Wdr63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向和牙向分化過程中的調(diào)控方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種WDR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向和牙向分化過程中的調(diào)控方法，通過細(xì)胞培養(yǎng)、染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)及數(shù)據(jù)分析、質(zhì)粒構(gòu)建與病毒轉(zhuǎn)染、蛋白質(zhì)印跡分析、細(xì)胞增殖能力測(cè)定、堿性磷酸酶和茜素紅染色、裸鼠皮下進(jìn)行細(xì)胞回植；發(fā)現(xiàn)WDR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向/牙向分化過程中的調(diào)控作用，以及在促進(jìn)牙組織再生中的作用。本發(fā)明采用涉及組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因活化和功能的調(diào)節(jié)作用、WDR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向/牙向分化過程中的調(diào)控作用、涉及WDR63基因在促進(jìn)牙組織再生中的作用，得到WDR63可能在根尖牙乳頭干細(xì)胞成骨分化中起促進(jìn)作用。
【專利說明】WDR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向和牙向分化過程中的調(diào)控 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種WDR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向和 牙向分化過程中的調(diào)控方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 牙病是人類最常見的疾病之一，而牙齒的缺失極大的影響了人們的健康和生活質(zhì) 量?，F(xiàn)有的義齒修復(fù)手段雖已成熟，但由于其不具備生物活性，難以與天然牙齒相媲美，無 法實(shí)現(xiàn)人類擁有"第三副牙"的愿景。為此，各國(guó)試圖利用干細(xì)胞和組織工程技術(shù)來實(shí)現(xiàn)牙 齒的重建。如何研制出一種具有生物學(xué)活性與功能并且能夠在頜骨中重建牙周關(guān)系的牙齒 修復(fù)缺失牙，是臨床牙科醫(yī)生和科研工作者共同期望解決的重大課題。隨著口腔發(fā)育生物 學(xué)以及組織工程技術(shù)的進(jìn)展，牙齒再生研究各個(gè)層面的工作均已展開，而全牙組織工程的 最佳策略是采用自體細(xì)胞，將牙齒及其周圍組織（包括牙齒、牙周膜、牙槽骨等）同時(shí)進(jìn)行 構(gòu)建，然后植入頜骨缺損區(qū)，以獲得具有一定活力的牙齒。在牙再生研究領(lǐng)域中，干細(xì)胞是 其重要的組成部分，干細(xì)胞是一類未分化的細(xì)胞，具有自我復(fù)制能力及向多分化潛能。目前 主要用于牙齒組織工程的牙源性干細(xì)胞有成人牙髓干細(xì)胞、乳牙牙髓干細(xì)胞、牙周膜干細(xì) 胞、根尖乳頭干細(xì)胞、牙囊細(xì)胞。其中根尖牙乳頭干細(xì)胞（SCAP)存在于牙齒根尖孔的牙乳 頭組織中，具有多向分化潛能，在體外可以誘導(dǎo)分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞 等，在體內(nèi)可以形成牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)，SCAP在根部牙本質(zhì)形成過程中發(fā)揮重要 作用，是一種較好的牙齒組織工程種子細(xì)胞，可用于牙髓牙本質(zhì)和生物學(xué)牙根的再生，具有 良好且廣闊的臨床應(yīng)用前景。同時(shí)牙髓中存在牙髓干細(xì)胞（DPSC)，牙髓干細(xì)胞能再生出牙 髓牙本質(zhì)樣復(fù)合體，其中的礦化基質(zhì)與其中的牙本質(zhì)小管及包含血管的纖維組織按照正 常人體的牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體層次排列。并且細(xì)胞具有顯著自我更新能力和多方向分化能 力，能在體內(nèi)異位形成牙本質(zhì)，還可分化成脂肪樣細(xì)胞和神經(jīng)樣細(xì)胞。2003年Miura等首次 發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了從人的脫落乳牙中分離到的一種具有多分化潛能的干細(xì)胞。并將該干細(xì)胞命 名為乳牙牙髓干細(xì)胞（SHED)。這類細(xì)胞同樣具有高度增殖能力、一定的多向分化潛能和自 我更新能力等生物學(xué)特性，可以向成牙本質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等方向分 化。牙周膜干細(xì)胞是來源于牙周膜的成體干細(xì)胞，能產(chǎn)生不同種類的具有特定表型和功能 的成熟細(xì)胞，能夠維持牙周膜功能的穩(wěn)定，發(fā)揮生理性細(xì)胞更新和修復(fù)組織損傷的作用，牙 周膜干細(xì)胞不僅能分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞和成骨細(xì)胞樣細(xì)胞，形成牙骨質(zhì)樣和骨樣組 織；而且還可分化為成纖維樣細(xì)胞，形成類似天然牙周膜樣的結(jié)締組織，能形成組織形態(tài)、 空間排列上類似于天然牙周膜牙骨質(zhì)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，提示這是一種可用于牙再生醫(yī)學(xué)的有 效骨再生的自體干細(xì)胞。牙囊是包繞成釉器周圍的疏松結(jié)締組織，起源于外胚間充質(zhì)，在牙 齒萌出過程中發(fā)揮著重要的作用。牙根形成時(shí)期，牙周組織（如牙骨質(zhì)、牙周膜和牙槽骨） 由牙囊前體細(xì)胞形成，牙囊干細(xì)胞可以分化為成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞。在找到 可能的種子細(xì)胞之后，間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化的分子機(jī)制仍不清楚，這也限制了間充質(zhì)干 細(xì)胞的潛在應(yīng)用。
[0003] 在干細(xì)胞分化過程中建立特殊的基因表達(dá)模式可以詳盡描述控制其過程的大量 基因的表達(dá)與沉默。組蛋白共價(jià)修飾在調(diào)節(jié)染色質(zhì)動(dòng)力及功能方面起重要作用。甲基化， 一種組蛋白的修飾類型，同時(shí)發(fā)生在賴氨酸和精氨酸殘基上。這種類型的組蛋白修飾涉及 各種生物進(jìn)程，以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。目前，干細(xì)胞分化過程中與基因表達(dá)模式緊密聯(lián)系的組蛋白 修飾的圖譜，仍未被廣泛的研究。目前，一種體內(nèi)組蛋白修飾的基因組作圖的技術(shù)方法正 發(fā)展起來，使得研究者關(guān)于組蛋白修飾的分布可以遵循一個(gè)廣泛觀點(diǎn)。這種方法是"CHIP on chip"，基于染色質(zhì)免疫沉淀試驗(yàn)，利用感興趣的基因組區(qū)域相一致的探針通過基因芯 片雜交識(shí)別富DNA片段。
[0004] 最近，研究者發(fā)現(xiàn)三甲基化H3K4與間充質(zhì)干細(xì)胞的基因活化和功能有關(guān)，尤其是 骨向分化。研究的目的是通過使用CHIP-on-chip的方法研究間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化過程 中基因啟動(dòng)子區(qū)域三甲基化H3K4修飾對(duì)基因組的改變。在的研究中，通過比較分化與未分 化根尖牙乳頭干細(xì)胞（SCAP)基因啟動(dòng)子區(qū)域三甲基化H3K4圖譜，來研究三甲基化H3K4在 根尖牙乳頭干細(xì)胞骨向分化潛能中的功能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種WDR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向和牙向分化 過程中的調(diào)控方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)沒有涉及TOR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向和牙向分 化過程中調(diào)控的問題。
[0006] 本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種WDR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向和牙向分化過 程中的調(diào)控方法，該WDR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向和牙向分化過程中的調(diào)控方法包括：
[0007] 步驟一，細(xì)胞培養(yǎng)，智齒在用75%酒精消毒后再用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗，分離和培 養(yǎng)鑒定根尖牙乳頭干細(xì)胞；
[0008] 步驟二，染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)及數(shù)據(jù)分析，細(xì)胞于1 %甲醛溶液中孵育15分鐘， 2X 106個(gè)細(xì)胞以及抗組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化抗體用于此染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)， 所有產(chǎn)生的沉淀DNA樣本采用實(shí)時(shí)定量per進(jìn)行量化，數(shù)據(jù)表示為DNA的百分比；
[0009] 步驟三，質(zhì)粒構(gòu)建與病毒轉(zhuǎn)染，標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行質(zhì)粒的構(gòu)建，設(shè)計(jì)TOR63的SiRNA，將 其插入慢病毒的shRNA載體上，測(cè)序鑒定，最終構(gòu)建成WDR63shRNA的質(zhì)粒；設(shè)計(jì)WDR63基因 全長(zhǎng)的PCR引物，用PCR的方法得到WDR63的全長(zhǎng)將其連接到逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)載體上，測(cè) 序鑒定，最終構(gòu)建成質(zhì)粒；然后進(jìn)行病毒包裝、收集，病毒滴度鑒定，分裝后保存在-80度冰 箱；病毒轉(zhuǎn)染，對(duì)根尖牙乳頭干細(xì)胞進(jìn)行電鍍過夜，然后感染逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢的聚凝胺達(dá) 6個(gè)小時(shí)，48小時(shí)后，用不同的抗生素篩選被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；
[0010] 步驟四，蛋白質(zhì)印跡分析，RIPA裂解液溶解細(xì)胞，樣本用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠 分離并利用半干轉(zhuǎn)移膜裝置轉(zhuǎn)移到聚乙二烯二氟化物中，膜上涂抹5%脫水牛奶放置2h， 然后用一抗孵育一夜；免疫復(fù)合物與兔或小鼠免疫球蛋白G抗體一同孵育并用化學(xué)發(fā)光底 物試劑使其可視化；針對(duì)WDR63是抗WDR63多克隆抗體；
[0011] 步驟五，細(xì)胞增殖能力測(cè)定，根尖牙乳頭干細(xì)胞密1.0X104個(gè)細(xì)胞密度鋪板于 60nm培養(yǎng)皿；并在細(xì)胞培養(yǎng)3、5、7天進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)胞計(jì)數(shù)采用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀并在細(xì)胞懸 液中加入臺(tái)盼藍(lán)排除死細(xì)胞；進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)取平均值；
[0012] 步驟六，堿性磷酸酶和茜素紅染色，礦化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)根尖牙乳頭干細(xì)胞，堿性磷酸 酶活性檢測(cè)根據(jù)堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行分析，為檢測(cè)礦化能力，細(xì)胞誘導(dǎo)2-3 周后，用70%乙醇固定，2%茜素紅染色；定量測(cè)定鈣離子濃度，用10%的氯化十六烷吡啶 溶于磷酸鈉在室溫下使茜素紅退色30分鐘；鈣離子濃度是通過測(cè)量562nm的吸光度決定， 并用標(biāo)準(zhǔn)曲線換算；
[0013] 步驟七，裸鼠皮下進(jìn)行細(xì)胞回植，將4. OX 106個(gè)細(xì)胞與40毫克的羥基磷灰石/磷 酸三鈣陶瓷顆粒混合，然后移植到5只10周齡裸鼠背部皮下，在每一個(gè)裸鼠，空白根尖牙乳 頭干細(xì)胞移植到左側(cè)背表面皮下，而WDR63根尖牙乳頭細(xì)胞移植到右側(cè)背表面皮下；依照 動(dòng)物協(xié)議批準(zhǔn)規(guī)范進(jìn)行；移植后第八周，獲取移植細(xì)胞用10%福爾馬林固定，10% EDTA脫 鈣，pH值8. 0,石蠟包埋，HE染色，定性測(cè)量組織礦化量。
[0014] 進(jìn)一步，步驟一的具體方法：輕輕剝離根尖牙乳頭組織，用磷酸鹽緩沖鹽水反復(fù)清 洗，剪碎，置于含I型膠原酶3g/L和分散酶4g/L的消化液，37°C下消化1小時(shí)，過70 i! m細(xì) 胞篩收集細(xì)胞，l〇〇〇rpm離心lOmin，用培養(yǎng)液重新懸浮成單細(xì)胞懸液；將細(xì)胞接種于25cm2 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)基含15%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100 y g/ml 鏈霉素中37°C、5% C02培養(yǎng)，每2?3天換液1次；每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀 況；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合狀態(tài)時(shí)，用0. 25%胰蛋白酶按1 : 2消化傳代；2-4代的干細(xì)胞 被用于之后的實(shí)驗(yàn)。
[0015] 進(jìn)一步，在步驟二中，信號(hào)必須標(biāo)準(zhǔn)化以進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)；L0WESS程序被用來衡量 不同染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)數(shù)組之間的可變性，為了確定組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化， 不同條件下的根尖牙乳頭干細(xì)胞存在差異甲基化，因此定義2倍變化為組蛋白3第4位賴 氨酸的三甲基化顯著變化的閾值；同樣，假定值閾值〇. 05也用來區(qū)分基因改變；雙通道圖 像數(shù)據(jù)比使用L0WESS方法規(guī)范化，并假定值計(jì)算是使用相同的方法實(shí)現(xiàn)的表達(dá)分析。
[0016] 進(jìn)一步，在步驟三中，shRNA的目標(biāo)序列為：
[0017] WDR63shRNA:5， -AAACCCAGGGCTGCCTTGGAAAAG-3，。
[0018] 進(jìn)一步，該TOR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向和牙向分化過程中的調(diào)控方法中 WDR63增強(qiáng)其堿性磷酸酶活性及礦化能力，WDR63能夠激活兩個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子0SX和RUNX2 的表達(dá)；WDR63是成骨分化的一個(gè)關(guān)鍵的增強(qiáng)劑；WDR63促進(jìn)體外細(xì)胞增殖能力支持WDR63 具有增強(qiáng)組織再生的潛能；WDR63啟動(dòng)子的組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化能夠增強(qiáng)根 尖牙乳頭干細(xì)胞的成骨分化潛能。
[0019] 本發(fā)明實(shí)施例提供的WDR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向和牙向分化過程中的調(diào)控 方法，通過一系列試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)WDR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向/牙向分化過程中的調(diào)控作用， 以及在促進(jìn)牙組織再生中的作用。本發(fā)明采用涉及組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化對(duì)間 充質(zhì)干細(xì)胞的基因活化和功能的調(diào)節(jié)作用、WDR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向/牙向分化過 程中的調(diào)控作用、涉及WDR63基因在促進(jìn)牙組織再生中的作用，得到WDR63可能在根尖牙乳 頭干細(xì)胞成骨分化中起促進(jìn)作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的成骨培養(yǎng)在WDR63，TREX1，F(xiàn)0X024，ARNT這些啟動(dòng)子中 促進(jìn)組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化，誘導(dǎo)WDR63及ARNTL表達(dá)；并且在F0XP4, TMEM106B 這些啟動(dòng)子中抑制組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化，抑制F0XP4表達(dá)示意圖；
[0021] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的WDR63的過表達(dá)增強(qiáng)根尖牙乳頭干細(xì)胞的骨向分化能 力示意圖；
[0022] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的WDR63的過表達(dá)增加體內(nèi)礦化組織形成量示意圖；
[0023] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的WDR63的低表達(dá)可抑制根尖牙乳頭干細(xì)胞增殖和骨向 分化能力示意圖；
[0024] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的WDR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向和牙向分化過程中的 調(diào)控方法流程圖。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0026] 如圖5所示，本發(fā)明實(shí)施例的WDR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向和牙向分化過程中 的調(diào)控方法包括以下步驟：
[0027] S501 :細(xì)胞培養(yǎng)，智齒在用75%酒精消毒后再用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗，分離和培 養(yǎng)鑒定根尖牙乳頭干細(xì)胞；
[0028] S502:染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)及數(shù)據(jù)分析，細(xì)胞于1 %甲醒溶液中孵育15分鐘， 2X 106個(gè)細(xì)胞以及抗組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化抗體用于此染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)， 所有產(chǎn)生的沉淀DNA樣本采用實(shí)時(shí)定量per進(jìn)行量化，數(shù)據(jù)表示為DNA的百分比；
[0029] S503:設(shè)計(jì)WDR63的SiRNA，將其插入慢病毒的shRNA載體上，測(cè)序鑒定，最終構(gòu) 建成WDR63shRNA的質(zhì)粒；設(shè)計(jì)WDR63基因全長(zhǎng)的PCR引物，用PCR的方法得到WDR63的全 長(zhǎng)將其連接到逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)載體上，測(cè)序鑒定，最終構(gòu)建成質(zhì)粒；
[0030] S504 :然后進(jìn)行病毒包裝、收集，病毒滴度鑒定，分裝后保存在-80度冰箱；病毒轉(zhuǎn) 染，對(duì)根尖牙乳頭干細(xì)胞進(jìn)行電鍍過夜，然后感染逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢的聚凝胺達(dá)6個(gè)小時(shí)，48 小時(shí)后，用不同的抗生素篩選被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；
[0031] S505 :RIPA裂解液溶解細(xì)胞，樣本用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠分離并利用半干轉(zhuǎn) 移膜裝置轉(zhuǎn)移到聚乙二烯二氟化物中，膜上涂抹5%脫水牛奶放置2h，然后用一抗孵育一 夜；免疫復(fù)合物與兔或小鼠免疫球蛋白G抗體一同孵育并用化學(xué)發(fā)光底物試劑使其可視 化；
[0032] S506:細(xì)胞增殖能力測(cè)定，根尖牙乳頭干細(xì)胞密1.OX104個(gè)細(xì)胞密度鋪板于60nm 培養(yǎng)皿；并在細(xì)胞培養(yǎng)3、5、7天進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)胞計(jì)數(shù)采用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀并在細(xì)胞懸液中 加入臺(tái)盼藍(lán)排除死細(xì)胞；進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)取其平均值；
[0033] S507:礦化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)根尖牙乳頭干細(xì)胞，堿性磷酸酶活性檢測(cè)根據(jù)堿性磷酸酶 活性檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行分析，細(xì)胞誘導(dǎo)2-3周后，用70%乙醇固定，2%茜素紅染色；定量 測(cè)定鈣離子濃度，用10%的氯化十六烷吡啶溶于磷酸鈉在室溫下使茜素紅退色30分鐘；鈣 離子濃度是通過測(cè)量562nm的吸光度決定，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線換算；
[0034] S508:將4.OX106個(gè)細(xì)胞與40毫克的羥基磷灰石/磷酸三鈣陶瓷顆粒混合，然 后將其移植到5只10周齡裸鼠背部皮下，在每一個(gè)裸鼠，空白根尖牙乳頭干細(xì)胞移植到左 側(cè)背表面皮下，而WDR63根尖牙乳頭細(xì)胞移植到右側(cè)背表面皮下；這些程序依照動(dòng)物協(xié)議 批準(zhǔn)規(guī)范進(jìn)行；移植后第八周，獲取移植細(xì)胞用10%福爾馬林固定，10% EDTA脫鈣（pH值 8. 0)，石蠟包埋，HE染色，定性測(cè)量組織礦化量。
[0035] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明；
[0036] 一、細(xì)胞培養(yǎng)
[0037] 本發(fā)明所涉及的所有干細(xì)胞均遵守人類胚胎干細(xì)胞研究的行為指南，人體組織 的利用得到首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，志愿者均知情同意術(shù)前簽訂知情同意書；智 齒在用75%酒精消毒后再用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗，分離和培養(yǎng)鑒定根尖牙乳頭干細(xì)胞，簡(jiǎn) 述如下：輕輕剝離根尖牙乳頭組織，用磷酸鹽緩沖鹽水反復(fù)清洗，剪碎，置于含I型膠原酶 (3g/L)和分散酶（4g/L)的消化液，37°C下消化1小時(shí)，過70iim細(xì)胞篩收集細(xì)胞，lOOOrpm 離心lOmin，用培養(yǎng)液重新懸浮成單細(xì)胞懸液；將細(xì)胞接種于25cm 2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng) 基（含15%胎牛血清、2111111〇1/1谷氨酰胺、10(^/1111青霉素和10011 §/1111鏈霉素）中371：、 5% C02培養(yǎng)，每2?3天換液1次；每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至 80%匯合狀態(tài)時(shí)，用0. 25%胰蛋白酶按1 : 2消化傳代；2-4代的干細(xì)胞被用于之后的實(shí) 驗(yàn)；
[0038] 二、染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)及數(shù)據(jù)分析：
[0039] 染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)按照制造商的產(chǎn)品說明進(jìn)行并使用人類啟動(dòng)子1. OR陣列分 析；細(xì)胞于1 %甲醛溶液中孵育15分鐘，2X 106個(gè)細(xì)胞以及抗組蛋白3第4位賴氨酸的三 甲基化抗體用于此染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)，所有產(chǎn)生的沉淀DNA樣本采用實(shí)時(shí)定量per進(jìn)行 量化，數(shù)據(jù)表示為DNA的百分比；引物如補(bǔ)充表1所示；由于實(shí)驗(yàn)和技術(shù)變化，信號(hào)必須標(biāo) 準(zhǔn)化以進(jìn)行適當(dāng)?shù)膶?duì)比實(shí)驗(yàn)；L0WESS程序被用來衡量不同染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)數(shù)組之間 的可變性，為了確定組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化，不同條件下的根尖牙乳頭干細(xì)胞存 在差異甲基化，因此定義2倍變化為組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化顯著變化的閾值；同 樣，假定值閾值〇. 05也用來區(qū)分基因改變；簡(jiǎn)略的，雙通道圖像數(shù)據(jù)比使用L0WESS方法規(guī) 范化，并假定值計(jì)算是使用相同的方法實(shí)現(xiàn)的表達(dá)分析；
[0040] 三、質(zhì)粒構(gòu)建與病毒轉(zhuǎn)染：
[0041] 標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行質(zhì)粒的構(gòu)建；所有結(jié)構(gòu)都通過適當(dāng)?shù)南拗葡?或測(cè)序加以 驗(yàn)證；設(shè)計(jì)WDR63的SiRNA，將其插入慢病毒的shRNA載體上，測(cè)序鑒定，最終構(gòu)建成 WDR63shRNA的質(zhì)粒；設(shè)計(jì)WDR63基因全長(zhǎng)的PCR引物，用PCR的方法得到WDR63的全長(zhǎng)將 其連接到逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)載體上，測(cè)序鑒定，最終構(gòu)建成質(zhì)粒；然后進(jìn)行病毒包裝、收集， 病毒滴度鑒定，分裝后保存在-80度冰箱；病毒轉(zhuǎn)染，對(duì)根尖牙乳頭干細(xì)胞進(jìn)行電鍍過夜， 然后感染逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢的聚凝胺達(dá)6個(gè)小時(shí)，48小時(shí)后，用不同的抗生素篩選被轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞；
[0042] shRNA的目標(biāo)序列為：
[0043] WDR63shRNA:5， -AAACCCAGGGCTGCCTTGGAAAAG-3，；
[0044] 四、蛋白質(zhì)印跡分析：
[0045] RIPA裂解液溶解細(xì)胞，樣本用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠分離并利用半干轉(zhuǎn)移膜 裝置轉(zhuǎn)移到聚乙二烯二氟化物（PVDF)中，膜上涂抹5%脫水牛奶放置2h，然后用一抗孵育 一夜；免疫復(fù)合物與兔或小鼠免疫球蛋白G抗體一同孵育并用化學(xué)發(fā)光底物試劑使其可視 化；主要針對(duì)WDR63是抗WDR63多克隆抗體；
[0046] 五、細(xì)胞增殖能力測(cè)定：
[0047] 根尖牙乳頭干細(xì)胞密1. OX 104個(gè)細(xì)胞密度鋪板于60nm培養(yǎng)皿；并在細(xì)胞培養(yǎng)3、 5、7天進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)胞計(jì)數(shù)采用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀并在細(xì)胞懸液中加入臺(tái)盼藍(lán)排除死細(xì)胞； 進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)取其平均值；
[0048] 六、堿性磷酸酶和茜素紅染色：
[0049] 礦化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)根尖牙乳頭干細(xì)胞，堿性磷酸酶活性檢測(cè)根據(jù)堿性磷酸酶活性檢 測(cè)試劑盒說明進(jìn)行分析，為檢測(cè)其礦化能力，細(xì)胞誘導(dǎo)2-3周后，用70%乙醇固定，2%茜素 紅染色；定量測(cè)定鈣離子濃度，用10%的氯化十六烷吡啶溶于磷酸鈉在室溫下使茜素紅退 色30分鐘；鈣離子濃度是通過測(cè)量562nm的吸光度決定，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線換算；
[0050] 七、裸鼠皮下進(jìn)行細(xì)胞回植：
[0051] 本發(fā)明通過首都醫(yī)科大學(xué)北京口腔醫(yī)院動(dòng)物關(guān)懷和使用委員會(huì)允許；將約 4. 0 X 106個(gè)細(xì)胞與40毫克的羥基磷灰石/磷酸三鈣陶瓷顆?；旌希缓蟀聪惹八鰧⑵湟?植到5只10周齡裸鼠背部皮下，在每一個(gè)裸鼠，空白根尖牙乳頭干細(xì)胞移植到左側(cè)背表面 皮下，而WDR63根尖牙乳頭細(xì)胞移植到右側(cè)背表面皮下；這些程序依照動(dòng)物協(xié)議批準(zhǔn)規(guī)范 進(jìn)行；移植后第八周，獲取移植細(xì)胞用10%福爾馬林固定，10% EDTA脫鈣（pH值8.0)，石蠟 包埋，HE染色，定性測(cè)量組織礦化量；
[0052] 八、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0053] 使用染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)生成基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修飾基因圖譜：
[0054] 試圖檢測(cè)根尖牙乳頭干細(xì)胞成骨分化時(shí)啟動(dòng)子區(qū)域分布的組蛋白3第4位賴氨 酸的三甲基化的全基因組基因；分別用成骨培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基培養(yǎng)根尖牙乳頭干細(xì)胞7 天，使用抗組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化抗體與差異標(biāo)記的濃縮芯片共雜交進(jìn)行染色 質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)；染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)數(shù)據(jù)顯示，在成骨誘導(dǎo)后基因啟動(dòng)子富含三甲基化 的組蛋白3第4位賴氨酸；此外，在比較未分化和分化根尖牙乳頭干細(xì)胞基因啟動(dòng)子區(qū)域三 甲基化的組蛋白3第4位賴氨酸基因圖譜發(fā)現(xiàn)，119個(gè)基因啟動(dòng)子展現(xiàn)出在三甲基化的組 蛋白3第4位賴氨酸大于兩倍的增長(zhǎng)，21個(gè)基因啟動(dòng)子展現(xiàn)出在三甲基化的組蛋白3第4 位賴氨酸大于兩倍的降低；為了證實(shí)染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，WDR63，TREX1，F(xiàn)0X024， ARNTL，F(xiàn)0XP4, TMEM106B這些基因驗(yàn)證芯片分析；結(jié)果表明相對(duì)于普通培養(yǎng)基，成骨誘導(dǎo)時(shí) 在WDR63, TREX1，F(xiàn)0X024, ARNTL這些啟動(dòng)子中三甲基化的組蛋白3第4位賴氨酸顯著增 力口，而在F0XP4，TMEM106B這些啟動(dòng)子中三甲基化的組蛋白3第4位賴氨酸顯著降低（圖片 la-f);另外，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示在根尖牙乳頭干細(xì)胞分化過程中，WDR63，ARNTL呈現(xiàn)大 于兩倍的高表達(dá)，而F0XP4則為地表達(dá)（圖片lg-i);然而TREX1，F(xiàn)0X024，TMEM106B在分化 與未分化根尖牙乳頭干細(xì)胞中的表達(dá)無明顯差異；總的來說，這些數(shù)據(jù)讓推測(cè)WDR63可能 在根尖牙乳頭干細(xì)胞成骨分化中起促進(jìn)作用；
[0055] WDR63過表達(dá)增強(qiáng)根尖牙乳頭干細(xì)胞的成骨分化潛能
[0056] 進(jìn)一步證實(shí)WDR63在根尖牙乳頭干細(xì)胞中的功能，將WDR63序列插入一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄 病毒載體；這種構(gòu)造通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染結(jié)合到根尖牙乳頭干細(xì)胞時(shí)過量表達(dá)WDR63 ;也 通過蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證WDR63的過量表達(dá)（圖片2a);接下來，結(jié)合后的根尖牙乳頭干細(xì) 胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)以檢測(cè)其成骨分化潛能，結(jié)果表明，WDR63的過度表達(dá)增加了堿性磷酸酶活 性（圖片2b);因此，通過茜素紅染色和鈣離子定量測(cè)量，過量表達(dá)WDR63的根尖牙乳頭干 細(xì)胞相對(duì)于空白載體的根尖牙乳頭干細(xì)胞其礦化能力增強(qiáng)（圖片2c-d);實(shí)時(shí)定量PCR結(jié) 果也顯示，在過量表達(dá)WDR63的根尖牙乳頭干細(xì)胞誘導(dǎo)的第7天和第14天，骨涎蛋白的表 達(dá)顯著增高（圖片2e);接下來，檢測(cè)了調(diào)節(jié)成骨分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，包括RUNX2 和OSX ;RUNX2和OSX的RNA水平顯著增高在過量表達(dá)WDR63的根尖牙乳頭干細(xì)胞中相對(duì) 于空白載體的根尖牙乳頭干細(xì)胞（圖片2f-g);接下來，研究是否添加WDR63會(huì)影響根尖牙 乳頭干細(xì)胞在體內(nèi)的骨生成；SCA空載根尖牙乳頭干細(xì)胞和載WDR63根尖牙乳頭干細(xì)胞移 植到裸鼠皮下；在移植后第8周，HE染色顯示，在獲取的載WDR63根尖牙乳頭干細(xì)胞移植體 中有更多的骨樣礦化組織相比空白組（圖片3a);定性測(cè)量礦化組織顯示骨樣礦化組織量 在載WDR63根尖牙乳頭干細(xì)胞移植體中要高于空白組（圖片3b);因此，體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)表明 載WDR63根尖牙乳頭干細(xì)胞產(chǎn)生更多的骨樣礦化組織相比空載根尖牙乳頭干細(xì)胞；綜上所 述，這些結(jié)果表明，WDR63表達(dá)大大觸發(fā)的根尖牙乳頭干細(xì)胞成骨分化；
[0057] WDR63的減少抑制根尖牙乳頭干細(xì)胞的骨向分化
[0058] 為了進(jìn)一步闡明WDR63在根尖牙乳頭干細(xì)胞中的功能，設(shè)計(jì)了一個(gè)短發(fā)卡RNA目 標(biāo)在于抑制WDR63表達(dá)式并將其通過慢病毒轉(zhuǎn)染引入根尖牙乳頭干細(xì)胞；選擇后，用免疫 印跡分析檢測(cè)減低的效能（圖片4a);接下來，檢測(cè)是否WDR63在本質(zhì)上影響了根尖牙乳頭 干細(xì)胞的成骨能力；根尖牙乳頭干細(xì)胞在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)抑制WDR63的根尖牙乳 頭干細(xì)胞其堿性磷酸酶活性顯著低于空白根尖牙乳頭干細(xì)胞（圖片4b);成骨誘導(dǎo)后通過 茜素紅染色和鈣離子定量測(cè)量，抑制WDR63的根尖牙乳頭干細(xì)胞相對(duì)于空白根尖牙乳頭干 細(xì)胞其礦化能力明顯降低（圖片4c-d);此外，在細(xì)胞培養(yǎng)7天后進(jìn)行細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 顯示，抑制WDR63的根尖牙乳頭干細(xì)胞相對(duì)于空白根尖牙乳頭干細(xì)胞其增殖能力明顯降低 (圖片4e);
[0059] 九、結(jié)論
[0060] TOR63是一種未知功能的WD重復(fù)蛋白，研究在根尖牙乳頭干細(xì)胞分化過程中 WDR63的功能，發(fā)現(xiàn)在根尖牙乳頭干細(xì)胞體內(nèi)外分化過程中，WDR63增強(qiáng)其堿性磷酸酶活性 及礦化能力，這表明WDR63可能是控制間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化潛能的一個(gè)關(guān)鍵因素；間充 質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞系分化要求其他細(xì)胞系分化間的協(xié)調(diào)與抑制，多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的激活與 間充質(zhì)干細(xì)胞分化有關(guān)，兩個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，RUNX2和0SX是成骨分化所必需的；研究結(jié) 果表明，WDR63能夠激活兩個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子0SX和RUNX2的表達(dá)；接下來，檢測(cè)了骨涎蛋白 的mRNA水平，其為骨基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)蛋白；研究結(jié)果顯示，WDR63誘導(dǎo)骨涎蛋白基因的表 達(dá)；這些結(jié)果表明WDR63是成骨分化的一個(gè)關(guān)鍵的增強(qiáng)劑；此外，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線表明抑制 WDR63會(huì)抑制根尖牙乳頭干細(xì)胞的增殖；間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和生存能力的體外檢 測(cè)能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)體內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞功能；這些發(fā)現(xiàn)顯著表明增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)，增 殖，生存能力可能提高他們的血管和組織再生潛力；在目前的研究中，研究結(jié)果對(duì)于WDR63 促進(jìn)體外細(xì)胞增殖能力支持WDR63具有增強(qiáng)組織再生的潛能；
[0061] 總之，結(jié)果代表著國(guó)際性觀點(diǎn)即三甲基化的組蛋白3第4位賴氨酸的修飾與根尖 牙乳頭干細(xì)胞骨向分化的功能性聯(lián)系，并表明通過改變?nèi)谆慕M蛋白3第4位賴氨酸 控制基因激活和沉默對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化至關(guān)重要；還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)關(guān)鍵的成骨分化 增強(qiáng)劑-WDR63, WDR63啟動(dòng)子的組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化能夠增強(qiáng)根尖牙乳頭干 細(xì)胞的成骨分化潛能。
[0062] 補(bǔ)充圖表1 :進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)實(shí)時(shí)定量PCR的引物
[0063]

【權(quán)利要求】
1. 一種WDR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向和牙向分化過程中的調(diào)控方法，其特征在于， 該WDR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向和牙向分化過程中的調(diào)控方法包括： 步驟一，細(xì)胞培養(yǎng)，智齒在用75%酒精消毒后再用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗，分離和培養(yǎng)鑒 定根尖牙乳頭干細(xì)胞； 步驟二，染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)及數(shù)據(jù)分析，細(xì)胞于1 %甲醛溶液中孵育15分鐘，2 X 106個(gè)細(xì)胞以及抗組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化抗體用于此染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)，所有產(chǎn) 生的沉淀DNA樣本采用實(shí)時(shí)定量per進(jìn)行量化，數(shù)據(jù)表示為DNA的百分比； 步驟三，質(zhì)粒構(gòu)建與病毒轉(zhuǎn)染，標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行質(zhì)粒的構(gòu)建，設(shè)計(jì)TOR63的SiRNA，將其插 入慢病毒的shRNA載體上，測(cè)序鑒定，最終構(gòu)建成WDR63shRNA的質(zhì)粒；設(shè)計(jì)WDR63基因全 長(zhǎng)的PCR引物，用PCR的方法得到WDR63的全長(zhǎng)將其連接到逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)載體上，測(cè) 序鑒定，最終構(gòu)建成質(zhì)粒；然后進(jìn)行病毒包裝、收集，病毒滴度鑒定，分裝后保存在-80度冰 箱；病毒轉(zhuǎn)染，對(duì)根尖牙乳頭干細(xì)胞進(jìn)行電鍍過夜，然后感染逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢的聚凝胺達(dá)6 個(gè)小時(shí),48小時(shí)后，用不同的抗生素篩選被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞； 步驟四，蛋白質(zhì)印跡分析，RIPA裂解液溶解細(xì)胞，樣本用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠分離 并利用半干轉(zhuǎn)移膜裝置轉(zhuǎn)移到聚乙二烯二氟化物中，膜上涂抹5 %脫水牛奶放置2h，然后 用一抗孵育一夜；免疫復(fù)合物與兔或小鼠免疫球蛋白G抗體一同孵育并用化學(xué)發(fā)光底物試 劑使其可視化；針對(duì)WDR63是抗WDR63多克隆抗體； 步驟五，細(xì)胞增殖能力測(cè)定，根尖牙乳頭干細(xì)胞密1. 0 X 104個(gè)細(xì)胞密度鋪板于60nm培 養(yǎng)皿；并在細(xì)胞培養(yǎng)3、5、7天進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)胞計(jì)數(shù)采用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀并在細(xì)胞懸液中加 入臺(tái)盼藍(lán)排除死細(xì)胞；進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)取平均值； 步驟六，堿性磷酸酶和茜素紅染色，礦化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)根尖牙乳頭干細(xì)胞，堿性磷酸酶活 性檢測(cè)根據(jù)堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行分析，為檢測(cè)礦化能力，細(xì)胞誘導(dǎo)2-3周 后，用70%乙醇固定，2%茜素紅染色；定量測(cè)定鈣離子濃度，用10%的氯化十六烷吡啶溶 于磷酸鈉在室溫下使茜素紅退色30分鐘；鈣離子濃度是通過測(cè)量562nm的吸光度決定，并 用標(biāo)準(zhǔn)曲線換算； 步驟七，裸鼠皮下進(jìn)行細(xì)胞回植，將4. 0 X 106個(gè)細(xì)胞與40毫克的羥基磷灰石/磷酸三 鈣陶瓷顆粒混合，然后移植到5只10周齡裸鼠背部皮下，在每一個(gè)裸鼠，空白根尖牙乳頭干 細(xì)胞移植到左側(cè)背表面皮下，而WDR63根尖牙乳頭細(xì)胞移植到右側(cè)背表面皮下；依照動(dòng)物 協(xié)議批準(zhǔn)規(guī)范進(jìn)行；移植后第八周，獲取移植細(xì)胞用10%福爾馬林固定，10% EDTA脫鈣，pH 值8. 0,石蠟包埋，HE染色，定性測(cè)量組織礦化量。
2. 如權(quán)利要求1所述的TOR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向和牙向分化過程中的調(diào)控方 法，其特征在于，步驟一的具體方法：輕輕剝離根尖牙乳頭組織，用磷酸鹽緩沖鹽水反復(fù)清 洗，剪碎，置于含I型膠原酶3g/L和分散酶4g/L的消化液，37°C下消化1小時(shí)，過70 y m細(xì) 胞篩收集細(xì)胞，l〇〇〇rpm離心lOmin，用培養(yǎng)液重新懸浮成單細(xì)胞懸液；將細(xì)胞接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)基含15%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100 y g/ml 鏈霉素中37°C、5% C02培養(yǎng)，每2?3天換液1次；每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀 況；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合狀態(tài)時(shí)，用0. 25%胰蛋白酶按1 : 2消化傳代；2-4代的干細(xì)胞 被用于之后的實(shí)驗(yàn)。
3. 如權(quán)利要求1所述的TOR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向和牙向分化過程中的調(diào)控方 法，其特征在于，在步驟二中，信號(hào)必須標(biāo)準(zhǔn)化以進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)；LOWESS程序被用來衡量不 同染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)數(shù)組之間的可變性，為了確定組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化，不 同條件下的根尖牙乳頭干細(xì)胞存在差異甲基化，因此定義2倍變化為組蛋白3第4位賴氨 酸的三甲基化顯著變化的閾值；同樣，假定值閾值〇. 05也用來區(qū)分基因改變；雙通道圖像 數(shù)據(jù)比使用LOWESS方法規(guī)范化，并假定值計(jì)算是使用相同的方法實(shí)現(xiàn)的表達(dá)分析。
4. 如權(quán)利要求1所述的TOR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向和牙向分化過程中的調(diào)控方 法，其特征在于，在步驟三中，shRNA的目標(biāo)序列為： WDR63shRNA:5, -AAACCCAGGGCTGCCTTGGAAAAG-3,。
5. 如權(quán)利要求1所述的TOR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向和牙向分化過程中的調(diào)控方 法，其特征在于，該TOR63基因在間充質(zhì)干細(xì)胞骨向和牙向分化過程中的調(diào)控方法中WDR63 增強(qiáng)其堿性磷酸酶活性及礦化能力，WDR63能夠激活兩個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子0SX和RUNX2的表 達(dá)；WDR63是成骨分化的一個(gè)關(guān)鍵的增強(qiáng)劑；WDR63促進(jìn)體外細(xì)胞增殖能力支持WDR63具有 增強(qiáng)組織再生的潛能；WDR63啟動(dòng)子的組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化能夠增強(qiáng)根尖牙 乳頭干細(xì)胞的成骨分化潛能。
【文檔編號(hào)】C12N15/867GK104450621SQ201410550443
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】范志朋, 刁樹, 楊東梅, 王松靈 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院