專利名稱：超氧物歧化酶衍生物及其生產(chǎn)方法和在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及超氧物歧化酶衍生物及其生產(chǎn)方法和該衍生物在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用以及含有該衍生物的口服復(fù)方組合物。
眾所周知超氧物歧化酶(為簡(jiǎn)明起見下文用“SOD”表示)普遍存在于動(dòng)物、植物和微生物的生物組織中，它是一種酶，能分解對(duì)活機(jī)體有害的過氧化物。最近，有人嘗試應(yīng)用分離出來的SOD作為抗炎劑(FARUMASHIA，17，411，1981;CurrentTherapeuticResearch，16，706，1974)。
人們也知道當(dāng)靜脈注射SOD時(shí)，其血漿半壽期只有4-6分鐘，所注射的SOD迅速排泄。為延長(zhǎng)SOD血漿半壽期，試圖用Ficoll，聚乙二醇，大鼠白蛋白或菊粉〔JapanesePublishedUnexaminedPatentapplication(KokaiTokkyoKoho)NO.32826/83〕修飾SOD。
據(jù)報(bào)導(dǎo)，經(jīng)Ficoll或聚乙二醇修飾的SOD的活性比未經(jīng)修飾的SOD大幅度降低，而大鼠白蛋白修飾的SOD是抗原性的。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)菊粉修飾的SOD酶催活性次于SOD。
本發(fā)明目的是提供一種新穎的超氧物歧化酶衍生物，這種衍生物與SOD相比，血漿半壽期延長(zhǎng)，而又保持SOD原有的酶催活性。
本發(fā)明另一目的是提供一種新穎的超氧物歧化酶衍生物，它有抗炎等藥理作用，而且用藥安全。
本發(fā)明又一目的是提供上述超氧物歧化酶衍生物的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明再一目的是將上述超氧物歧化酶衍生物提供醫(yī)學(xué)上應(yīng)用，例如用作抗炎藥物。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供適宜于口服給藥的上述超氧物歧化酶衍生物的復(fù)方組合物。
從以下詳細(xì)敘述中，這些目的和其他目的以及本發(fā)明所具優(yōu)點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得更明顯。
本發(fā)明提供一種具通式〔SOD〕〔Z〕n的超氧物歧化酶衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽。其中〔SOD〕代表帶有1-22或24個(gè)各自衍生自氨基的基團(tuán)(即從氨基上除去一個(gè)氫原子所剩的一價(jià)基團(tuán))的超氧物歧化酶;〔Z〕代表單價(jià)共聚物基團(tuán)，其組成單元是有如下通式的基團(tuán)
其中R1、R2、R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個(gè)碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個(gè)碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚或者含有1-4個(gè)碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以及R3或R4中各有一個(gè)代表氫原子，上述共聚物組成單元還包括衍生自上述通式的基團(tuán)，即通過從COOR1，COOR2，COOR3及COOR4基團(tuán)的其中一個(gè)除去OR1，OR2，OR3或OR4衍生的殘基(那里的羰基碳原子的鍵連接〔SOD〕)，上述單價(jià)共聚物基團(tuán)平均分子量為500-200，000;n代表1-22或24的整數(shù)，相應(yīng)于上述一價(jià)基團(tuán)的數(shù)目，這些基團(tuán)各衍生自氨基，即在上述〔SOD〕中的氨基上除去一個(gè)氫原子。
本發(fā)明進(jìn)一步提供生產(chǎn)上述超氧物歧化酶衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽的方法，包括超氧物歧化酶和共聚物進(jìn)行反應(yīng)，其組成單元是(a)具有如下通式的基團(tuán)
其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個(gè)碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個(gè)碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚或者含有1-4個(gè)碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以及R3或R4中各有一個(gè)代表氫原子，(b)選自以下類別如下通式的基團(tuán)
其中R1和R2分別如上所規(guī)定;
如下通式的基團(tuán)
其中R3和R4分別如上所規(guī)定;以及如下通式的基團(tuán)
在pH7～11的堿性水溶液存在下，該共聚物具有平均分子量500～200，000(為簡(jiǎn)明起見，下文用“共聚物”)。
本發(fā)明另一方面提供了含上述SOD衍生物或其鹽作為活性成份的藥物復(fù)方組合物，例如抗炎劑;以及治療炎癥和其他疾病的方法，也包括所給予的上述SOD衍生物及其鹽的有效量。
再一方面，本發(fā)明提供含上述SOD衍生物或其鹽類的口服藥物復(fù)方組合物，以及中級(jí)/高級(jí)脂肪酸甘油酯，及其含上述SOD衍生物或其鹽的口服藥物復(fù)方組合物;還有中級(jí)/高級(jí)脂肪酸甘油酯以及兩親試劑和/或低級(jí)鏈烷醇。


圖1顯示SOD衍生物及SOD對(duì)流感病毒感染小鼠的效應(yīng)。
圖2為SOD衍生物(用合成例1制備)的紫外吸收光譜。
圖3為SOD衍生物(用合成例2制備)的紅外吸收光譜。
圖4(ⅰ)為光密度譜，用原料SOD(合成例2中所用)的聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定。
圖4(ⅱ)為光密度譜，用SOD衍生物(從合成例2制備)的聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定。
(a)SOD衍生物的生產(chǎn)方法。
(a-1)SOD和共聚物的反應(yīng)。
SOD和共聚物的反應(yīng)通常是將SOD溶于一些鹽的水溶液中進(jìn)行，例如碳酸鈉、碳酸氫鈉、醋酸鈉、磷酸鈉等，再將共聚物加到生成的溶液中去，可以粉料形式加入或?qū)⑵淙苡谟袡C(jī)溶劑(如二甲亞砜)后加入。在反應(yīng)進(jìn)行時(shí)有必要使溶液維持pH7-11。若pH值小于7，共聚物的溶解度減小，從而干擾反應(yīng)進(jìn)程。若pH值大于11，則SOD被鈍化，以致得不到有效的SOD衍生物。反應(yīng)溫度最好在3～50℃，在4-40℃范圍內(nèi)更好。然而，反應(yīng)時(shí)間得取決于反應(yīng)溫度以及共聚物加料的方法，通常在10分鐘至3小時(shí)范圍內(nèi)。共聚物的投料大約按0.5-30摩爾對(duì)1摩爾SOD的比率。通過改變這一比率，連接到SOD結(jié)構(gòu)上的共聚物分子數(shù)目能被調(diào)節(jié)。
反應(yīng)生成的混合物中不僅含SOD衍生物，而且含有未反應(yīng)的SOD和共聚物等。因此，得將反應(yīng)混合物過濾，使濾液經(jīng)過凝膠過濾。所得含有SOD衍生物的濾液，如有必要，使之進(jìn)行疏水層析并超濾。所得濃縮液經(jīng)冷凍干燥，得SOD衍生物的固態(tài)產(chǎn)物。
作為上述反應(yīng)的結(jié)果，SOD的氨基與共聚物的馬來酐部分結(jié)合，產(chǎn)生SOD衍生物。例如人型SOD每個(gè)分子含22(人紅細(xì)胞SOD或產(chǎn)自酵母經(jīng)基因工程設(shè)計(jì)的人型SOD)-24個(gè)(產(chǎn)自大腸桿菌經(jīng)基因工程設(shè)計(jì)的人型SOD)氨基。在上述反應(yīng)中，SOD的其中某一個(gè)氨基和共聚物的其中一個(gè)馬來酐部分反應(yīng)，最終產(chǎn)生每個(gè)SOD分子含1-22或24個(gè)共聚物分子的SOD衍生物。原料共聚物通常含馬來酐環(huán)(見后面所述)。當(dāng)這些馬來酐環(huán)中其中一個(gè)與SOD的氨基結(jié)合后，其余馬來酐環(huán)明顯地不和其他氨基反應(yīng)，但傾向與水反應(yīng)，產(chǎn)生具通式
的馬來酸衍生基團(tuán)。有可能一個(gè)分子的共聚物與為數(shù)眾多的SOD分子反應(yīng)，生成副產(chǎn)品的化合物，其中共聚物分子中的多數(shù)馬來酐環(huán)與各個(gè)SOD分子中的氨基相結(jié)合，但在本發(fā)明實(shí)踐中，使用包含少部分副產(chǎn)物的SOD衍生物并不使人感到討厭。然而，考慮到如下事實(shí)，即藥物產(chǎn)品的任何活性成分希望它是具有單一的化學(xué)結(jié)構(gòu)，最好用合適的方法，如凝膠過濾，將含副產(chǎn)物多的SOD衍生物進(jìn)行純化，以便除去副產(chǎn)物。進(jìn)一步應(yīng)搞清楚，通過上述反應(yīng)得到的SOD衍生物確實(shí)是含有不同數(shù)目共聚物分子的不同化合物的混合物，就是對(duì)各個(gè)SOD衍生物來說，與SOD結(jié)合的共聚物分子數(shù)目不是均勻的。所以，在上述代表SOD衍生物的通式中，n意味著與一個(gè)分子SOD結(jié)合的共聚物分子的平均數(shù)目。然而，當(dāng)需要獲得與之結(jié)合的共聚物分子數(shù)目是均勻的SOD衍生物時(shí)，按上述方法制得的SOD衍生物可使之進(jìn)一步作合適的分級(jí)純化處理，例如凝膠過濾，從而得到所需的SOD衍生物。
(a-2)原料SOD用作原料的SOD可用常規(guī)方法從動(dòng)物(人、牛)植物和微生物的活組織中提取出來，或者通過基因工程制得。如今，SOD的化學(xué)結(jié)構(gòu)已被非常充分地闡明(配位金屬，分子量，氨基酸排列順序等)。因此，SOD已被分為三大主要類型，鐵配位SOD，錳配位SOD和銅鋅配位SOD，取決于它們所存在的生物組織，SOD的分子量范圍為30，000-80，000。SOD的氨基酸順序也或多或少隨其所存在的生物組織不同而變化，有關(guān)這一課題的詳細(xì)報(bào)道可以從下列文獻(xiàn)中獲得YoshihikoOyanagiSuperoxideandMedicine，74-90(KyoritsuShuppan，May25，1981);JournalofBiologicalChemistry，246，2875-2880(1971);and250，6107-6112(1975);ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences，70，3725-3729(1973);ArchivesofBiochemistryandBiophysics，179，243-256(1977)等等。原料SOD最好是人型銅鋅配位SOD。牛型和馬型銅鋅配位SOD也適宜于本發(fā)明目的。這種類型SOD的分子量大約33，000，在其分子中含20、22或24個(gè)氨基。例如，人型SOD可以通過將人血作加熱處理，離子交換及連續(xù)性凝膠過濾或基因工程方法分離出來。
(a-3)原料共聚物共聚物作為另一種原料，能通過使二乙烯基醚-馬來酐共聚物部分水解(馬來酐環(huán)水解度30～90%)，或者使該共聚物進(jìn)行部分酯化即半酯化(馬來酐環(huán)半酯化度30～90%)而獲得。作為酯的實(shí)例，可提到的有甲酯、乙酯、丙酯、正-丁酯、正-戊酯、異-戊酯、正-己酯、正-庚酯、正-辛酯、甲氧基乙酯、乙氧基乙酯、丙氧基乙酯、2-丁氧基乙酯、1，3-二甲氧基-2-丙酯、2，3-二甲氧基-1-丙酯、1，3-二乙氧基-2-丙酯、2-乙氧基-3-甲氧基-1-丙酯、1，3-二丙氧基-2-丙酯、1，3-二丁氧基-2-丙酯、芐酯等等。
正如上述，原料共聚物的平均分子量為500～200，000。鑒于最終SOD衍生物進(jìn)入生物體內(nèi)有影響部位的轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)，共聚物的重均分子量最好不超過10，000。共聚物的分子量分布并無特別限制。因此，共聚物(其重均分子量與數(shù)均分子量之比大約為2或更高些)可通過二乙烯基醚和馬來酐的自由基共聚，再直接使其部分水解或部分酯解，而無需作之前或之后的分級(jí)，以使分子量分布的范圍變窄，這樣的共聚物可成功地用作原料。
(b)SOD衍生物的藥物學(xué)上可接受的鹽，及其鹽的制備方法。
作為上述藥物學(xué)上可接受的SOD衍生物鹽的實(shí)例，可提到的有SOD衍生物的堿金屬鹽，如鈉、鉀等;堿土金屬鹽，如鎂、鈣、鋇等;銨鹽及有機(jī)叔胺的鹽，如吡啶、三乙胺、三正丁胺等。
藥物學(xué)上可接受的SOD衍生物鹽能從SOD衍生物容易地制得，并且能按所需堿的種類，通過常規(guī)的成鹽反應(yīng)制備。
(c)口服復(fù)方組合物中級(jí)/高級(jí)脂肪酸甘油酯可用于制備口服復(fù)方組合物，按本發(fā)明應(yīng)用具有6～20個(gè)碳原子的飽和或不飽和脂肪酸的單、二和三甘油酯。這些脂肪酸甘油酯的代表性例子包括辛酸、癸酸、十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、油酸、亞油酸、亞麻酸或其類似酸的單、二和三甘油酯。這些脂肪酸甘油酯能單獨(dú)使用或混合使用。
脂肪酸甘油酯可以是天然存在的化合物，或是合成或半合成化合物。通常應(yīng)用天然植物油較為方便。在本發(fā)明實(shí)踐中應(yīng)用植物油具有優(yōu)點(diǎn)，尤其包括橄欖油(油酸70-80%，亞油酸4-12%，十六烷酸7-15%)，玉米油(亞油酸40～60%，十六烷酸25～45%)，芝麻油(油酸35～46%，亞油酸35～48%)，山茶油，花生油(十二烷酸45～52%，癸酸4～12%，辛酸6～10%)和棕櫚油。商業(yè)級(jí)產(chǎn)品本身就能應(yīng)用。因此，作為商品可買到的中級(jí)脂肪酸三甘油酯的例子，可提到的有Panasate 875，810和800(日本油脂有限公司;辛酸含量10～100%)，ODD (Nissin Seiyu K.K.;辛酸含量67%)等。作為商品的中級(jí)脂肪酸單甘油酯的實(shí)例，可提到的有Homoteks PT(Kao公司;癸酸含量60%)。作為中級(jí)脂肪酸單和二甘油酯混合物的實(shí)例，可提到的有Witafrol (Dinamit Novel公司)。至于高級(jí)脂肪酸三甘油酯，能用像橄欖油那樣的食用商品油(Wako純化學(xué)工業(yè)有限公司)以及亞油酸(日本油脂有限公司)。
上面敘述過的兩親試劑是具有親水性和親油性的無毒試劑。這種兩親試劑的典型例子包括天然的兩性表面活性劑，脂肪酸聚甘油酯，聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(吐溫(Tween)系列)，脫水山梨糖醇脂肪酸酯(山梨糖醇酯類(Span)系列)以及聚乙二醇。優(yōu)選的兩親表面活性劑是大豆磷脂，蛋黃卵磷酯及其有關(guān)物質(zhì)，例如磷脂酰膽堿，蛋黃卵磷酯，大豆磷脂，磷脂酰乙醇胺等商品，可從日本油脂有限公司購(gòu)得。聚甘油脂肪酸酯可以是Unigli (日本油脂有限公司)。作為聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的實(shí)例，可提到的有吐溫20(Wako純化學(xué)工業(yè)有限公司)。山梨糖醇脂肪酸酯可以是Span 20(Wako純化學(xué)工業(yè)有限公司)，而聚乙二醇可以是PEG 6000。除上述而外，陰離子表面活性劑，如月桂基硫酸鈉以及陽離子表面活性劑，如氯化芐烷銨，氯化芐乙氧銨，Eison (美國(guó)納爾遜研究開發(fā)(NelsonResearchanolDevelopmentCo.)公司)等也可供應(yīng)用。
上述鏈烷醇可以是乙醇，丙醇，異丙醇，丁醇或其類似物。
按照本發(fā)明生產(chǎn)復(fù)方組合物的方法，將SOD衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽(在下文內(nèi)一并歸入SOD衍生物)的水溶液調(diào)節(jié)到合適的pH值，制成冷凍干燥物，均勻地分散到上述脂肪酸甘油酯中，后者含或不含上述兩親試劑和/或低級(jí)鏈烷醇;或者采用下法，將SOD衍生物的碳酸銨水溶液和上述兩親試劑的水溶液和/或低級(jí)鏈烷醇的混合物，進(jìn)行真空冷凍干燥，然后將冷凍干燥物均勻地分散到中級(jí)/高級(jí)脂肪酸甘油酯中。
上述脂肪酸甘油酯的比例大約為每mgSOD衍生物0.1-100ml，最好約為0.5-5ml(在同一基礎(chǔ)上)。添加上述兩親試劑和/或低級(jí)鏈烷醇是隨意的，但這些試劑有助于提高與油的可濕性以及增加分散度或溶解度。以便得到一個(gè)穩(wěn)定的，具有額外效果的復(fù)方組合物，在口服之后能提高機(jī)體對(duì)藥物的吸收。添加上述兩親試劑恰當(dāng)?shù)牧?，隨其品種不同而變化。在通常情況下，相對(duì)于1mgSOD衍生物，取0.01-0.1ml液態(tài)兩親試劑或0.05-5mg固態(tài)兩親試劑為宜。上述低級(jí)鏈烷醇的添加量約為1-15%(重量百分?jǐn)?shù))，以復(fù)方組合物的總重量為基礎(chǔ)。添加這種低級(jí)鏈烷醇導(dǎo)致改善溶液的均勻性。
按本發(fā)明的復(fù)方組合物是一種物理和化學(xué)穩(wěn)定的澄清液。因此，將此復(fù)方組合物在室溫下以5000rpm的速度離心15分鐘，或者在37℃下放置一個(gè)月，無沉淀出現(xiàn)。而且，在4℃或室溫下于暗處貯存，至少在3個(gè)月內(nèi)，不出現(xiàn)肉眼可見的變化。此外，即使將復(fù)方組合物置于4℃至室溫下，以24小時(shí)為間隔，作10個(gè)循環(huán)的溫度變化實(shí)驗(yàn)之后，其效價(jià)仍維持不變。
(d)SOD衍生物的藥理學(xué)簡(jiǎn)介按本發(fā)明的SOD衍生物表現(xiàn)出的特色為與SOD相比，顯著地延長(zhǎng)血漿半壽期，仍保留SOD的酶催活性，實(shí)質(zhì)上原封不動(dòng)，并且毒性低。所以，本發(fā)明的SOD衍生物具有抗炎劑和缺血疾病的治療劑的價(jià)值。
以下動(dòng)物試驗(yàn)具體說明了本發(fā)明的SOD衍生物及其復(fù)方組合物的效果。
(Ⅰ)抗炎癥和抗病毒試驗(yàn)(1)對(duì)流感病毒感染小鼠肺實(shí)變(炎癥性硬化)的效果方法ddY小鼠，年齡5-6周，體重約22g。使小鼠吸入100倍LD50劑量的流感病毒〔A2/Kumamoto(H2N2)〕氣溶膠感染，然后按預(yù)定劑量口服被測(cè)藥劑，每天一次，連續(xù)6天(從感染那天起)，所用小鼠分為30組。感染后3、4和5天間小鼠連續(xù)死亡，肺實(shí)變?cè)u(píng)分通過Horsfall方法(Journal of Experimental Medicine 95，135-145，1952)。
結(jié)果如表1所示，表內(nèi)實(shí)變?cè)u(píng)分的方法如下。將生理鹽水直接注射入小鼠心臟內(nèi)，徹底洗滌肺，然后進(jìn)行觀察，用下列評(píng)分等級(jí)評(píng)價(jià)損傷程度。
(2)對(duì)病毒感染小鼠的效果方法ddY小鼠，年齡5-6周，體重約22g，使小鼠吸入2倍LD50劑量的流感病毒〔A2/Kumamoto(H2N2)〕氣溶膠感染。然后將合成實(shí)例1的SOD衍生物(2000單位/mg)或牛紅細(xì)胞SOD(2000單位/mg)在感染后第5天靜脈注射給藥，劑量為200單位/每一只鼠，每天1次，連續(xù)4天。
圖1顯示存活百分?jǐn)?shù)對(duì)感染后的天數(shù)作圖，在SOD衍生物組存活百分?jǐn)?shù)為95%，在SOD組及對(duì)照組(感染后未經(jīng)治療的小鼠)為0%。進(jìn)一步試驗(yàn)時(shí)，在上述同一方式下，給SOD劑量為2000單位/每一只鼠，僅僅觀察到輕微的效應(yīng)。
從結(jié)果看來很明顯，SOD衍生物對(duì)流感病毒感染的小鼠有卓越的效果。
(3)對(duì)燒傷部分白蛋白漏出的效果方法將伊文思藍(lán)溶于生理鹽水，終濃度為0.2%(重量百分?jǐn)?shù))，取出0.18ml(10mg/kg)該溶液，經(jīng)靜脈注射給予ddY小鼠(年齡8-10周，體重約30g)。小鼠分為10組。給上述溶液以后，用在70℃水浴上預(yù)熱過的鐵釘頭端(直徑12mm)緊壓小鼠腹部，造成燒傷，立即口服被測(cè)藥劑。服藥后2小時(shí)殺死小鼠，切割燒傷部位的皮膚，在60℃甲酰胺中浸泡48小時(shí)，經(jīng)提取的伊文思藍(lán)濃液，在波長(zhǎng)620nm下測(cè)定吸光度。從數(shù)據(jù)估算出伊文思藍(lán)-白蛋白絡(luò)合物的濃度，計(jì)算被測(cè)藥劑對(duì)燒傷部位白蛋白漏出的抑制百分?jǐn)?shù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2所示
表2
＊水溶液＊＊油狀復(fù)方組合物重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，只是在給藥以后6小時(shí)殺死小鼠。在上述同一方式下，測(cè)定伊文思藍(lán)-白蛋白絡(luò)合物濃度。在ODO 組內(nèi)，燒傷部位白蛋白漏出的抑制百分?jǐn)?shù)為0%;SOD衍生物(由合成實(shí)例1)組為50%;SOD復(fù)方組合物(由配方實(shí)例6)組為56.5%。
用按合成實(shí)例2所得SOD衍生物作實(shí)驗(yàn)，得到同樣結(jié)果。
從上述結(jié)果看來很明顯，SOD衍生物和本發(fā)明的復(fù)方組合物與對(duì)照組相比，抑制燒傷部位白蛋白漏出是有效的。
(Ⅱ)口服SOD衍生物復(fù)方組合物之后血液轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)血藥(SOD衍生物)濃度通過放射性測(cè)試來測(cè)定，實(shí)驗(yàn)方法步驟和結(jié)果如下(1)14C甘氨酸標(biāo)記SOD衍生物的制備將17.7mgSOD衍生物(按合成實(shí)例1)溶于1.5ml蒸餾水，接著加入18.2mg水溶性碳化二亞胺。5分鐘后加入0.13mg(0.5ml水溶液)14C甘氨酸(New England Nuclear，U.S.A.產(chǎn)品;113.0mci/mmol)。用1M碳酸氫鈉水溶液調(diào)節(jié)混合物的pH值至大約為6。在暗處室溫下，緩慢攪拌1小時(shí)，促使反應(yīng)進(jìn)行。然后加入1.0ml 1M醋酸鹽緩沖液(pH 6.0)，以便終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物用Sephaex C25柱(2.3×10cm;Pharmacia F.C.)脫鹽，并進(jìn)行冷凍干燥，得15.5mg14C甘氨酸標(biāo)記SOD衍生物，比放射性10.7μci/mg。該產(chǎn)品基本上是均勻的，每個(gè)SOD衍生物分子主要含一個(gè)甘氨酸單位。該產(chǎn)物是穩(wěn)定的化合物，其中的甘氨酸通過酰胺鍵已被結(jié)合到SOD衍生物的羧基上。
(2)動(dòng)物口服實(shí)驗(yàn)應(yīng)用14C甘氨酸標(biāo)記SOD衍生物，按照下文所描述的配方實(shí)例2的方法制備復(fù)方組合物，并應(yīng)用胃管給予雄性ddY小鼠(年齡8周)口服0.2ml(4.26μci)復(fù)方組合物。依次在服藥后3，7和24小時(shí)殺死小鼠，測(cè)定血漿及主要器官中放射性水平。放射性以每1.0g組織含dpm單位表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。
表3口服后不同時(shí)間過程中組織內(nèi)14C甘氨酸標(biāo)記SOD組織衍生物的濃度3小時(shí)后7小時(shí)后24小時(shí)后血漿930479129908肝320485022490027腎120542846562873脾59121039222644肌肉2490345212200
表3內(nèi)數(shù)據(jù)顯示含SOD衍生物(從合成實(shí)例1制得)的復(fù)方組合物有效地轉(zhuǎn)運(yùn)到血和不同器官和組織中去。含有得自合成實(shí)例2的SOD衍生物相似復(fù)方組合物，也可得到同一結(jié)果。
因此，當(dāng)將本發(fā)明的SOD衍生物配入本發(fā)明的復(fù)方組合物中并口服時(shí)，產(chǎn)生特別顯著的抗炎效果。
為使上述復(fù)方組合物供人臨床應(yīng)用，可將該復(fù)方組合物進(jìn)一步加工成為合適的劑型供病人服用，例如軟膠囊劑，膠囊劑，片劑，顆粒劑，液劑和栓劑等。
這些制劑的服用劑量通常為0.1-100mg(按SOD衍生物計(jì))，每天1-5次，每天或隔天服用。劑量可按病人的狀況和其他因素加以調(diào)節(jié)。
(e)實(shí)例以下合成實(shí)例和配方實(shí)例是本發(fā)明進(jìn)一步具體說明。然而不言而喻，本發(fā)明決非限于這些特殊的實(shí)例。
合成實(shí)例1將95mg牛紅細(xì)胞SOD(Sigma)在4℃攪拌下，加入10ml 0.1M碳酸氫鈉水溶液中(pH8.0)。向此溶液中逐漸加入17mg固態(tài)粉末狀的二乙烯基醚-馬來酐共聚物的部分水解產(chǎn)物(水解度大約等于50%;二乙烯基醚對(duì)馬來酐的摩爾比率＝1∶2，Mw＝5600，分子量分布Mw/Mn＝1.5，Mw＝重均分子量，Mn＝數(shù)均分子量)。反應(yīng)進(jìn)行約1.0小時(shí)。將反應(yīng)混合物倒入Sephadex
G50柱子(4.2×80cm;Pharmacia F.C.)，進(jìn)行凝膠過濾，用蒸餾水進(jìn)行洗脫，洗脫液用測(cè)定吸光度方法(波長(zhǎng)280和220nm)加以監(jiān)視，將含有未反應(yīng)的二乙烯基醚-馬來酐共聚物的部分水解產(chǎn)物的級(jí)分棄去，剩下級(jí)分進(jìn)行冷凍干燥，生成色粉末狀SOD衍生物。
所得SOD衍生物的紫外吸收光譜，在磷酸鹽緩沖液中測(cè)定，于濃度為1mg/ml，pH7.4時(shí)進(jìn)行。該產(chǎn)物紫外吸收光譜如圖2所示。
上面所用的牛紅細(xì)胞SOD的每個(gè)分子含有20個(gè)氨基基團(tuán)。為確證這些氨基已經(jīng)和二乙烯基醚-馬來酐共聚物的部分水解產(chǎn)物進(jìn)行反應(yīng)，可應(yīng)用三硝基苯磺酸鈉(TNBS)測(cè)定殘留氨基。在上述反應(yīng)條件下，發(fā)現(xiàn)大約有22%(摩爾)的牛紅細(xì)胞SOD的氨基已經(jīng)起反應(yīng)，使平均有4-5個(gè)二乙烯基-馬來酐共聚物的部分水解產(chǎn)物結(jié)合到每一個(gè)SOD分子上。
當(dāng)應(yīng)用焦棓酚自動(dòng)氧化法(見EuropeanJournalofBiochemistry47，469-474，1974敘述)測(cè)定SOD衍生物酶催活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)SOD衍生物保留了原SOD的45%酶催活性。
合成實(shí)例2(a)部分半酯化二乙烯基醚-馬來酐共聚物的合成在體積約為100ml的安瓿(用作封管)內(nèi)配以磁性攪拌，加進(jìn)2.0g二乙烯基醚-馬來酐共聚物(二乙烯基醚對(duì)馬來酐的摩爾比＝1∶2，Mw＝5600，分子量分布Mw/Mn＝1.5)，0.88g正丁醇，40mg無水醋酸鋰和60ml四氫呋喃，然后封住。將此安瓿內(nèi)容物在55℃加熱攪拌20小時(shí)。取反應(yīng)混合物等分試樣一份，通過氣相層析(以乙基溶纖劑作為內(nèi)標(biāo))估計(jì)反應(yīng)混合物中未作用的正丁醇。根據(jù)所加正丁醇的反應(yīng)比率，計(jì)算出共聚物的馬來酐環(huán)轉(zhuǎn)變到正丁基半酯的轉(zhuǎn)化率為43.3%(摩爾)。反應(yīng)混合物在減壓下濃縮，將濃縮液滴加到500ml正己烷中，達(dá)到重沉淀目的。生成的沉淀經(jīng)回收濾集后在室溫干燥過夜，得1.13g所需的正丁基半酯化的二乙烯基醚-馬來酐共聚物。
(b)通過正丁基半酯化的二乙烯基醚-馬來酐共聚物與SOD反應(yīng)，合成SOD衍生物將200μl人紅細(xì)胞SOD水溶液(62.8mg/ml)和170mg碳酸氫鈉溶于1.8ml等滲磷酸鹽緩沖液(pH7.04)。在室溫?cái)嚢柘?，向此溶液逐漸加入64mg正丁基半酯化的二乙烯基醚-馬來酐共聚物〔制法見上述(a)〕，使反應(yīng)再進(jìn)行2小時(shí)，然后在4℃放置過夜。過濾反應(yīng)混合物，將濾液置于Sephadex
G75(Pharmacia F.C.)柱上作凝膠過濾，用10mM碳酸氫銨水溶液作為洗脫液。將含SOD衍生物的級(jí)分進(jìn)行冷凍干燥，得8.52mg白色粉末狀SOD衍生物。圖3顯示該產(chǎn)物的紅外吸收光譜(KBr片)。圖4(ⅰ)顯示原料SOD的光密度譜，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(慣常的PAGE方法)測(cè)定。圖4(ⅱ)顯示SOD衍生物的光密度譜，圖內(nèi)a代表SOD，b代表SOD衍生物。
用于以下配方實(shí)例的SOD衍生物，按合成實(shí)例1制得。按照本發(fā)明，類似的復(fù)方組合物也可以通過其他SOD衍生物制得。
配方方法1將從合成實(shí)例1制得的SOD衍生物，在冰冷下溶于蒸餾水(10mg/ml)。通過滴加0.5M醋酸調(diào)節(jié)溶液的pH值到大約3.0，然后進(jìn)行冷凍干燥。將一種中級(jí)/高級(jí)脂肪酸甘油酯(增補(bǔ)一種兩親試劑和/或低級(jí)鏈烷醇)加到經(jīng)冰凍干燥的SOD衍生物粉末中。振搖此混合物，直到獲得宏觀的均勻分散體。應(yīng)用TOMYUR-150P集成電路塊型超聲波發(fā)生器(TomySeiki)作振動(dòng)處理。這一處理的持續(xù)時(shí)間不超過30秒鐘。
配方方法2將預(yù)定量的兩親試劑加到一定量的蒸餾水中，加進(jìn)所要求的低級(jí)鏈烷醇之后，進(jìn)行超聲處理，以制成一個(gè)溶液。然后，將SOD衍生物粉末(合成實(shí)例1)于0.02%碳酸銨水溶液中的溶液(4mg/ml，在冰冷下制備)，以等體積加到上述溶液中去，將此混合液進(jìn)行冷凍干燥。然后向生成的冷凍干燥粉末中，加進(jìn)中級(jí)/高級(jí)脂肪酸甘油酯，接著加進(jìn)所要求的低級(jí)鏈烷醇?；旌衔镌诒≈凶鞒曁幚?0秒鐘。
表4給出用上述方法步驟制得本發(fā)明的復(fù)方組合物。
權(quán)利要求
1.具有通式[SOD][Z]n的超氧物歧化酶衍生物及其藥物學(xué)上可接受的鹽，其中[SOD]代表帶有1-22或24個(gè)各自衍生自氨基的基團(tuán)(即在氨基上除去一個(gè)氫原子所剩的一價(jià)基團(tuán))的超氧物歧化酶；[Z]代表單價(jià)共聚物基團(tuán)，其組成單元是有如下通式的基團(tuán)
其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個(gè)碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個(gè)碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚，或者含有1-4個(gè)碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以及R3或R4中各有一個(gè)代表氫原子；上述共聚物的組成單元還包括衍生自上述通式的基團(tuán)，即通過從COOR1，COOR2，COOR3及COOR4基團(tuán)的其中一個(gè)，除去OR1，OR2，OR3或OR4衍生的殘基(那里的羰基碳原子的鍵連接[SOD])，上述單價(jià)共聚物平均分子量為500-200，000；n代表1-22或24的整數(shù)，相應(yīng)于上述一價(jià)基團(tuán)的數(shù)目，這些一價(jià)基團(tuán)各衍生自氨基，即在上述[SOR]中的氨基上除去一個(gè)氫原子。
2.權(quán)利要求1所述的超氧物歧化酶或其藥物學(xué)上可接受的鹽，其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子。
3.一種生產(chǎn)通式為〔SOD〕〔Z〕n的超氧物歧化酶衍生物的方法，其中〔SOD〕代表帶有1-22或24個(gè)各自衍生自氨基的基團(tuán)(即從氨基上除去一個(gè)氫原子所剩的一價(jià)基團(tuán))的超氧物歧化酶;〔Z〕代表單價(jià)共聚物基團(tuán)，其組成單元是有如下通式的基團(tuán)
其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個(gè)碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個(gè)碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚或者含有1-4個(gè)碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以及R3或R4中各有一個(gè)代表氫原子，單價(jià)共聚物組成單元還包括衍生自上述通式的基團(tuán)，即通過從COOR1，COOR2，COOR3及COOR4基團(tuán)的其中一個(gè)除去OR1，OR2，OR3或OR4衍生的殘基(那里的羰基碳原子的鍵連接〔SOD〕)，上述單價(jià)共聚物平均分子量為500-200，000;n代表1-22或24的整數(shù)，相應(yīng)于上述一價(jià)基團(tuán)的數(shù)目，這些一價(jià)基團(tuán)各衍生自氨基，即在上述〔SOD〕中的氨基上除去一個(gè)氫原子;此方法包括將超氧物歧化酶與共聚物反應(yīng)，共聚物組成單元是(a)具有如下通式的基團(tuán)
其中R1，R2，R3和R4如上所規(guī)定，以及(b)選自以下一類的基團(tuán)如下通式的基團(tuán)
其中R1和R2分別如上所規(guī)定;如下通式的基團(tuán)
其中R3和R4分別如上所規(guī)定;如下通式的基團(tuán)
在pH7-11的堿性水溶液的存在下，該共聚物具有平均分子量500-200，000。
4.按照權(quán)利要求3生產(chǎn)超氧物歧化酶衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽的方法，其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子。
5.含有通式為〔SOD〕〔Z〕n的超氧物歧化酶衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽作為活性成分及藥物學(xué)上可接受的載體的抗炎復(fù)方組合物，其中〔SOD〕代表帶有1-22或24個(gè)各自衍生自氨基的基團(tuán)(即從氨基上除去一個(gè)氫原子代所剩的一價(jià)基團(tuán))的超氧物歧化酶;〔Z〕代表單價(jià)共聚物基團(tuán)，其組成單元是有如下通式的基團(tuán)
其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個(gè)碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個(gè)碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚，或者含有1-4個(gè)碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以及R3或R4中各有一個(gè)代表氫原子;上述共聚物組成單元還包括衍生自上述通式的基團(tuán)，即通過從COOR1，COOR2，COOR3及COOR4基團(tuán)的其中一個(gè)，除去OR1，OR2，OR3或OR4衍生的殘基(那里的羰基碳原子的鍵連接〔SOD〕)，上述單價(jià)共聚物平均分子量為500-200，000;n代表1-22或24的整數(shù)，相應(yīng)于上述一價(jià)基團(tuán)的數(shù)目，這些基團(tuán)各衍生自氨基，即在上述〔SOD〕中的氨基上除去一個(gè)氫原子。
6.含有通式〔SOD〕〔Z〕n的超氧物歧化酶衍生物和/或其在藥物學(xué)上可接受的鹽以及中級(jí)/高級(jí)脂肪酸甘油酯的口服藥物復(fù)方組合物，其中〔SOD〕代表帶有1-22或24個(gè)各自衍生物自氨基的基團(tuán)(即從氨基上除去一個(gè)氫原子所剩的一價(jià)基團(tuán))的超氧物歧化酶;〔Z〕代表單價(jià)共聚物基團(tuán)，其組成單元是有如下通式的基團(tuán);
其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個(gè)碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個(gè)碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚，或者含有1-4個(gè)碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以及R3或R4中各有一個(gè)代表氫原子，上述共聚物組成單元還包括衍生自上述通式的基團(tuán)，即通過從COOR1，COOR2，COOR3及COOR4基團(tuán)的其中一個(gè)，除去OR1，OR2，OR3或OR4衍生的殘基(那里的羰基碳原子的鍵連接〔SOD〕)，上述單價(jià)共聚物平均分子量為500-200，000;n代表1-22或24的整數(shù)，相應(yīng)于上述一價(jià)基團(tuán)的數(shù)目，這些基團(tuán)各衍生自氨基，即在上述〔SOD〕的氫基中除去一個(gè)氫原子。
7.含有通式〔SOD〕〔Z〕n的超氧物歧化酶衍生物和/或其藥物學(xué)上可接受的鹽，以及中級(jí)/高級(jí)脂肪酸甘油酯，還有兩親試劑和/或低級(jí)鏈烷醇的口服藥物復(fù)方組合物，其中〔SOD〕代表帶有1-22或24個(gè)各自衍生自氨基的基團(tuán)(即從氨基上除去一個(gè)氫原子所剩的一價(jià)基團(tuán))的超氧物歧化酶;〔Z〕代表單價(jià)共聚物基團(tuán)，其組成單元是有如下通式的基團(tuán)
其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個(gè)碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個(gè)碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚，或者含有1-4個(gè)碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以R3或R4中各有一個(gè)代表氫原子，上述共聚物組成單元還包括衍生自上述通式的基團(tuán)，即通過從COOR1，COOR2，COOR3及COOR4基團(tuán)的其中一個(gè)，除去OR1，OR2，OR3或OR4衍生的殘基(那里的羰基碳原子的鍵連接〔SOD〕)，上述單價(jià)共聚物平均分子量為500-200，000;n代表1-22或24的整數(shù)，相應(yīng)于上述一價(jià)基團(tuán)的數(shù)目，這些基團(tuán)各衍生自氨基，即在上述〔SOD〕的氨基中除去一個(gè)氫原子。
全文摘要
本發(fā)明提供一種具通式[SOD][Z]n的超氧物歧化酶衍生物及其藥物學(xué)上可接受的鹽。其中[SOD]代表帶有1—22或24個(gè)各自衍生自氨基的基團(tuán)(即從氨基上除去一個(gè)氫原子所剩的一價(jià)基團(tuán))的超氧物歧化酶；[Z]代表單價(jià)共聚物基團(tuán)，其組成單元是有如下通式的基團(tuán)
文檔編號(hào)C12N9/02GK1030426SQ8810316
公開日1989年1月18日 申請(qǐng)日期1988年5月28日 優(yōu)先權(quán)日1987年5月28日
發(fā)明者前田浩, 鈴木富士夫, 小田達(dá)也 申請(qǐng)人:前田浩, 可樂麗股份有限公司