一種增強發(fā)酵乳中蛋白質(zhì)水解的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種增強發(fā)酵乳中蛋白質(zhì)水解的方法，所述方法將經(jīng)過熱激修飾的瑞士乳桿菌按3％～8％(v/v)的接種量接種于滅菌處理的8％～15％(m/v)的牛乳中，厭氧培養(yǎng)得到發(fā)酵乳制品。本發(fā)明發(fā)酵過程中能夠顯著抑制菌體的產(chǎn)酸，發(fā)酵完成后不易產(chǎn)生苦味，菌體胞內(nèi)和胞外蛋白水解酶系共同作用于乳蛋白，發(fā)酵結(jié)束后能產(chǎn)生較多種類的小肽段和一些功能性肽段，提高發(fā)酵乳中小肽的含量，加大乳中各蛋白質(zhì)的水解程度，有利于腸道的消化吸收，有利于過敏性物質(zhì)消除，并且所產(chǎn)生的生物活性肽有利于對身體機能的調(diào)節(jié)。
【專利說明】
一種增強發(fā)酵乳中蛋白質(zhì)水解的方法
技術(shù)領域
[0001] 本發(fā)明涉及食品加工領域，具體地說，涉及一種增強發(fā)酵乳中蛋白質(zhì)水解的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在牛奶中，酪蛋白是主要蛋白質(zhì)，約占蛋白質(zhì)總量的80%，相對于乳清蛋白，酪蛋 白在胃內(nèi)酸和酶的作用下容易形成比較結(jié)實的乳凝塊，不利于消化吸收，尤其是對于嬰幼 兒和一些腸胃消化功能不好的病人，大大降低了牛乳蛋白的利用率。另外，腸道所吸收的肽 類主要是由10個以下氨基酸殘基構(gòu)成的寡肽，尤其是小肽。所以，如果能水解牛乳中的酪 蛋白成為分子量較小的寡肽將會大大促進牛乳的消化吸收，提高牛乳蛋白質(zhì)的利用率。在 目前的技術(shù)中，較多采用添加乳清蛋白或酶解的方式來降低牛乳中酪蛋白的比例。添加乳 清蛋白是目前嬰幼兒配方乳粉和一些兒童乳制品中廣泛采用的方法，乳清蛋白是干酪制作 過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，由于國內(nèi)干酪產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢，國內(nèi)使用的乳清粉大多采用進口，另外 乳清與酪蛋白相比其營養(yǎng)價值較低，不適宜大規(guī)模添加。對酶解酪蛋白的研究，目前較多采 用單一蛋白酶或者兩種或兩種以上蛋白酶酶解的方式，所采用蛋白酶大多為胃蛋白酶、胰 蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等等，其水解程度不易控制，容易產(chǎn)生較多苦味肽和其他 不良風味，影響產(chǎn)品感官特性，水解所產(chǎn)生的的小肽種類也較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種增強發(fā)酵乳中蛋白質(zhì) 水解的方法。
[0004] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種增強發(fā)酵乳中蛋白質(zhì)水解的方法，所 述方法將經(jīng)過熱激修飾的瑞士乳桿菌按3 %~8 % (v/v)的接種量接種于滅菌處理的8 %~ 15% (m/v)的牛乳中，厭氧培養(yǎng)得到發(fā)酵乳制品。
[0005] 作為優(yōu)選，所述瑞士乳桿菌的接種量為4%。
[0006] 進一步地，所述厭氧培養(yǎng)的混合氣配比為N2:C02:H 2= 90:5:5(v/v/v)，純度為 99. 99 %，培養(yǎng)溫度為30 °C~45 °C，培養(yǎng)時間為4h~16h。
[0007] 更為優(yōu)選，所述方法將經(jīng)過熱激修飾的瑞士乳桿菌按4%的接種量接種于滅菌處 理的12%的脫脂乳中，37°C厭氧培養(yǎng)8h，得到發(fā)酵乳制品。
[0008] 更進一步地，所述經(jīng)過熱激修飾的瑞士乳桿菌的制備方法包括如下步驟：
[0009] 1)瑞士乳桿菌活化：將儲存在-80°C冰箱的菌株取出，以3%的接種量，采用MRS 肉湯培養(yǎng)基在37°C厭氧條件下培養(yǎng)24h~36h，活化3代至活力恢復；
[0010] 2)瑞士乳桿菌的培養(yǎng)：將活化完成的菌株按3%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基， 37°C厭氧高密度培養(yǎng)48h ;
[0011] 3)瑞士乳桿菌熱激修飾前的準備：收獲的菌體采用pH 7. 0的磷酸鹽緩沖液沖洗 兩次，然后重懸于pH 7. 0的磷酸緩沖液，并調(diào)整菌體濃度為1012cfu/mL左右；
[0012] 4)瑞士乳桿菌的熱激：將準備的瑞士乳桿菌懸浮液在50°C~80°C條件下熱激處 理5s~30s，得到熱激修飾的瑞士乳桿菌，4°C存放備用。
[0013] 作為優(yōu)選，所述步驟4)中將準備的瑞士乳桿菌懸浮液在67°C條件下熱激處理 13s〇
[0014] 其中，所述MRS肉湯培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨10. 0g，牛肉粉10. 0g，酵母粉5. 0g， 葡萄糖20. 0g，硫酸鎂0. lg，醋酸鈉5. 0g，檸檬酸銨2. 0g，磷酸氫二鉀2. 0g，硫酸錳0. 05g， 土溫 801. OmL，去離子水 1000mL，pH 6. 2。
[0015] 本發(fā)明還提供了前述方法制備得到的發(fā)酵乳。
[0016] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0017] 本發(fā)明采用經(jīng)過熱激修飾的瑞士乳桿菌，用于乳制品的發(fā)酵，發(fā)酵過程中能夠顯 著抑制菌體的產(chǎn)酸，發(fā)酵完成后不易產(chǎn)生苦味，菌體胞內(nèi)和胞外蛋白水解酶系共同作用于 乳蛋白，發(fā)酵結(jié)束后能產(chǎn)生較多種類的小肽段和一些功能性肽段，提高了發(fā)酵乳中小肽的 含量，增大乳中各蛋白質(zhì)的水解程度，有利于腸道的消化吸收，有利于過敏性物質(zhì)消除，并 且所產(chǎn)生的生物活性肽有利于對身體機能的調(diào)節(jié)。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發(fā)明人實施例1中不同接種量下發(fā)酵過程中的pH值變化。
[0019] 圖2為本發(fā)明人實施例1中不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵過程中的pH值變化。
[0020] 圖3為本發(fā)明實施例2所述發(fā)酵過程中pH值的變化。
[0021] 圖4為本發(fā)明實施例2所述發(fā)酵過程中12% TCA-SN(a)和pH4. 6-SN(b)的變化 (12%^^-5^溶于12%三氯乙酸的游離氨基氮含量，？財.6-5^溶于？!14.6的游離氨基氮 含量）。
[0022] 圖5為本發(fā)明人實施例2所述發(fā)酵過程中產(chǎn)生肽段的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測；其 中，a :熱激組中不同發(fā)酵時間組的肽段分布；b :未熱激組中不同發(fā)酵時間組的肽段分布； c :熱激組和未熱激組中9肽的個數(shù)隨發(fā)酵時間的變化情況。
[0023] 圖6為本發(fā)明人實施例2中對未熱激組中3B組和熱激組中5R組中識別多肽的統(tǒng) 計；其中，a :3B和5R組中多肽分布；b :3B和5R組中所識別的多肽在幾種常見蛋白的覆蓋 率；c :3B和5R組中所識別的多肽在幾種常見蛋白中的分布。
[0024] 圖7為本發(fā)明人實施例2中通過nanoLC-QE-MS/MS檢測和Proteome Discoverer 1. 4分析鑒定出熱激組5R組中的三條特異性活性肽段圖譜，VRGPFPIIV(a)， QKALNEINQF(b), YQEPVLGPVRGPFPI (c) 〇
【具體實施方式】
[0025] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0026] 實施例中涉及的檢測方法為：
[0027] 1) pH檢測：數(shù)顯式pH計檢測。
[0028] 2)游離氨基氮檢測：采用〇 -鄰苯二甲醛（0ΡΑ)試劑法檢測12% TCA_SN(12% (w/ v) TCA濃度下可溶性氮含量），pH4. 6-SN (pH4. 6下的可溶性氮含量）。
[0029] 3)小肽段檢測：采用Thermo公司UltiMate 3000納升高效液相色譜串聯(lián) Q-Exactive質(zhì)譜檢測。
[0030] 實施例1
[0031] 1、菌種活化。將-80°C保藏的菌株采用MRS肉湯培養(yǎng)基活化三代至活力恢復。
[0032] 2、菌株的高密度培養(yǎng)。將活化完成的菌株在MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，采用大容 量冷凍離心機收獲菌體，并用PH7. 0的磷酸緩沖液洗滌菌體兩遍，最后菌體重懸于pH7. 0的 磷酸緩沖液，并調(diào)整菌體濃度為1012cfu/mL，4°C保藏備用。
[0033] 3、菌體熱激處理。將菌體懸浮液通過
【申請人】已獲得專利權(quán)的熱激設備（公開號CN 101735965A)，在67°C處理13s，置于4°C保藏備用。
[0034] 4、不同接種量的發(fā)酵試驗。將熱激完成后的瑞士乳桿菌菌液按照2%、3%、4%、 5%、6%的接種量接種于滅菌脫脂乳培養(yǎng)基中，混合均勻，置于37°C厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔 一段時間取樣檢測。
[0035] 5、不同溫度下的發(fā)酵試驗。將熱激完成后的瑞士乳桿菌菌液按照步驟4中所得接 種量接種于滅菌脫脂乳培養(yǎng)基中，混合均勻，置于31°(：、34°(：、37°(：、40°(：、43°(：厭氧培養(yǎng)箱 培養(yǎng)。每隔一段時間取樣檢測。
[0036] 6、結(jié)果顯示，隨著接種濃度的加大和發(fā)酵溫度的升高，pH值所反映的菌體代謝活 性的增加，如圖1所示，接種量較小時，菌體發(fā)酵活力較弱，pH值變化不大，隨著接種量的加 大，菌體發(fā)酵活力增強，同時考慮添加量與經(jīng)濟的關系，選擇4%的添加量為好。如圖2所 示，發(fā)酵溫度較低時，菌體活動較慢，加上熱激效應對菌體的影響，溫度較低不利于菌體生 長，不利于發(fā)酵活動的進行，而溫度較高時，菌體生長較為迅速，不利于熱激作用對菌體內(nèi) 酶的釋放，故選用37°C為試驗發(fā)酵溫度。
[0037] 實施例2
[0038] 1、菌株活化。將_80°C保藏的菌株采用MRS肉湯培養(yǎng)基（購自北京路橋技術(shù)有限 責任公司，商品名稱：MRS肉湯）活化三代至活力恢復。
[0039] 2、菌株的高密度培養(yǎng)。將活化完成的菌株在MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，采用大容 量冷凍離心機收獲菌體，并用pH 7.0的磷酸緩沖液洗滌菌體兩遍，最后菌體重懸于pH 7.0 的磷酸緩沖液，并調(diào)整菌體濃度為1012cfu/mL，4°C保藏備用。
[0040] 3、菌體熱激處理。將菌體懸浮液通過
【申請人】已獲得專利權(quán)的熱激設備（公開號CN 101735965A)，在67°C處理13s，置于4°C保藏備用。
[0041] 4、熱激菌體發(fā)酵。將12% (w/v)脫脂乳培養(yǎng)基滅菌完成后，按4% (v/v)接種量 接種熱激處理后的菌液，混合均勻，置于37°C厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔一段時間取樣檢測。
[0042] 5、發(fā)酵過程中的pH值、12% TCA-SN、pH4. 6-SN和多肽的檢測。
[0043] 檢測方法：
[0044] 5. 1 pH 值檢測
[0045] 采用數(shù)顯式pH計，經(jīng)過標準pH值溶液校準。
[0046] 5. 2 12% TCA-SN 值和 pH4. 6-SN 值的檢測
[0047] 12% TCA-SN的制備取3mL牛乳樣品與3mL 24% TCA溶液混合均勻，室溫下靜置 30min，在5000Xg，4°C條件下離心20min，再經(jīng)過慢速定量濾紙過濾所得，-20°C放置備用。
[0048] pH4. 6-SN的制備取3mL牛乳樣品，用1M NaOH溶液或者1M鹽酸溶液調(diào)整pH值 為4. 6,室溫下靜置30min，在5000 X g，4°C條件下離心20min，再經(jīng)過慢速定量濾紙過濾所 得，-20 °C放置備用。
[0049] 檢測采用鄰苯二甲醛法（0ΡΑ法）檢測。鄰苯二甲醛試劑的配制：準確稱取0. 040g 鄰苯二甲醛溶解于lmL甲醇溶液中，稱取0. 950g四硼酸鈉（Na2B407 ·10Η20)，0. 5g十二烷基 磺酸鈉，加入1〇〇 μ L β -疏基乙醇，溶解后定容至50mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。取100 μ L樣品濾液，加 入2mL現(xiàn)配的鄰苯二甲醛試劑，室溫條件下精確反應2min，測定在340nm波長下的吸光度。
[0050] 5. 3 發(fā)酵乳中多妝的 Nano-LC-Q-Exactive-MS/MS 檢測
[0051] 樣品的制備：取lmL制備的12% TCA-SN溶液，經(jīng)過Waters公司Oasis HLB固相萃 取小柱處理，洗脫液經(jīng)過冷凍干燥后復溶于0.1 % (v/v)的甲酸水溶液。在10000Xg、4°c 條件下離心10min，取上清液進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測。
[0052] 色譜條件：采用Thermo公司UltiMate 3000納升高效液相色譜系統(tǒng)，上樣量 1 μL，富集柱：C18 Acclaim PepMaplOO column (100 μmX2cm，nanoViper，C18,5 μm， 100 A: Thermo Scientific)，分析柱：Acclaim PepMap RSLC 75ymX15cm，nanoViper， C18, 2 μ m，100 A; Thermo Scientific，流動相 A :水：乙腈：甲酸=98:2:0. 1 (v/v/v)，流 動相B :水：乙腈：甲酸=20:80:0. l(v/v/v)，流速：0. 25yL/min，洗脫梯度：B相初始保持 4% 4min，在95min內(nèi)線性增加到35%，再在10min內(nèi)增加到90%。在下一個上樣前，用初 始濃度平衡8min，總分析時間為120min。柱溫35°C。
[0053] 質(zhì)譜條件：高效液相色譜串聯(lián)Thermo公司Q Exactive液相四極桿軌道講傅里葉 轉(zhuǎn)換高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)。在正極模式下，電壓2. 5Kv，m/z掃描范圍是200-3000。完成后經(jīng)過 Thermo 公司 Thermo Proteome Discoverer 1. 4 分析，分析數(shù)據(jù)庫來源于 www. ncbi. org，軟 件參數(shù)為：裂解位點：unspecific enzyme ;片段離子mass tolerance :0· 02Da ;每個識別肽 段的precursor mass tolerance : 10ppm ;有效肽段的q-value小于0· 05,最低肽段長度：4 個氨基酸殘基。
[0054] 6、實驗結(jié)果
[0055] 6. 1發(fā)酵過程中的pH值變化。
[0056] 通過熱激處理后，經(jīng)過MRS培養(yǎng)基計數(shù)顯示，菌體存活數(shù)為109cfu/mL。在6h的發(fā) 酵時間內(nèi)，與未熱激組相比，熱激組菌體產(chǎn)酸明顯受到抑制，在發(fā)酵16h后二者才沒有顯著 差異（見圖3)。
[0057] 6. 2發(fā)酵過程中可溶性氮的變化
[0058] 12% TCA-SN表示的是可溶性小肽（含有2-20個氨基酸殘基）的含量。如圖4a 所示，在隨著培養(yǎng)時間的進行，熱激組和未熱激組都呈逐漸增加趨勢，在6h的培養(yǎng)時間內(nèi)， 熱激組增加緩慢，未熱激組增加較為迅速，熱激組的12% TCA-SN的值在6h-10h內(nèi)增加迅 速，并在18h后進入平臺期，未熱激組在10h后進入平臺期。在發(fā)酵過程中，熱激處理的瑞 士乳桿菌產(chǎn)酸能力受到明顯抑制，同時其水解產(chǎn)生小肽和氨基酸的能力也受到抑制，12% TCA-SN的值增加緩慢，但是蛋白質(zhì)在熱激菌體的作用下持續(xù)水解，肽段也在持續(xù)增多。這主 要是菌體經(jīng)過熱激處理后，菌體細胞壁變薄、細胞膜的通透性增強，菌體內(nèi)大量的蛋白水解 酶系會緩慢的釋放出來，牛乳蛋白在胞外蛋白水解酶系的作用下，大分子蛋白水解成多肽 段，多肽在胞內(nèi)酶系的作用下會進一步水解成小分子肽段和氨基酸。經(jīng)過熱激處理后，菌體 細胞壁上附著的一些熱敏感性酶系會受到較大影響，這也可能是導致小肽生成量減少的原 因之一。
[0059] pH4. 6-SN表示的是除去不溶性蛋白的部分。不像12% TCA-SN僅包含小分子肽 段，pH4. 6-SN還會有部分可溶性小分子蛋白的存在，如圖4b所示，熱激處理的瑞士乳桿菌 在6h-10h內(nèi)迅速增加，在12h后即達到平臺期，并且與未熱激組沒有顯著差異。在熱激組 12% TCA-SN減少的同時，pH4.6-SN的值卻與未熱激組沒有顯著差異表明有更多的大分子 多肽的生成。這主要是胞外蛋白水解酶系的作用范圍，可能是菌體經(jīng)過熱激處理后，細胞壁 的通透性增強，使胞外蛋白酶系更多更快的滲透出去，促進牛乳中蛋白的水解，生成更多的 蛋白多肽。
[0060] 6. 3 發(fā)酵過程中多肽的 Nano-LC-Q-Exactive-MS/MS 檢測
[0061] 發(fā)酵過程中生成的肽段經(jīng)過Nano-LC-Q-Exactive-MS/MS的檢測，在所識別的多 肽中選取相對分子質(zhì)量在3kDa以下的多肽進行統(tǒng)計分析。
[0062] 以肽段中所含的氨基酸殘基數(shù)為橫坐標，以此長度下的肽段個數(shù)為縱坐標，各選 取3組具有典型肽段分布的時間點繪制直方圖如圖5所示。在不同的發(fā)酵時間，肽段的長 度分布明顯不同，4R (發(fā)酵6h)和5R (發(fā)酵8h)包含有較多的9-12個氨基殘基的肽段，其中 5R組最多（如圖5a所示），在發(fā)酵前期包含9-17個氨基酸殘基的多肽數(shù)較多，肽段越長， 其數(shù)目越少，隨著發(fā)酵時間的進行，包含9-17個氨基酸殘基的多肽數(shù)逐漸降低，21個左右 的氨基酸殘基逐漸增多，經(jīng)過12_14h發(fā)酵后（7R組，8R組）肽段分布趨于穩(wěn)定。有研究表 明，酪蛋白在經(jīng)過6h左右的消化后，含有6-9個氨基酸殘基（相對分子質(zhì)量在750到1050Da 之間）的多肽含量較多，乳清蛋白經(jīng)過6h消化后，含有9-15個氨基酸殘基（相對分子質(zhì)量 在1050到1800Da之間）的多肽含量較多，所以，腸道中含有9個左右氨基酸殘基的多肽較 易于消化吸收。發(fā)酵過程中的9肽含量的變化如圖5c所示，經(jīng)過熱激處理后，與未熱激組 相比，菌體發(fā)酵牛乳產(chǎn)生9肽的含量增加了 27. 78%，雖然這一結(jié)果延遲了 4個小時。
[0063] 瑞士乳桿菌發(fā)酵牛乳過程中，蛋白水解酶系隨著發(fā)酵時間的進行不斷分泌，并在 熱激修飾的作用下不斷加強，并且經(jīng)過熱激修飾后，菌體生長減慢，菌體本身所利用的肽減 少，導致多肽的大量積累。小肽的不斷快速積累并在8h左右達到峰值，隨著在菌體的正常 快速生長下，小肽不斷被利用，并達到穩(wěn)定。
[0064] 如圖5a/b所示，可以明顯的看出肽段分布數(shù)包含8-13個氨基酸殘基的I區(qū)和包 含17-25個氨基酸殘基的II區(qū)兩個部分。在發(fā)酵前期，I區(qū)占主要部分，并且隨著發(fā)酵時間 的進行，I區(qū)峰值不斷升高，在發(fā)酵8h(5R)處達到最大值，隨后I區(qū)峰值降低，II區(qū)峰值不 斷升高。在II區(qū)大分子肽段的生成上，未熱激組含量較高，這個可能是因為在發(fā)酵過程中， 未熱激組中的牛乳蛋白在菌體胞外酶的作用下水解成大的肽段，熱激組能夠利用釋放的胞 內(nèi)酶對大肽段進一步水解，而未熱激組不能，從而導致這部分肽段相對熱激組有較高含量。
[0065] 6. 4對發(fā)酵過程中3B和5R組進行對比
[0066] 將未熱激組中3B組和熱激組中5R組的多肽個數(shù)與長度的關系置于圖6a中，它們 是各自組中9個左右氨基酸殘基數(shù)肽段含量較多的發(fā)酵時間段。5R組肽段含量整體高出 于3B組，尤其是9肽的含量上，5R組比3B要高出27. 78%。這表明，經(jīng)過熱激處理的瑞士 乳桿菌發(fā)酵牛乳時，所產(chǎn)生的多肽不管是數(shù)量還是種類都比未熱激組要高，這都是蛋白水 解酶系的作用，經(jīng)過了復雜的蛋白酶系的作用，生成了更多的小肽。
[0067] 在所鑒定出的相對分子質(zhì)量低于3kDa的多肽中，3B組含有924種多肽段，而5R組 含有1183種，高出28. 03%。兩組肽段經(jīng)過比對后發(fā)現(xiàn)，5R組有549種3B組不含有的特異 性多肽。
[0068] 在蛋白中的鑒定出的多肽覆蓋率上，與未熱激組相比，熱激組肽段在α_乳白蛋 白和β-乳球蛋白的覆蓋率從14%提高到18%，在酪蛋白上的覆蓋率從78%提高到99%， 尤其是對β -乳球蛋白，所識別的多肽中熱激組肽段覆蓋率比未熱激組提高了 87. 58 % (如 圖6b所示），這表明瑞士乳桿菌經(jīng)過熱激修飾后，在發(fā)酵過程中對β -乳球蛋白的水解特異 性增強了，這都將有助于α -乳白蛋白、β -乳球蛋白和酪蛋白作為牛乳過敏原的過敏性的 降低與消除。在幾種主要蛋白質(zhì)所生成的肽段數(shù)目上，熱激組5R組比未熱激組3Β中各蛋 白所生成的肽段數(shù)目高出21. 47% (如圖6c所示）。
[0069] 6. 5通過nanoLC-QE-MS/MS鑒定出的5R組中的特異性活性肽
[0070] 將5R組和3B組中所鑒定出的多肽與NCBI數(shù)據(jù)庫中做對比，我們發(fā)現(xiàn)了一批瑞士 乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的生物活性肽，其中，5R組和3B組共同含有的有16個多肽（表1)，由經(jīng)過 熱激修飾瑞士乳桿菌特異性產(chǎn)生的有3個（表2)。
[0071] 在5R組中所特有3個活性肽中，VRGPFPIIV來自于β-酪蛋白（圖7a)，具有抗高 血壓的特性；QKALNEINQF來自于a -S2酪蛋白（圖7b)，具有多種生物活性，比如ACE抑制 活性，PEP抑制活性，抗氧化活性等；和來自于β -酪蛋白的YQEPVLGPVRGPFPI (圖7c)，具有 抗囷活性。
[0072] 表1在5R組和3B組中同時出現(xiàn)的生物活性肽
[0074]
[0075] xThe peptide-spectrum matches
[0076] 2 單位：min
[0077] 表2在5R組中所特有的生物活性肽
[0078]
[0079] xThe peptide-spectrum matches
[0080] 2 單位：min
[0081] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種增強發(fā)酵乳中蛋白質(zhì)水解的方法，其特征在于，所述方法將經(jīng)過熱激修飾的瑞 士乳桿菌按3%~8% (v/v)的接種量接種于滅菌處理的8%~15% (m/v)的牛乳中，厭氧 培養(yǎng)得到發(fā)酵乳制品。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述瑞士乳桿菌的接種量為4%。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述厭氧培養(yǎng)的混合氣配比為N2: C02:H 2 = 90:5:5，v/v/v，純度為99. 99 %，培養(yǎng)溫度為30°C~45°C，培養(yǎng)時間為4h~16h。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法將經(jīng)過熱激修飾的瑞士乳桿菌 按4%的接種量接種于滅菌處理的12%的脫脂乳中，37°C厭氧培養(yǎng)8h，得到發(fā)酵乳制品。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述經(jīng)過熱激修飾的瑞士乳桿菌的制備 方法包括如下步驟： 1) 瑞士乳桿菌活化：將儲存在-80°C冰箱的菌株取出，以3%的接種量，采用MRS肉湯 培養(yǎng)基在37°C厭氧條件下培養(yǎng)24h~36h，活化3代至活力恢復； 2) 瑞士乳桿菌的培養(yǎng)：將活化完成的菌株按3%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，37°C 厭氧高密度培養(yǎng)48h ; 3) 瑞士乳桿菌熱激修飾前的準備：收獲的菌體采用pH7. 0的磷酸鹽緩沖液沖洗兩次， 然后重懸于PH7. 0的磷酸緩沖液，并調(diào)整菌體濃度為1012cfu/mL左右； 4) 瑞士乳桿菌的熱激：將準備的瑞士乳桿菌懸浮液在50°C~80°C條件下熱激處理 5s~30s，得到熱激修飾的瑞士乳桿菌，4°C存放備用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟4)中將準備的瑞士乳桿菌懸浮 液在67°C條件下熱激處理13s。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述MRS肉湯培養(yǎng)基的配方為：蛋白 胨10. 0g，牛肉粉10. 0g，酵母粉5. 0g，葡萄糖20. 0g，硫酸鎂0. lg，醋酸鈉5. 0g，檸檬酸銨 2. 0g，磷酸氫二鉀 2. 0g，硫酸錳 0. 05g，土溫 801. OmL，去離子水 1000mL，pH6. 2。8. 權(quán)利要求1~7任一項所述方法制備得到的發(fā)酵乳。
【文檔編號】C12R1/225GK106031388SQ201510117951
【公開日】2016年10月19日
【申請日】2015年3月17日
【發(fā)明人】陳歷俊, 張咚咚, 姜鐵民, 周偉明
【申請人】北京三元食品股份有限公司