一種產(chǎn)表面活性劑微生物的高通量篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物育種，尤其是涉及一種產(chǎn)表面活性劑微生物的高通量篩選方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前可利用的生物表面活性劑非常有限，而要解決生物表面活性劑應(yīng)用受到限制 的問題，需要篩選獲得更多新型、高產(chǎn)的生物表面活性劑產(chǎn)生菌。在建立簡便準確的菌株活 性評價方法的基礎(chǔ)上從自然界篩選或?qū)ΜF(xiàn)有菌株進行遺傳物質(zhì)改造一直是獲得優(yōu)良菌種 的重要途徑。
[0003] 由于大量的菌株需要定性，因此高效的篩選策略是分離得到所需微生物的關(guān)鍵， 為此，人們不斷開發(fā)與完善各種篩選模型，對現(xiàn)有的篩選技術(shù)也在進行改進。目前，廣泛應(yīng) 用的是排油圈篩選法，通過觀察發(fā)酵液能否在形成油層的水面上產(chǎn)生排油圈以及測定排油 圈的大小來衡量發(fā)酵液的表面活性，該方法適應(yīng)性廣泛，操作相對簡單，經(jīng)適當改進已成 功進行多種表面活性劑高產(chǎn)菌株的篩選，但是該方法本身存在很大局限性，需要人為進行 排油圈直徑的測定，此過程不僅需消耗大量人力和時間，且易增大實驗誤差，不適用于樣 品較多的初篩工作，無法滿足高通量篩選及標準化檢測的需求。另外，血平板篩選法、藍 色凝膠平板法和原油平板法也是常用的表面活性劑產(chǎn)生菌篩選方法，這三種方法雖然具 有簡便直觀、工作量小的優(yōu)勢，但是卻存在較嚴重的假陽性和假陰性問題，而且在適用范 圍上具有自身難以克服的局限性，如血平板不能用于篩選利用石油烴才能產(chǎn)表面活性劑 的微生物（1.BanatI.M.Theisolationofathermophilicbiosurfactantproducing Bacillussp. [J].Biotechnologyletters, 1993, 15(6) : 591-594.)，藍色凝膠平板法僅適 用于產(chǎn)糖脂及陰離子表面活性劑微生物的篩選（2.SiegmundI.，WagnerF.Newmethodfor detectingrhamnolipidsexcretedbyPseudomonasspeciesduringgrowthonmineral agar[J].BiotechnologyTechniques, 1991，5(4) :265_268.)，而原油平板法只適用于利用 烴的微生物（3. 丁立孝，何國慶，劉曄等.脂肽生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選[J].農(nóng)業(yè) 生物技術(shù)學報，2004, 12(3) :330-333.)。在各種表面活性劑產(chǎn)生菌篩選方法中最準確的是 表面張力測定法，該法雖然靈敏準確，但是操作繁瑣，工作量大，而且需要專門儀器和足夠 的未經(jīng)稀釋的樣品，不適用于針對大量菌株的初篩工作。
[0004] 相比上述篩選方法，液滴崩塌法具有很大優(yōu)勢，不僅操作簡單、現(xiàn)象直觀，而且適 用范圍廣泛、靈敏°C和準確°C俱佳。同時，不需要昂貴的儀器，樣品也僅需幾yL。該法是 在一個有96微孔板蓋上進行的，蓋中每個微孔中都覆蓋有一薄層油，然后加入發(fā)酵液，觀 察油層是聚集或輕微分散或完全分散來判斷生物表面活劑的量。1991年D.K.Jain率先 采用該法檢測不同細菌發(fā)酵液的表面活性（4.JainD.K.，Collins-ThompsonD.L.，Lee H.,TrevorsJ.T.Adrop-collapsingtestforscreeningsurfactant-producing microorganisms[J].JournalofMicrobiologicalMethods, 1991, 13(4):271-279.), 1998年AdriaA.Bodour對油的種類和體積進行了優(yōu)化，使該法具有更高的靈敏°0和準 石角。C(5.BodourA.A. ,Miller-MaierR.M.Applicationofamodifieddrop-collapse techniqueforsurfactantquantitationandscreeningofbiosurfactant-producing microorganisms[J].JournalofMicrobiologicalMethods, 1998, 32(3):273-280.)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供工作量小、效率高而且成本低廉的一種產(chǎn)表面活性劑微生 物的高通量篩選方法。
[0006] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0007] 1)清潔和烘干96孔板蓋；
[0008] 2)用移液器向96孔板各孔中加入2yL10W-40Pennzoil?并放于恒溫箱中靜置 直至形成平整的油膜，備用；
[0009] 3)待測菌株接種于裝有種子培養(yǎng)液的深孔板中孔活化及恒溫震蕩培養(yǎng)1~2天， 得種子發(fā)酵液；
[0010] 4)將種子發(fā)酵液轉(zhuǎn)接于另一個盛有發(fā)酵培養(yǎng)液的深孔板中震蕩培養(yǎng)，得發(fā)酵液；
[0011] 5)利用深孔板離心機離心發(fā)酵液，取發(fā)酵上清液作為后續(xù)檢測樣品；
[0012] 6)用移液器吸取發(fā)酵上清液至鋪有平整油膜的96孔板蓋對應(yīng)孔中；觀察發(fā)酵上 清液液滴是否擴散或崩塌，或者比較各孔液滴擴散或崩塌的速度，若在較短時間內(nèi)即擴散 或崩塌，則將相應(yīng)菌株記錄為產(chǎn)表面活性劑陽性菌株，否則，即為不產(chǎn)表面活性劑菌株。
[0013] 在步驟1)中，所述清潔和烘干96孔板蓋的方法可為：對于尚未鋪油的96孔板蓋， 先用洗潔精清洗2次；再依次用自來水、50~65°C熱水、乙醇和蒸餾水各清洗3次，將96 孔板蓋朝下晾干或吹干備用；對于已過鋪油的96孔板蓋，先用紙巾擦去部分發(fā)酵液和乳化 油；再用柴油清洗剩余的潤滑油2次，再用洗潔精清洗96孔板內(nèi)蓋3次，再依次用自來水、 50~65°C熱水、乙醇和蒸餾水清洗3次，將96孔板蓋朝下晾干或吹干備用。
[0014] 在步驟2)中，所述移液器可采用多通道移液槍；所述多通道移液槍可選自6通道 移液槍、8通道移液槍、12通道移液槍、96通道移液槍等中的一種。
[0015] 在步驟3)中，所述種子培養(yǎng)液的配方可為：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉 5g/L，pH用1M的NaOH溶液調(diào)至7. 6 ;所述活化可將菌株在瓊脂平板上劃線活化；所述培養(yǎng) 的條件可取單菌落接種于各孔中盛有200yL種子發(fā)酵液的96孔深孔板中，28~32°C培養(yǎng) 16 ~24h。
[0016] 在步驟4)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)液和配方可為：葡萄糖10g/L，谷氨酸0.6g/L，氯化 按2g/L，磷酸二氫鉀2g/L，磷酸氫二鉀5g/L，七水合硫酸鎂0. 5g/L，氯化鈉24g/L，pH用1M NaOH溶液調(diào)至7. 6 ;所述震蕩培養(yǎng)的條件可于28~32°C，200rpm震蕩培養(yǎng)4~7天。
[0017] 本發(fā)明以96孔板作為發(fā)酵容器，每孔裝液200yL，節(jié)省培養(yǎng)液，成本大幅降低；本 發(fā)明以多通道移液槍（6通道，8通道或12通道移液器）進行接種取樣稀釋等操作，每次操 作可以相應(yīng)完成6~12個樣品的接種、取樣或稀釋，實現(xiàn)操作的批量化，提高了操作效率； 本發(fā)明高通量篩選方法每個樣品只需要5yL左右，每板96個樣品檢測操作時間只需要約 5min，大大縮短了操作所需時間，提高了檢測效率。本發(fā)明以微孔板為操作平臺的微生物培 養(yǎng)及表面活性測定方法的建立，為菌種篩選過程中實現(xiàn)高通量奠定了基礎(chǔ)。微孔板體系的 菌株篩選方法具有微量化、小型化和平行化的特點，因此采用高通量策略篩選高效礦化微 生物能同時處理大量樣品，節(jié)省人力、物力及時間，大幅提高篩選效率。
[0018] 本發(fā)明在A.A.Bodour研宄的基礎(chǔ)上，采用