專(zhuān)利名稱(chēng)：一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝。更具體地，本發(fā)明涉及一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基及方法。
背景技術(shù)：
蛋白酶是一類(lèi)可以催化蛋白質(zhì)水解反應(yīng)的酶，它廣泛存在于各種生物體中，不僅對(duì)生物體蛋白質(zhì)的新陳代謝起調(diào)節(jié)作用，從 細(xì)胞水平、器官水平和機(jī)體水平，呈現(xiàn)多種多樣的功能。它們參與細(xì)胞的正常生理以及異常的病理?xiàng)l件下的諸如蛋白質(zhì)水解、細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移、酶原激活、激素釋放等各種復(fù)雜的過(guò)程(汪章勛等，2005)。蛋白酶在食品、化工、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等許多方面發(fā)揮重要的作用，例如可用做生物農(nóng)藥的蟲(chóng)生真菌，其蛋白酶活力與其毒力密切相關(guān)(Paoletti，200)。扁座殼孢(Aschersonia placenta)是一類(lèi)重要的蟲(chóng)生真菌,隸屬于子囊菌門(mén)、糞菌綱、肉座菌目、麥角菌科、座殼孢屬，在對(duì)粉虱、介殼蟲(chóng)等一些刺吸式口器害蟲(chóng)的自然控制中發(fā)揮著重要作用，具有可持續(xù)大面積控制害蟲(chóng)，對(duì)環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)，是一種很有潛力的資源菌(邱君志等，2004)。國(guó)外也有許多國(guó)家在用扁座殼孢防治粉虱均取得上成功，如荷蘭、捷克斯洛伐克用芽生孢子通過(guò)液體發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行小規(guī)模試驗(yàn)生產(chǎn)，以防治白粉虱，也取得了成功(邱君志等，2005)。迄今為止，有些國(guó)家已經(jīng)開(kāi)發(fā)出粉虱扁座殼孢菌的制劑，并將其商業(yè)化，用于粉虱的防治(李增智等，1987)。扁座殼孢菌作為微生物農(nóng)藥具有對(duì)生態(tài)環(huán)境影響小、成本低、選擇性強(qiáng)、對(duì)人畜安全等特點(diǎn)，具有光明的前景(邱君志等，2004)，但是它還具有殺蟲(chóng)效果慢、受外界條件影響大等缺點(diǎn)，因此必須對(duì)其作用于害蟲(chóng)的機(jī)理進(jìn)行深入研究，進(jìn)而取得能克服上述兩個(gè)缺點(diǎn)的優(yōu)良菌株以應(yīng)用于生產(chǎn)運(yùn)用中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基及方法。本發(fā)明首先提供了一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基的原料含麩皮或者甘油lw%，酵母粉或者酵母膏I w %，Mn2+或者M(jìn)g2+4X10_4mol/L，培養(yǎng)基初始pH=7. 0_9· O ο更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基的原料按重量分?jǐn)?shù)計(jì)，含有1%果糖，1%酵母粉，4X 10_4mol/L Mg2+，pH 8· O。其次，本發(fā)明還提供了一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的方法，所述方法包含以下步驟
(a)將扁座殼孢接種種子培養(yǎng)基，制得發(fā)酵種子液；
(b)將步驟(a)中制得的發(fā)酵種子液按接種于所述的培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為150mL，接種量8mL，于26°C，轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)。所述種子培養(yǎng)基的原料含有按培養(yǎng)基重量計(jì)算，20% 土豆汁1L，葡萄糖20g，自然pH。本發(fā)明采用的座殼孢為扁座殼孢(何學(xué)友等，油茶黑膠粉虱及扁座殼孢對(duì)其自然控制作用，中國(guó)森林病蟲(chóng)，2011年7月)。采用本發(fā)明優(yōu)化后的培養(yǎng)基，菌齡5d，發(fā)酵周期10d，發(fā)酵產(chǎn)生結(jié)果扁座殼孢產(chǎn)蛋白酶為80U/mL以上。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的發(fā)酵方法有發(fā)酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基，具有蛋白酶產(chǎn)率高，蛋白酶活力高等優(yōu)點(diǎn)。


圖1不同濃度的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 圖2不同碳源對(duì)產(chǎn)蛋白酶的影響。圖3不同氮源對(duì)產(chǎn)蛋白酶的影響。圖4不同金屬離子對(duì)產(chǎn)蛋白酶的影響。圖5不同維生素對(duì)產(chǎn)蛋白酶的影響。圖6不同初始pH對(duì)產(chǎn)蛋白酶的影響。圖7不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)蛋白酶的影響。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明用下列實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于下列實(shí)施例。實(shí)施例1
單因素實(shí)驗(yàn)確定培養(yǎng)基最優(yōu)成分
(I)種子培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制
(a)20% 土豆汁1L，葡萄糖20g，自然pH。分裝于250mL的三角瓶，每個(gè)三角瓶含150mL。1. OlMPa，滅菌20min。使用前可加入抗生素對(duì)培養(yǎng)基預(yù)處理。(b)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，w/v) 0. 5%明膠、1. l%Na2HP04 · 12H20、1. 2%NaH2P04 · 2Η20、ρΗ6· 5。(2)發(fā)酵種子的制作將扁座殼孢接種于馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上，于27°C下培養(yǎng)5d，待其產(chǎn)孢子，即活化；將活化后的菌株用接種針將孢子粉接種至種子培養(yǎng)基，26°C，轉(zhuǎn)速160r/min下培養(yǎng)10d，即為發(fā)酵液。(3)酶液的制備取步驟(2)下的發(fā)酵液在4°C下，5000 r/min離心，15min，得上清液即為粗酶液待用。按酶活性測(cè)定在在波長(zhǎng)275nm處測(cè)定吸光值。換算成酶活單位U/
mLo(4)蛋白酶酶活測(cè)定取Iml酶液在60°C水浴5min，加入三氯乙酸搖勻，將其放入40°C水浴IOmin,再加酪素Iml靜置IOmin過(guò)濾,定容至IOml,作為對(duì)照。再取Iml酶液加酪素Iml在40°C水浴IOmin,加入三氯乙酸2ml搖勻靜置IOmin過(guò)濾,定容至IOml,在275nm波長(zhǎng)下測(cè)紫外吸光度。酶活力(U/g或U/mL) =AXKXVXn/(tXm) (A為樣品的吸光度；K為吸光常數(shù)為反應(yīng)試劑的總體積；n為酶液的稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時(shí)間；m為酶液質(zhì)量或體積，g或mL)。
(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作在0-10(^8/1^范圍內(nèi)，以27511111處的吸光值為橫坐標(biāo)(父)、酪氨酸的濃度為縱坐標(biāo)(Y)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。具體步驟如下
a.用超純水配置濃度為10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 μ g/mL的酪氨酸。b.測(cè)定反應(yīng)液在275nm處的吸光值，在上述反應(yīng)體系中以超純水取代酪氨酸為空白對(duì)照。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，其平均值用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。(6)不同碳源、氮源、金屬離子、pH、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)蛋白酶的影響
(a)碳源對(duì)酶產(chǎn)量的影響，在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中分別加入1%蛋白胨和1%供篩選碳源葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、麥麩、玉米粉。進(jìn)行接種搖瓶培養(yǎng)，于26°C，轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)，10d，取發(fā)酵液檢測(cè)酶活。以基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的蛋白酶活力作為對(duì)照，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選擇 對(duì)產(chǎn)酶最有利的碳源。結(jié)果見(jiàn)圖2。(b)氮源對(duì)酶產(chǎn)量的影響，在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中分別加入1%麩皮和1%的供篩選氮源硫酸銨、蛋白胨、氯化銨、酵母膏、明膠、牛肉浸膏、酵母浸粉、碳酸氫銨。進(jìn)行接種搖瓶培養(yǎng)，于26°C，轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)，10d，取發(fā)酵液檢測(cè)酶活。以基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的蛋白酶活力作為對(duì)照，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選擇對(duì)產(chǎn)酶最有利的氮源。結(jié)果見(jiàn)圖3。(C)金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響,在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中分別加入4X 10_4mol/l的供篩選 Ca2+、K+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+。進(jìn)行接種搖瓶培養(yǎng)，于 26°C，轉(zhuǎn)速 160 r/min 下培養(yǎng)，10d，取發(fā)酵液檢測(cè)酶活。以基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的蛋白酶活力作為對(duì)照，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選擇對(duì)產(chǎn)酶最有利的金屬離子。結(jié)果見(jiàn)圖4。(d)維生素對(duì)酶產(chǎn)量的影響，在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中分別加入O. 01%的供篩選的維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素E和維生素C。進(jìn)行接種搖瓶培養(yǎng)，于26°C，轉(zhuǎn)速160r/min下培養(yǎng)，10d，取發(fā)酵液檢測(cè)酶活。以基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的蛋白酶活力作為對(duì)照，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選擇對(duì)產(chǎn)酶最有利的維生素。結(jié)果見(jiàn)圖5。(e)pH對(duì)酶產(chǎn)量的影響，把基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的pH分別用用O. lmol/L NaOH或HCl調(diào)至5、6、7、8、9，0進(jìn)行接種搖瓶培養(yǎng)，于26°C，轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)，10d，取發(fā)酵液檢測(cè)酶活。以基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的蛋白酶活力作為對(duì)照，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選擇對(duì)產(chǎn)酶最有利的初始pH值。結(jié)果見(jiàn)圖6。(f)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響，將扁座殼孢菌絲接到基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行接種搖瓶培養(yǎng)，每天測(cè)一次發(fā)酵液中蛋白酶酶活至蛋白酶酶活連續(xù)兩天出現(xiàn)下降為止，以確定最佳的發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間。結(jié)果見(jiàn)圖7。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
從圖2可知，加入各種不同碳源的培養(yǎng)基均有助于扁座殼孢產(chǎn)蛋白酶，其中麥麩最利于產(chǎn)酶，其次是甘油，加入麥芽糖和葡萄糖對(duì)產(chǎn)酶的提高作用不明顯。由圖3可見(jiàn)，在培養(yǎng)基中加入不同的氮源對(duì)該菌產(chǎn)蛋白酶影響較大。有機(jī)氮都可以促進(jìn)產(chǎn)酶，其中酵母膏的作用最強(qiáng)，其次是酵母粉和蛋白胨；然而，無(wú)機(jī)氮對(duì)該菌產(chǎn)酶有不同程度的抑制作用，其中硫酸銨的抑制作用最明顯。從圖4可以看出只有加入Mg2+的培養(yǎng)基有利于蛋白酶的活性增強(qiáng)，其余金屬離子均在不同程度上抑制該菌產(chǎn)生蛋白酶，其中Zn2+的抑制作用最大。從圖5可以看出，加入VB1、VB2、VB6、VE和^這5種不同維生素的培養(yǎng)基都不利于扁座殼孢產(chǎn)蛋白酶。其中，VB6對(duì)該菌產(chǎn)酶的抑制作用最強(qiáng)。
從圖6可以看出，不同的初始pH對(duì)產(chǎn)酶存在不同程度的影響。當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH為8. O時(shí)，該菌所產(chǎn)的蛋白酶活性最高，pH為9. O時(shí)酶活急劇下降，因此該酶可能是堿性的。從圖7可以看出，在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上，結(jié)果表明扁座殼孢培養(yǎng)5d后，有一定的酶活力；在5-9d內(nèi)酶活力緩慢升高，而在flOd是迅速升高，并且在培養(yǎng)至第IOd時(shí)酶的活力最高；此后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶的活力開(kāi)始緩慢下降。隨著時(shí)間的變化，其酶活力的變化如圖7所示。實(shí)施例2 正交實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)發(fā)酵條件 (O正交實(shí)驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)基
根據(jù)以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇蛋白酶活最高的兩個(gè)碳源因素(麩皮和甘油)，選擇蛋白酶活最高的兩個(gè)氮源因素(酵母浸粉和酵母膏)以及兩個(gè)蛋白酶活最高的金屬離子(Mg2+和Mn2+)選擇正交進(jìn)行正交試驗(yàn)。以酶活力高低作為指標(biāo)，通過(guò)正交設(shè)計(jì)確定最佳碳源、氮源和金屬離子。為了避免累贅實(shí)施例中的培養(yǎng)基配法、粗酶液的制作、酶活測(cè)定方法均與實(shí)施例I的方法相同。表I扁座殼孢蛋白酶四因子二水平(24)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
水平1-源aMii B金■離子C I
1I 曾油鮮母浸粉
2I S酵母膏I
表2扁座殼孢蛋白酶四因子二水平(24)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
--]-1--1--τ---)
辤旮；ABCSlSAiUinL I|
1III53'54;1ΠI
2I2213,10:121|
52I261.99=5.17|
422I56.38r4.09|
.................................................................................................................................................................................................-·...............................................................-.........................................................................................................................................................................-4
Kl 199.92 346.59 329.76|
-------------Better factors and level shown I
K2 355.11 20S..14 225.2^|
----as follows; A2. BLCl I
R 155.19 138,15 104.49|
注Kl為各因素水平I的所有酶活力之和，K2為各因素水平2的所有酶活力之和，K3為各因素水平3的所有酶活力之和，K4為各因素水平4的所有酶活力之和，R為極差，酶活力的數(shù)字代表3次重復(fù)的平均值(mean) 土標(biāo)準(zhǔn)差(S. D)。由表I和表2可知，3個(gè)培養(yǎng)基條件(碳源、氮源和金屬離子)對(duì)扁座殼孢蛋白酶的產(chǎn)生具有不同程度的影響。表2中的R值表明碳源(155. 19)是一個(gè)比其他培養(yǎng)基條件更重要的因素，其次是氮源(138. 15)，對(duì)產(chǎn)酶影響最小的培養(yǎng)基因素是金屬離子(104.49)。正交分析表明最適合該酶產(chǎn)生的培養(yǎng)基條件為A2, B1, C1 (碳源為麩皮，氮源為酵母粉，金屬離子為Mg2+)。(2)正交實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)培養(yǎng)條件
分別選擇三個(gè)蛋白酶活最高的菌齡、接種量、培養(yǎng)時(shí)間和通氣量，并對(duì)其選擇正交進(jìn)行正交試驗(yàn)。以酶活力高低作為指標(biāo)，通過(guò)正交設(shè)計(jì)確定最優(yōu)的菌齡、接種量、培養(yǎng)時(shí)間和通氣量。為了避免累贅實(shí)施例中的培養(yǎng)基配法、粗酶液的制作、酶活測(cè)定方法均與實(shí)施例1的方法相同。表3扁座殼孢蛋白酶四因子三水平(34)正交實(shí)驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的原料含有麩皮或者甘油lwt%，酵母粉或者酵母膏I wt%，Mn2+或者M(jìn)g2+4X 10_4mOl/L，培養(yǎng)基初始pH=7. 0_9· O ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的原料按重量分?jǐn)?shù)計(jì)，含有1%果糖，1%酵母粉，4Χ 10_4mol/L Mg2+，pH 8. O。
3.一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步驟 Ca)將扁座殼孢接種種子培養(yǎng)基，制得發(fā)酵種子液； (b)將步驟(a)中制得的發(fā)酵種子液按接種于權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為150mL，接種量8mL，于26°C，轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基的原料含有按培養(yǎng)基重量算，20% 土豆汁1L，葡萄糖20g，自然pH。
全文摘要
本發(fā)明涉及真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝。更具體地，本發(fā)明涉及一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基及方法。所述培養(yǎng)基的原料含有麩皮1wt%，酵母粉1wt%，Mg2+4×10-4mol/L，培養(yǎng)基初始pH=7.0-9.0。該方法通過(guò)將發(fā)酵種子液按接種于培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為150mL，接種量8mL，于26℃，轉(zhuǎn)速160r/min下培養(yǎng)。本發(fā)明的發(fā)酵方法有發(fā)酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基，具有蛋白酶產(chǎn)率高，蛋白酶活力高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/58GK103013962SQ201210543640
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者邱君志, 蘇禮超, 李小霞, 涂潔, 宋飛飛, 邱云鋒, 郭慶豐, 何肖云, 毛麗慧, 張偉 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)