一種血清淀粉樣蛋白a及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種血清淀粉樣蛋白A及其編碼基因和應(yīng)用。血清淀粉樣蛋白A基因，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1的第148位-567位堿基所示。血清淀粉樣蛋白A，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。該基因在軟體動(dòng)物中屬于首次發(fā)現(xiàn)，目前該基因除了在脊椎動(dòng)物中有發(fā)現(xiàn)之外，在無(wú)脊椎動(dòng)物中則只有在棘皮動(dòng)物有所發(fā)現(xiàn)。定量PCR實(shí)驗(yàn)表明，牡蠣SAA在細(xì)菌感染后顯著上調(diào)，與哺乳動(dòng)物極為相似，因此該基因也可以作為檢測(cè)牡蠣健康狀況的金標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)檢測(cè)該基因可以隨時(shí)監(jiān)測(cè)牡蠣的健康狀況，對(duì)于牡蠣疾病的預(yù)防提供一個(gè)積極而準(zhǔn)確的警戒信號(hào)，防止了災(zāi)害的擴(kuò)大。該技術(shù)的應(yīng)用，將進(jìn)一步提升養(yǎng)殖貝類(lèi)的種質(zhì)創(chuàng)新能力，支撐產(chǎn)業(yè)的高效可持續(xù)性發(fā)展。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種血清淀粉樣蛋白A及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種血清淀粉樣蛋白A及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】:
[0002]作為世界上最大的貝類(lèi)養(yǎng)殖國(guó)，我國(guó)的貝類(lèi)養(yǎng)殖已經(jīng)成為沿海海水養(yǎng)殖業(yè)的支柱之一。我國(guó)貝類(lèi)年產(chǎn)量占世界貝類(lèi)總產(chǎn)量的60%以上。據(jù)2012年商務(wù)部統(tǒng)計(jì)，2011年，我國(guó)海洋貝類(lèi)養(yǎng)殖產(chǎn)量為1179.6萬(wàn)噸，其中牡蠣375.63萬(wàn)噸，經(jīng)濟(jì)價(jià)值達(dá)到200多億元人民幣，占海水貝類(lèi)養(yǎng)殖產(chǎn)量的30 %以上，因此，牡蠣的養(yǎng)殖在我國(guó)沿海經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展中占據(jù)舉足輕重的地位，并具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。但是，我?guó)海洋貝類(lèi)的發(fā)展是以傳統(tǒng)養(yǎng)殖育種為主，以面積、能耗為代價(jià)的，產(chǎn)量因各種條件變化而波動(dòng)，而且，由于缺乏有效的疾病檢測(cè)手段，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，對(duì)于牡蠣養(yǎng)殖的風(fēng)險(xiǎn)也越來(lái)越大。以太平洋牡蠣為例，大規(guī)模死亡事件頻繁發(fā)生，甚至一些養(yǎng)殖的二齡牡蠣死亡率也達(dá)到40%-50%，有的高達(dá)70%-80%，有的養(yǎng)殖場(chǎng)的牡蠣?zhēng)缀跞克拦?。引起牡蠣死亡的原因很多，其中致病菌及寄生蟲(chóng)的侵害加重了牡蠣的大量死亡，特別是在水交換差、水質(zhì)欠佳的高溫季節(jié)更易使牡蠣患病死亡。因此，建立實(shí)時(shí)的牡蠣養(yǎng)殖病害的預(yù)防防治機(jī)制，是人們所亟待解決的問(wèn)題之一。
[0003]血清淀粉樣蛋白A (serum amyloid A, SAA)屬于載脂蛋白家族成員，是目前應(yīng)用最為廣泛的病理檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。在人類(lèi)等脊椎動(dòng)物中，SAA已經(jīng)被開(kāi)發(fā)成型的試劑盒，廣泛的應(yīng)用于甄別宿主的健康與否。環(huán)境脅迫、創(chuàng)傷以及病原菌感染均能引起SAA的急性顯著性應(yīng)答，這些因素使該蛋白具有廣闊的應(yīng)用前景。而且，該蛋白正常情況下表達(dá)水平不高，而病理情況下的表達(dá)高達(dá)正 常水平的數(shù)百倍至數(shù)千倍，從而提高了儀器檢驗(yàn)的靈敏度，檢測(cè)手段的可操作性大大提高。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0004]本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一個(gè)牡蠣的病理檢測(cè)的標(biāo)志性基因，即血清淀粉樣蛋白 A (serum amyloid A, SAA)基因。
[0005]本發(fā)明的血清淀粉樣蛋白A基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1的第148位-567位堿基所示。
[0006]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供血清淀粉樣蛋白A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID N0.2 所示。
[0007]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供血清淀粉樣蛋白A基因作為牡蠣健康狀況的標(biāo)志性基因在制備牡蠣的病理檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明在香港巨牡蠣轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)牡蠣的病理檢測(cè)的標(biāo)志性基因，即血清淀粉樣蛋白A (serum amyloid A, SAA)基因。通過(guò)RACE技術(shù)，我們獲得了該基因的全長(zhǎng)，該基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1的148bp-567bp所示，其編碼的血清淀粉樣蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。該基因的核酸序列具有高度的物種特異性，其核酸序列約有40-60%同源于已知其他物種的SAA基因，該基因在軟體動(dòng)物中屬于首次發(fā)現(xiàn)，目前該基因除了在脊椎動(dòng)物中有發(fā)現(xiàn)之外，在無(wú)脊椎動(dòng)物中則只有在棘皮動(dòng)物有所發(fā)現(xiàn)。定量PCR實(shí)驗(yàn)表明，牡蠣SAA在細(xì)菌感染后顯著上調(diào)，與哺乳動(dòng)物極為相似，因此，該基因也可以作為檢測(cè)牡蠣健康狀況的金標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)檢測(cè)該基因可以隨時(shí)監(jiān)測(cè)牡蠣的健康狀況，對(duì)于牡蠣疾病的預(yù)防提供一個(gè)積極而準(zhǔn)確的警戒信號(hào)，防止了災(zāi)害的擴(kuò)大。該技術(shù)的應(yīng)用，將進(jìn)一步提升養(yǎng)殖貝類(lèi)的種質(zhì)創(chuàng)新能力，支撐產(chǎn)業(yè)的高效可持續(xù)性發(fā)展。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0009]圖1.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SAA mRNA在不同組織中的分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SAA在性腺、外套膜與觸唇中有顯著性表達(dá)，在鰓、心臟、閉殼肌和消化腺中有中度表達(dá)，在血細(xì)胞幾乎無(wú)表達(dá)。
[0010]圖2.病原菌刺激誘導(dǎo)SAA的表達(dá)。溶藻弧菌(A)、葡萄球菌圖(B)與酵母菌圖(C)等病原菌分別刺激后，血細(xì)胞中SAA的表達(dá)顯著上調(diào)。星號(hào)(**)指示和對(duì)照組差異極其顯著。
【具體實(shí)施方式】:
[0011]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0012]實(shí)施例1:
[0013]一、RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
[0014]a).香港巨牡販細(xì)胞或組織加Trizol后,采用組織研磨器研磨,室溫放置5min,使其充分裂解。
[0015]b).12，OOOrpm 離心 5min,棄沉淀。
[0016]c).按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿,振蕩混勻后室溫放置15min。
[0017]d).4°C 12，OOOg 離心 15min。
[0018]e).吸取上層水相，至另一離心管中。
[0019]f).按0.5ml異丙醇/ml Trizol加入異丙醇混勻，室溫放置5_10min。
[0020]g).4°C 12，OOOg 離心 lOmin，棄上清，RNA 沉于管底。
[0021]h).按lml75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。
[0022]i).4°C 8, OOOg 離心 5min,盡量棄上清。
[0023]j).室溫晾干或真空干燥5-10min。
[0024]k).可用 50ul H20, TE buffer 或 0.5%SDS 溶解 RNA 樣品，55_60°C，5-lOmin。
[0025]l).在室溫孵育 15min 之后，加入 250 μ L DNase Stop Solution (DSA),在
13,000 X g 離心 lmin。
[0026]m).重復(fù)步驟a-j，加IOOyL無(wú)核酸酶水，然后，在13，OOOXg離心lmin，棄離心柱，使用分光光度計(jì)測(cè)量所收集的溶液中的RNA的濃度，分裝后，貯存于_80°C。
[0027]η).第一條鏈cDNA的合成
[0028]l)DNase I 消化
[0029]按照如下組分分別將各組的RNA加入到PCR離心管中
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一種血清淀粉樣蛋白A基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1的第148位-567位堿基所示。
2.一種血清淀粉樣蛋白A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.權(quán)利要求1所述的血清淀粉樣蛋白A基因作為牡蠣健康狀況的標(biāo)志性基因在制備牡蠣的病理檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/12GK103834663SQ201410084163
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】向志明, 瞿符發(fā), 肖述, 喻子牛 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所