三酯、磷脂或糖脂。
31.如權(quán)利要求29或30所述的組合物，其特征在于所說(shuō)的花生四烯酸和二十二碳六烯酸的聯(lián)合中花生四烯酸/二十二碳六烯酸比例(重量比)范圍為0.1-15。
32.如權(quán)利要求1至31中任意一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于組合物中還存在二十碳五烯酸，其含量不超過(guò)所說(shuō)組合物中花生四烯酸含量的1/5。
33.一種制備具有預(yù)防健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)降低或具有改善或增強(qiáng)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)的作用的食品組合物的方法，其特征在于單獨(dú)使用花生四烯酸和/或含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物或?qū)⑵渑c基本不含或僅含痕量花生四烯酸的食品原料混合。
34.一種銷售具有預(yù)防健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)降低或具有改善或增強(qiáng)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)的作用的包含花生四烯酸和/或含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物的組合物的方法，該銷售具有預(yù)防健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)降低或具有改善或增強(qiáng)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)的作用的組合物的方法的特征在于使用表明組合物的組成和/或組分具有改善或增強(qiáng)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)或預(yù)防其降低的作用的包裝容器和/或銷售工具。
35.一種具有預(yù)防健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)降低或具有改善或增強(qiáng)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)的作用的組合物，其特征在于其是包含花生四烯酸和/或含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物的組合物，其是使用一種表明組合物的組成和/或組分具有改善或增強(qiáng)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)或預(yù)防其降低的作用的包裝容器和/或銷售工具來(lái)進(jìn)行銷售的。
全文摘要
用花生四烯酸和/或包含花生四烯酸作為組成脂肪酸的化合物來(lái)獲得可以改善或增強(qiáng)健康人認(rèn)知能力正常響應(yīng)或預(yù)防其降低的組合物，并且該組合物十分適宜作為具有極小的副作用的藥物以及食品。
文檔編號(hào)A61K45/06GK1684677SQ0382270
公開(kāi)日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2003年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月24日
發(fā)明者秋元健吾, 古賀良彥 申請(qǐng)人:三得利株式會(huì)社