一種土霉素高產菌株及其高通量篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物菌種篩選【技術領域】，具體涉及一株土霉素高產菌株及其高通量篩選方法。本發(fā)明篩選出一株土霉素高產菌株，其分類名為龜裂鏈霉菌（Streptomyces?rimosus）DC473，保藏在CGMCC，保藏編號為6218，保藏日期為2012年06月14日。本發(fā)明所涉及高產菌株篩選方法如下：試管斜面培養(yǎng)；孢子懸液制備；孢子懸液預處理；理性化篩選；高產菌株篩選；菌株復試。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明以龜裂鏈霉菌代謝特征為依據，合理設計高通量篩選方法，可快速篩選高產菌株，簡單易行，所涉及的培養(yǎng)基原料來源廣、成本低，適合于工業(yè)生產。
【專利說明】一種土霉素高產菌株及其高通量篩選方法【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及工業(yè)生物技術、微生物菌種篩選【技術領域】，尤其是一種土霉素高產菌株及其高通量篩選方法。
【背景技術】
[0002]土霉素(Spectniomycni)是龜裂鏈霉菌(Streptomyces rimosus)有氧發(fā)酵后生成的次級代謝產物，為四環(huán)類廣譜抗生素，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有較強的抑制能力，對多種球菌和桿菌有抗菌作用，對立克次體和阿米巴病原蟲也有抑制作用，用來治療上呼吸道感染、胃腸道感染、斑疹傷寒、恙蟲病，支原體屬感染和衣原體屬感染等疾病。
[0003]土霉素主要用做畜禽用藥及飼料添加劑，此外，以土霉素為原料生產半合成抗生素的市場前景較好，比如用其合成的強力霉素(多西霉素)，其市場價格是土霉素的5-7倍，用其為原料生產的美他環(huán)素，臨床效果優(yōu)于土霉素，很多企業(yè)將土霉素、維生素B1、維生素B6等組成復方土霉素，能使土霉素療效增加，還能降低消化道副反應，是良好的動物飼料添加劑。因此，對土霉素高產菌株的選育和研究具有很好的經濟效益和社會效益。
[0004]N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍(NTG)是一種超誘變劑，應用廣泛，在堿性條件下，NTG會形成重氮甲烷(CH2N2 )，它是引起致死和突變的主要原因。它的效應很可能是CH2N2對DNA的烷化作用引起的誘變劑與一個或多個核酸堿基發(fā)生化學變化，使DNA復制時堿基置換而引起變異。如何從高豐度的基因突變庫中快速獲得目的突變子是誘變育種的關鍵。傳統的隨機篩選方法不僅費時 費力，還容易錯失目的突變菌株。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種土霉素高產菌株及其高通量篩選方法。
[0006]為了完成上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是:
[0007]一種土霉素高產菌株，分類名為龜裂鏈霉菌(Streptomyces rimosus)DC473,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N0.6216，保藏日期是2012年6月14日。
[0008]所述的菌株單菌落為扁平梅花型、孢子白色，基內菌絲棕褐色。
[0009]一種土霉素高產菌株高通量篩選方法，包括以下步驟:
[0010]A、試管斜面培養(yǎng):砂土管保藏的出發(fā)株轉接試管斜面，于溫度37.0±0.5°C，濕度40%-60%恒溫室培養(yǎng)3-5天；
[0011]B、孢子懸液制備:向成熟的試管斜面中加入IOmL無菌水，將孢子刮下，混勻，制成孢子懸液，用血球計數板計數，使孢子濃度為IO12-1O14個/mL ；
[0012]C、孢子懸液預處理:取制備好的孢子懸液，加入0.5-1.5uL亞硝基胍溶液，使其終濃度為0.1%-0.3%，漩渦振蕩器振蕩30-60S，混勻后于37±0.5°C靜置2_3h ；
[0013]D、理性化篩選:將亞硝基胍處理的孢子懸液稀釋至IO1-1O7倍，稀釋液涂布在含10-15 μ g/mL 土霉素及0.2-0.4 μ g/mL的鏈霉素分離培養(yǎng)基上，于37.0±0.5°C，40%_60%濕度條件下暗培養(yǎng)3-5天，培養(yǎng)時第一天正置，第二天起倒置培養(yǎng)；
[0014]E、高產菌株篩選:在分離培養(yǎng)基上挑取直徑在5mm以上的單菌落接種到F1斜面培養(yǎng)基上，于37.0±0.5°C，40%-60%濕度條件下培養(yǎng)3_5天；斜面成熟后接種到種子培養(yǎng)基中，于30.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養(yǎng)24_30h ;種液成熟后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，與種子相同條件30.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養(yǎng)5_7天，生長到周期后檢測效價，選效價高于14000u/mL的菌株進行砂土干燥保藏；
[0015]F、菌株復試:取沙土干燥保藏的菌株轉接試管斜面，于37.0±0.5°C，40%_60%濕度條件下培養(yǎng)3-5天，斜面成熟轉接至種子培養(yǎng)基中，于37.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養(yǎng)24-30h，種液成熟后轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于于37.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養(yǎng)5-7天，取樣檢測效價，篩選保留效價高于14000u/mL的菌株。
[0016]所述步驟D中土霉素含量為10-15 μ g/mL，鏈霉素含量為0.2_0.4μ g/mL。
[0017]所述步驟A、步驟E和步驟F中所用的試管斜面培養(yǎng)基成分及其含量為:
6.0%-7.0% 麩皮，2.0%-2.5% 瓊脂。
[0018]所述步驟D固體分離培養(yǎng)基中成分及其含量為:2.0%-3.0%玉米淀粉，0.2%_0.5%玉米漿，0.1%-0.3%硫酸銨，0.1%-0.5%碳酸鈣，0.3%-0.5%氯化鈉，2.0%_2.5%瓊脂。
[0019]所述的步驟E 和步驟F中所用的種子培養(yǎng)基成分及其含量為:2.0%-3.0%玉米淀粉，0.2%-0.5% 玉米漿，2.0%-3.0% 黃豆粉，0.1%-0.3% 硫酸銨，0.1%_0.5% 碳酸鈣，0.3%-0.5%氯化鈉。
[0020]所述的步驟E和步驟F中所用的發(fā)酵培養(yǎng)基成分及其含量為:10%_15%玉米淀粉，
0.2%-0.5% 玉米漿，2.0%-3.0% 黃豆粉，1.0%-1.5% 硫酸銨，1.0%_1.5% 碳酸鈣，0.3%-0.5% 氯化鈉，0.01%-0.05%磷酸二氫鉀，0.1%-0.3%聚醚消沫劑。
[0021]本發(fā)明的有益效果是:該菌株搖瓶發(fā)酵6天時，檢測效價為18000U/mL，較出發(fā)株(相同條件下效價為14000U/mL)提高了 28.6%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是本發(fā)明的篩選方法流程圖。
[0023]圖2是本發(fā)明中菌株DC473單菌落形態(tài)圖。
【具體實施方式】
[0024]本發(fā)明為一種土霉素高產菌株及其高通量篩選方法，該菌株搖瓶發(fā)酵6天時，檢測效價為18000U/mL，較出發(fā)株(相同條件下效價為14000U/mL)提高了 28.6%。
[0025]下面結合附圖對本發(fā)明做進一步說明。
[0026]具體實施例1，如圖2所示，一種土霉素高產菌株，分類名為龜裂鏈霉菌(Streptomyces rimosus) DC473,該菌株單菌落為扁平梅花型、孢子白色,基內菌絲棕褐色，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N0.6216，保藏日期是2012年6月14日。
[0027]一種土霉素高產菌株高通量篩選方法，如圖1所示，包括以下步驟:
[0028]A、試管斜面培養(yǎng):砂土管保藏的出發(fā)株轉接試管斜面，于溫度37.0±0.5°C，濕度40%-60%恒溫室培養(yǎng)3-5天。斜面培養(yǎng)基中成分及其含量為:6.0%-7.0%麩皮，2.0%_2.5%瓊脂；
[0029]B、孢子懸液制備:向成熟的試管斜面中加入一定量無菌水，將孢子刮下，混勻，制成孢子懸液，用血球計數板計數，使孢子濃度為IO12-1O14個/mL ；
[0030]C、孢子懸液預處理:取制備好的孢子懸液，加入一定量亞硝基胍溶液，使其終濃度為0.1%-0.3%，漩渦振蕩器振蕩30-60S，混勻后于37±0.5°C靜置2_3h ；
[0031]D、理性化篩選:將亞硝基胍處理的孢子懸液進行稀釋，稀釋液涂布在含10-15 μ g/mL 土霉素及0.2-0.4 μ g/mL的鏈霉素分離培養(yǎng)基上，于37.0±0.5°C，40%_60%濕度條件下暗培養(yǎng)3-5天，培養(yǎng)時第一天正置，第二天起倒置培養(yǎng)；分離培養(yǎng)中成分及其含量為:2.0%-3.0%玉米淀粉，0.2%-0.5%玉米漿，0.1%-0.3%硫酸銨，0.1%_0.5%碳酸鈣，0.3%-0.5% 氯化鈉，2.0%-2.5% 瓊脂；
[0032]E、高產菌株篩選:在分離培養(yǎng)基上挑取直徑在5mm以上的單菌落接種到Fl斜面培養(yǎng)基上，于37.0±0.5°C，40%-60%濕度條件下培養(yǎng)3_5天；斜面成熟后接種到種子培養(yǎng)基中，于30.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養(yǎng)24_30h ;種液成熟后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，與種子相同條件30.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養(yǎng)5_7天，種子培養(yǎng)基成分及其含量為:2.0%-3.0%玉米淀粉，0.2%-0.5%玉米漿，2.0%-3.0%黃豆粉，0.1%_0.3%硫酸銨， 0.1%-0.5%碳酸鈣，0.3-0.5%氯化鈉；發(fā)酵培養(yǎng)基成分及其含量為:10%-15%玉米淀粉，0.2%-0.5% 玉米漿，2.0%-3.0% 黃豆粉，1.0%-1.5% 硫酸銨，1.0%_1.5% 碳酸鈣，0.3%-0.5% 氯化鈉，0.01%-0.05%磷酸二氫鉀，0.1%-0.3%聚醚消沫劑；
[0033]F、菌株復試:取沙土干燥保藏的菌株轉接試管斜面，于37.0±0.5°C，40%_60%濕度條件下培養(yǎng)3-5天，斜面成熟轉接至種子培養(yǎng)基中，于37.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養(yǎng)24-30h，種液成熟后轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養(yǎng)5-7天，取樣檢測效價，篩選保留效價高于14000u/mL的菌株；發(fā)酵培養(yǎng)到周期后，用比色法進行效價檢測，篩選得到一株效價達18000U/mL的菌株(相同條件下效價為14000U/mL)，此菌株進行沙土干燥保藏。該高產菌株命名為DC473，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCC N0.6216，保藏日期為2012年06月14日。
[0034]具體實施例2，菌株復試
[0035]A.試管斜面培養(yǎng):砂土管保藏的出發(fā)株及篩選出的高產菌株DC473分別轉接試管斜面，于溫度37.0±0.5°C，濕度40%-60%恒溫室培養(yǎng)3_5天，斜面培養(yǎng)基中成分及其含量為:6.0%-7.0% 麩皮，2.0%-2.5% 瓊脂；
[0036]B.種子培養(yǎng):斜面成熟分別轉接至種子培養(yǎng)基中，于30.0±0.5°C，220rpm條件下震蕩培養(yǎng)24-30h ;種子培養(yǎng)基成分及其含量為:2.0-3.0%玉米淀粉，0.2%-0.5%玉米漿，2.0%-3.0% 黃豆粉，0.1%-0.3% 硫酸銨，0.1%-0.5% 碳酸鈣，0.3%-0.5% 氯化鈉；
[0037]C.發(fā)酵培養(yǎng):種液成熟后分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30.0±0.5°C，220rpm條件下震蕩培養(yǎng)3-5天，發(fā)酵培養(yǎng)基成分及其含量為:10%-15%玉米淀粉，0.2%-0.5%玉米漿，2.0%-3.0% 黃豆粉，1.0%-1.5% 硫酸銨，1.0%-1.5% 碳酸鈣，0.3%-0.5% 氯化鈉，0.01%-0.05%磷酸二氫鉀，0.1%-0.3%聚醚消沫劑；
[0038]效價檢測:發(fā)酵培養(yǎng)到周期后使用比色法對發(fā)酵單位進行檢測。以上實施事例2中的實驗重復進行三次，出發(fā)株三次復試發(fā)酵單位為14105U/mL、14240U/mL、14010U/mL，平均值為14118U/mL ； DC473菌株三次復試發(fā)酵單位分別為18120U/mL、18502U/mL、18370U/mL，平均值為18331U/mL.。比較DC473與出發(fā)菌株的平均效價克制，與出發(fā)株相比本發(fā)明所述的龜裂鏈霉菌DC473的發(fā)酵單位提高了 29.8%。
【權利要求】
1.一種土霉素高產菌株，其特征在于:分類名為龜裂鏈霉菌(Streptomyces rimosus)DC473，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC N0.6216，保藏日期是2012年6月14日。
2.根據權利要求1所述的一種土霉素高產菌株，其特征在于:所述的菌株單菌落為扁平梅花型、孢子白色，基內菌絲棕褐色。
3.—種土霉素高產菌株高通量篩選方法，其特征在于包括以下步驟: A、試管斜面培養(yǎng):砂土管保藏的出發(fā)株轉接試管斜面，于溫度37.0±0.5°C，濕度40%-60%恒溫室培養(yǎng)3-5天； B、孢子懸液制備:向成熟的試管斜面中加入IOmL無菌水，將孢子刮下，混勻，制成孢子懸液，用血球計數板計數，使孢子濃度為IO12-1O14個/mL ； C、孢子懸液預處理:取制備好的孢子懸液，加入0.5-1.5uL亞硝基胍溶液，使其終濃度為0.1%-0.3%，漩渦振蕩器振蕩30-60s，混勻后于37±0.5°C靜置2_3h ； D、理性化篩選:將亞硝基胍處理的孢子懸液稀釋至IO1-1O7倍，稀釋液涂布在含10-15μ g/mL土霉素及0.2-0.4 μ g/mL的鏈霉素分離培養(yǎng)基上，于37.0±0.5°C，40%_60%濕度條件下暗培養(yǎng)3-5天，培養(yǎng)時第一天正置，第二天起倒置培養(yǎng)； E、高產菌株篩選:在分離培養(yǎng)基上挑取直徑在5mm以上的單菌落接種到F1斜面培養(yǎng)基上，于37.0±0.5°C，40%-60%濕度條件下培養(yǎng)3_5天；斜面成熟后接種到種子培養(yǎng)基中，于30.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養(yǎng)24_30h ;種液成熟后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，與種子相同條件30.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養(yǎng)5_7天，生長到周期后檢測效價，選效價高于14000u/mL的菌株進行砂土干燥保藏； F、菌株復試:取沙土干燥保藏的菌株轉接試管斜面，于37.0±0.5°C，40%-60%濕度條件下培養(yǎng)3-5天，斜面成熟轉接至種子培養(yǎng)基中，于37.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養(yǎng)24-30h,種液成熟后轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37.0±0.5°C，220rpm條件下震蕩培養(yǎng)5_7天，取樣檢測效價，篩選保留效價高于14000u/mL的菌株。
4.根據權利要求3所述的一種土霉素高產菌株高通量篩選方法，其特征在于:所述步驟D中土霉素含量為10-15 μ g/mL,鏈霉素含量為0.2-0.4 μ g/mL。
5.根據權利要求3所述的一種土霉素高產菌株高通量篩選方法，其特征在于:所述步驟A、步驟E和步驟F中所用的試管斜面培養(yǎng)基成分及其含量為:6.0%-7.0%麩皮，.2.0%-2.5% 瓊脂。
6.根據權利要求3所述的一種土霉素高產菌株高通量篩選方法，其特征在于:所述步驟D固體分離培養(yǎng)基中成分及其含量為:2.0%-3.0%玉米淀粉，0.2%-0.5%玉米漿，.0.1%-0.3% 硫酸銨，0.1%-0.5% 碳酸鈣，0.3%-0.5% 氯化鈉，2.0%-2.5% 瓊脂。
7.根據權利要求3所述的一種土霉素高產菌株高通量篩選方法，其特征在于:所述的步驟E和步驟F中所用的種子培養(yǎng)基成分及其含量為:2.0%-3.0%玉米淀粉，0.2%-0.5%玉米漿，2.0%-3.0%黃豆粉，0.1%-0.3%硫酸銨，0.1%-0.5%碳酸鈣，0.3%-0.5%氯化鈉。
8.根據權利要求3所述的一種土霉素高產菌株高通量篩選方法，其特征在于:所述的步驟E和步驟F中所用的發(fā)酵培養(yǎng)基成分及其含量為:10%-15%玉米淀粉，0.2%-0.5%玉米漿，2.0%-3.0%黃豆粉，1.0%-1.5%硫酸銨，1.0%-1.5%碳酸鈣，0.3%_0.5%氯化鈉，.0.01%-0.05%磷酸二氫鉀，0.1%-0.3%聚醚消沫劑。
【文檔編號】C12N1/20GK103789245SQ201410087566
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年3月11日 優(yōu)先權日:2014年3月11日
【發(fā)明者】張慧, 趙麗紅, 鄭萬靜 申請人:河北圣雪大成制藥有限責任公司