一種生物轉(zhuǎn)化植物甾醇制備甾體藥物中間體的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種生物轉(zhuǎn)化植物甾醇制備甾體藥物中間體的方法，包括以下步驟：1）提供植物甾醇的懸濁液；2）提供一種將植物甾醇轉(zhuǎn)化為甾體藥物中間體的微生物菌種的靜息細(xì)胞；3）將所述植物甾醇的懸濁液以及所述靜息細(xì)胞混合，并加入β-環(huán)糊精或化學(xué)修飾后的β-環(huán)糊精充分混勻，培養(yǎng)完成轉(zhuǎn)化；4）將步驟3）所得轉(zhuǎn)化液離心，分離上清和菌體，經(jīng)溶劑提取從上清中分離得到所述甾體藥物中間體。本發(fā)明提供的方法在提高了甾醇投料濃度、增加目的產(chǎn)物量、縮短轉(zhuǎn)化持續(xù)時間的同時，還同時實現(xiàn)了菌體、助溶劑以及產(chǎn)物的簡易分離，并實現(xiàn)了菌體與助溶劑的多次重復(fù)使用，大大節(jié)省了生產(chǎn)成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種生物轉(zhuǎn)化植物留醇制備留體藥物中間體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及留醇生物轉(zhuǎn)化【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地涉及一種生物轉(zhuǎn)化植物留醇制備甾體藥物中間體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]留體化合物是一類以環(huán)戊烷多氫菲為母核，結(jié)構(gòu)相似的化合物，廣泛存在于動植物組織和某些微生物細(xì)胞中，比較常見的有植物留醇、膽固醇、雄酮以及薯蕷皂素等。甾體化合物是生產(chǎn)留體藥物的重要原料。留體藥物對機(jī)體起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，是僅次于抗生素的第二大類藥物。在醫(yī)藥上占有重要地位的激素類藥物的主要成分如氫化可的松，睪酮、雄酮、孕酮和雌二酮等，都是具有留體結(jié)構(gòu)的藥物。雄-4-烯-3，17-二酮(AD)，雄-1，4- 二烯-3，17- 二酮(ADD)和 9-羥基-雄-4-烯-3，17- 二酮(9-0H-AD)是留體藥物不可替代的中間體。留體藥物中間體、留體化合物和各種留體藥物都含有相同的環(huán)戊烷多氫菲的母核結(jié)構(gòu)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有很多種微生物可以利用植物留醇轉(zhuǎn)化成這幾種留體藥物中間體。這些微生物包括節(jié)細(xì)菌、桿菌、分枝桿菌、諾卡氏菌以及短桿菌等。
[0003]長期以來，AD和ADD —直都被用作合成雄性激素和同化類藥物的前體物質(zhì)。而9-0H-AD在合成制備如皮質(zhì)類固醇等藥物中是一類重要的前體化合物。9-0H-AD的開發(fā)利用已成為近年的研究熱點，因為該中間體可用于合成糖皮質(zhì)激素、抗炎藥和含有F、Cl等鹵元素的高效皮質(zhì)激素，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)上9-0H的存在，借助常規(guī)的化學(xué)合成手段形成C9, 11-雙鍵體系，從而順利的在C9-位引入一個鹵原子，Cll β -位形成必不可少的功能羥基。這就可解決國內(nèi)現(xiàn)有薯蕷皂素工藝路線的瓶頸問題一霉菌轉(zhuǎn)化環(huán)氧黃體酮的CU-羥基化的低效性問題，可對國內(nèi)已有的9-鹵(F、Cl)皮質(zhì)激素生產(chǎn)，如地塞米松、倍他米松以及Cll-酮結(jié)構(gòu)，如可的松、強(qiáng)的松合成工藝整合進(jìn)行皮質(zhì)激素生產(chǎn)產(chǎn)生巨大的影響。早在1979年美國普強(qiáng)制藥公司報道利用偶發(fā)分枝桿菌突變株發(fā)酵谷留醇斷側(cè)鏈，有效積累有用中間體9-0H-AD，以此中間體經(jīng)7步化學(xué)合成，制得乙酸氫化可的松，總收率達(dá)36.7%。
[0004]然而植物留醇是一類疏水性化合物，水中的溶解度非常低，限制了其生物利用度；且植物留醇(底物)、AD、ADD和9-0H-AD(產(chǎn)物)可能抑制和毒害微生物，限制了底物投料量和產(chǎn)物的積累量。留醇的低溶解性會引起傳質(zhì)障礙，并且留醇對菌體有一定的毒性是植物甾醇轉(zhuǎn)化的瓶頸問題，所以留醇轉(zhuǎn)化效率往往很低。研究者們采取過很多措施來促進(jìn)甾醇轉(zhuǎn)化。在水相轉(zhuǎn)化體系中，通過添加表面活性劑、環(huán)糊精和有機(jī)溶劑等助溶劑來增加甾醇轉(zhuǎn)化率。除此以外，兩相體系和乳化體系同樣也用來提高植物留醇的生物轉(zhuǎn)化效率?，F(xiàn)有技術(shù)中，也報道了一些通過添加乙醇、甘油等有機(jī)溶劑的單相發(fā)酵體系，能夠提高留醇類物質(zhì)的溶解性，提高微生物的生物轉(zhuǎn)化率。W09949075A1公開了一種植物甾醇向AD和ADD的微生物轉(zhuǎn)化方法，并具體公開以下技術(shù)特征:利用一種培養(yǎng)基增殖分枝桿菌屬的分枝桿菌MB3683菌種；利用一種或多種增溶劑將植物留醇組合物溶解成溶液；將分枝桿菌MB3683培養(yǎng)物和植物留醇組合物溶液置于生物反應(yīng)器中，并保持足夠的時間，將植物留醇組合物轉(zhuǎn)化為 AD、ADD。[0005]此外還有一種利用與水不相容的有機(jī)溶劑如辛醇等，與發(fā)酵液形成不相容的雙液相系統(tǒng)，該系統(tǒng)的優(yōu)點是留醇物質(zhì)的溶解度和生物轉(zhuǎn)化率都有比較明顯的提高，而且AD和ADD幾乎全部集中在有機(jī)相，分離比較容易，但缺點是溶劑對微生物的毒害作用、以及由于溶劑揮發(fā)所產(chǎn)生的安全問題，均不利于工業(yè)推廣。
[0006]現(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)方法大多是含油發(fā)酵，并且是生長細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)化方法，即是在微生物細(xì)胞培養(yǎng)前或培養(yǎng)一段時間后，將底物直接加到微生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，微生物在自身繁殖生長的同時對底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。這是生物轉(zhuǎn)化法最簡單和最常用的一種方法。該法的優(yōu)點是微生物轉(zhuǎn)化生物轉(zhuǎn)化容易，缺點是產(chǎn)品的發(fā)酵時間長，易產(chǎn)生多種產(chǎn)物，處理分離純化困難。如CN03804973中說明，按照1%的投料濃度時，植物甾醇轉(zhuǎn)化為AD/ADD的時間在87-91h。如果降低底物的投料濃度，反應(yīng)時間可以縮短，但相應(yīng)工業(yè)成本會大大提高。經(jīng)過大約120-168h的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)AD和ADD，然后用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑將AD和ADD進(jìn)行萃取、分離、結(jié)晶并精制，即可得到白色的結(jié)晶粉末狀的AD和ADD。中國專利CN101525651A公開了一種雙液相系統(tǒng)中生物降解植物留醇制備雄烯二酮的方法，該專利通過添加葵花油作為有機(jī)相，與水相發(fā)酵液形成油水雙液相培養(yǎng)系統(tǒng)，并利用分枝桿菌Mycobacterium sp_UV_8在此系統(tǒng)中繁殖并有效轉(zhuǎn)化植物留醇生產(chǎn)AD，整體轉(zhuǎn)化率在80%左右，但是該系統(tǒng)中葵花油優(yōu)良至少達(dá)到20%V/V，而投料量卻只有0.6%，雖然其轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到80%，但是單次生產(chǎn)量仍然很低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到要求。
[0007]名為“一種采用靜息細(xì)胞在濁點系統(tǒng)中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化”(CN200310108967)的中國專利中提到，利用分枝桿菌Mycobacterium NRRL B-3683靜息細(xì)胞在池點系統(tǒng)發(fā)酵膽固醇得到雄-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)。但是由于該濁點系統(tǒng)需要使用非離子表面活性劑triton XlOO或114，這類表面活性劑一般對菌體有害，并且從生態(tài)學(xué)角度看，它們接觸地下水，水道或者污水系統(tǒng)，即使少量產(chǎn)品滲入地下水就會對水體造成危害，若無政府許可，勿將材料排入周圍環(huán)境，實現(xiàn)工業(yè)化困難。同時該專利發(fā)明人在《中國工程科學(xué)》2005年7卷5期73-78頁《兩相分配生物反應(yīng)器一濁點系統(tǒng)在生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用》中提到“有關(guān)大規(guī)模表面活性劑回收工藝的報道不多，進(jìn)一步研究產(chǎn)物與濁點系統(tǒng)中表面活性劑的分離工藝對完善濁點系統(tǒng)在生物過程`中的應(yīng)用具有實際意義?！闭f明濁點系統(tǒng)中表面活性劑的回收問題尚未解決。
[0008]中國專利CN101760494A公開了一種采用靜息細(xì)胞的雄烯二酮的生物發(fā)酵方法，該專利所述的發(fā)酵方法將具有降解植物留醇得到AD和ADD的微生物菌種的靜息細(xì)胞，加入到植物留醇轉(zhuǎn)化液中進(jìn)行第一次靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，使轉(zhuǎn)化液中植物留醇轉(zhuǎn)化得到AD和ADD結(jié)束后，去除菌體細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)化液經(jīng)溶劑提取得到AD和ADD。該方法的實質(zhì)為兩步培養(yǎng)法，首先獲得菌體然后進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。該專利敘述中，菌體濃度有限，留醇投料較低，菌體重復(fù)使用次數(shù)有限，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。且未有效添加菌體保護(hù)物質(zhì)(或抗留醇毒性或抗雜菌污染)，菌種容易退化并有染菌甚至是感染濕噬菌體的風(fēng)險。
[0009]綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)的缺陷主要集中于以下幾點:
[0010]I)常規(guī)生長細(xì)胞發(fā)酵法發(fā)酵時間長，菌體濃度有限，留醇投料量有限；如果降低底物的投料濃度，雖然反應(yīng)時間可以縮短，但相應(yīng)工業(yè)成本會大大提高。
[0011]2)現(xiàn)有技術(shù)中使用到的助溶劑有非離子表面活性劑triton XlOO或114，這類表面活性劑一般回收問題尚未解決，不能有效的重復(fù)使用，且會使產(chǎn)品分離純化困難。并且一般表面活性劑一是對水體有害，屬于環(huán)境不友好物質(zhì)；二是對菌體有害，若加的少不足以起到助溶作用，若加量大會限制留醇底物投料量。
[0012]3)現(xiàn)有技術(shù)中會用到的作為助溶劑使用的表面活性劑或有機(jī)溶劑，其中，表面活性劑引起發(fā)酵過程泡沫問題嚴(yán)重，染菌風(fēng)險大；有機(jī)溶劑對微生物的毒害作用、以及由于溶劑揮發(fā)所產(chǎn)生的安全問題，均不利于工業(yè)推廣。
[0013]4)普通的靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法，菌體與留體化合物難分離，菌體易退化，菌體重復(fù)使用率低，且存在染菌風(fēng)險。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明的目的是提供一種生物轉(zhuǎn)化植物留醇制備留體藥物中間體的方法，從而克服現(xiàn)有技術(shù)中底物投料量低，菌體濃度有限，反應(yīng)時間長，助溶劑回收困難，且對菌體以及環(huán)境有害的缺陷。
[0015]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0016]提供一種生物轉(zhuǎn)化植物留醇制備留體藥物中間體的方法，包括以下步驟:1)提供植物留醇的懸濁液；2)提供一種將植物留醇轉(zhuǎn)化為留體藥物中間體的微生物菌種的靜息細(xì)胞；3)將所述植物留醇的懸濁液以及所述靜息細(xì)胞混合，并加入β -環(huán)糊精或化學(xué)修飾后的β -環(huán)糊精充分混勻，培養(yǎng)完成轉(zhuǎn)化；4)將步驟3)所得轉(zhuǎn)化液離心，分離上清和菌體，經(jīng)溶劑提取從上清中分離得到所述留體藥物中間體。
[0017]通過將β -環(huán)糊精或化學(xué)修飾后的β -環(huán)糊精加入反應(yīng)溶液作為助溶劑使用，使得菌體的靜息細(xì)胞呈現(xiàn)較好的分散狀態(tài)，不僅有利于轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行，而且有利于菌體的分離；其次，由于環(huán)糊精或化學(xué)修飾后的環(huán)糊精的自身高溶解度以及對植物留醇的高助溶作用，在分離上清和菌體的過程中，這種助溶劑絕大部分處于水相中，且在轉(zhuǎn)化過程中，這種助溶劑的無毒性質(zhì)使菌體的活性得以較好的保持。
[0018]所述步驟4)中分離獲得的菌體和/或上清經(jīng)溶劑提取后獲得的水相中的β -環(huán)糊精或化學(xué)修飾后的β_環(huán)糊精直接重復(fù)使用。
[0019]所述微生物菌種是缺失了 1，2_脫氫酶(KstD)的分枝桿菌，或強(qiáng)化了 1，2_脫氫酶(KstD)的分枝桿菌，或先缺失了 1，2_脫氫酶(KstD)，后強(qiáng)化了 9-羥基化酶(KsH)的分枝桿菌。
[0020]所述化學(xué)修飾后的β -環(huán)糊精選自:甲基-環(huán)糊精、羥基-環(huán)糊精、磺酰基-β -環(huán)糊精或羥丙基-β -環(huán)糊精，優(yōu)選為羥丙基-β -環(huán)糊精或甲基-β -環(huán)糊精。其中，羥丙基-β -環(huán)糊精在水中溶解度高達(dá)600-800g/L，而且不溶于有機(jī)溶劑，通過有機(jī)溶劑的萃取，方便其與產(chǎn)物的分離。
[0021]所述植物留醇選自:谷留醇，豆留醇，菜油留醇，菜籽留醇中的至少一種或者任意混合物。
[0022]所述甾體藥物中間體包括:雄-4-烯-3，17-二酮(AD)，雄-1,4-二烯-3，17-二酮(ADD)或 9-羥基-雄-4-烯-3，17- 二酮(9-0H-AD)。
[0023]所述靜息細(xì)胞通過采用兩級種子培養(yǎng)法培養(yǎng)所述微生物菌種獲得。通過兩級種子擴(kuò)大培養(yǎng)增強(qiáng)了菌體的生長能力。
[0024]所述微生 物菌種經(jīng)過兩級種子培養(yǎng)法培養(yǎng)之后，還包括轉(zhuǎn)入生長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，從而更有利于轉(zhuǎn)化。
[0025]所述生長培養(yǎng)基的配方如下:葡萄糖20g/L，檸檬酸2g/L，(NH4) 2HP043.5g/L，檸檬酸鐵銨 0.05g/L, K2HPO4.3Η200.5g/L，MgSO4.7Η200.5g/L，可溶性淀粉 2g/L，玉米漿 lg/L。該培養(yǎng)基的配方是發(fā)明人通過實驗摸索優(yōu)化而來，經(jīng)過實驗證明菌體經(jīng)過該生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)之后生長能力得到最大程度的提高。
[0026]所述步驟3 )中β -環(huán)糊精與植物甾醇的摩爾比為2:1到1:2之間，優(yōu)選為1:1。當(dāng)β-環(huán)糊精與植物甾醇的摩爾比1:1時為最好，既不會因過多的環(huán)糊精的加入使得體系粘稠性增加，也不會因環(huán)糊精量不夠而不能起到助溶包結(jié)作用。
[0027]所述步驟4)中所使用的溶劑優(yōu)選為乙酸乙酯。
[0028]本發(fā)明的方法還包括在靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中添加抗生素，目的是防止雜菌的生長，減少染菌風(fēng)險。
[0029]靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化與生長細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)化時間縮短，染菌風(fēng)險降低；菌體量可以調(diào)節(jié)，同時可以增大底物投料濃度，縮短轉(zhuǎn)化反應(yīng)時間；靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化需要的環(huán)糊精和菌體可以重復(fù)多次的利用，且與產(chǎn)物及環(huán)糊精之間分離方便。
[0030]本發(fā)明提供了一種高效的生物轉(zhuǎn)化植物留醇制備留體藥物中間體的方法，在提高了甾醇投料濃度、增加目的產(chǎn)物量、縮短轉(zhuǎn)化持續(xù)時間的同時，還同時實現(xiàn)了菌體、助溶劑以及產(chǎn)物的簡易分離，并實現(xiàn)了菌體與助溶劑的多次重復(fù)使用。本發(fā)明所提供的方法所獲得的植物留醇的轉(zhuǎn)化率接近100%，留體藥物中間體的產(chǎn)量高，菌體和助溶劑甚至可以重復(fù)使用高達(dá)8次，生產(chǎn)成本大大降低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1是根據(jù)本發(fā)明的多個優(yōu)選實施例的流程示意圖。
[0032]圖2是植物甾醇的代謝脈絡(luò)圖。
【具體實施方式】
[0033]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。應(yīng)當(dāng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0034]1.材料與方法
[0035]1.1 材料
[0036]1.1.1 菌種
[0037]本發(fā)明的實施例主要采用了三支菌株，分別是通過分子改造構(gòu)建的分枝桿菌菌株Mycobacterium neoaurum NwIB—02、Mycobacterium neoaurum NwIB—04、Mycobacteriumneoaurum NwIB- V 0
[0038]其中，Mycobacteriumneoaurum NwIB-02 是以 Mycobacterium neoaurumNwIBOl 為出發(fā)菌株(保藏號為 CCTCCM209094，參見文獻(xiàn) l[Wei Wei，Shuyue Fan, FengqingWang,Dong zhi Wei (2010)A New Steroid-Transforming Strain of Mycobacteriumneoaurum and Cloning of3-Ketosteroid9 a -Hydroxylase in NwIB-01.Appl BiochemBiotechnol.162:1446 - 1456])，缺失了 1，2-脫氫酶(KstD)的分枝桿菌(參見文獻(xiàn) 2 [WeiWeij Feng-qing Wang, Shu-yue Fan, Dong-zhi Wei (2010)Inactivation and Augmentationof the Primary3-Ketosteroid-Δ1-Dehydrogenase in Mycobacterium neoaurumNwIB-Ol:Biotransformation of Soybean Phytosterols to4-Androstene_3，17—Dioneorl, 4-Androstadiene-3, 17-Dione.App1.Environ.Microbiol.76(13):134578-4582]。
[0039]Mycobacterium neoaurum NwIB-04是以Mycobacterium neoaurum NwIBOl 為出發(fā)菌株，強(qiáng)化了 1，2-脫氫酶(KstD)的分枝桿菌(同樣參見文獻(xiàn)2)。
[0040]Mycobacterium neoaurum NwIB- V是以 Mycobacterium neoaurum ATCC25795 為出發(fā)菌株，先缺失了 1，2_脫氫酶(KstD)，后強(qiáng)化了 9-羥基化酶(KsH)的分枝桿菌。根據(jù)本領(lǐng)域的公知常識以及上述信息可知，該菌株的構(gòu)建方法均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段，同時可參考上述 Mycobacterium neoaurum NwIB-02 和 Mycobacterium neoaurum NwIB-04 的構(gòu)建，具體參見上述文獻(xiàn)I和文獻(xiàn)2。
[0041 ] 其中，如圖2所示，植物留醇(谷留醇、豆留醇、菜油留醇和菜籽留醇)在分枝桿菌的作用下可轉(zhuǎn)化為雄-4-烯-3，17-二酮(AD)，雄-4-烯-3，17-二酮(AD)則可以在1，2-脫氫酶(KstD)作用下生成雄-1,4-二烯-3，17-二酮(ADD)，或者在9-羥基化酶(KsH)作用下生成9-羥基-雄-4-烯-3，17- 二酮(9-0H-AD)。
[0042]1.1.2儀器與分析條件
[0043]搖瓶轉(zhuǎn)化、種子培養(yǎng)、菌體培養(yǎng)在常規(guī)旋轉(zhuǎn)振蕩式搖床上進(jìn)行。
[0044]發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化、菌體準(zhǔn)備:保興發(fā)酵罐5L。
[0045]TLC分析:每隔一定時間取出的樣品，用4倍體積的乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，將3次萃取的乙酸乙酯合并，取IOyL點樣于薄層層析硅膠板HSGF254。展層劑為石油醚(60-900C )/乙酸乙酯(6:4，v/v)，展層結(jié)束后將20%濃硫酸噴灑于硅膠板，并置110°C烘烤10-15min顯色，定性觀察留醇 轉(zhuǎn)化情況。
[0046]HPLC:AD、ADD、9_0H_AD可以通過HPLC檢測。安捷倫1100液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為:Hypersil 0DS2,填料粒度:5 μ m,尺寸:4.6mmX 250mm,檢測波長254nm,檢測溫度40°C,流動相為甲醇:水(70:30，v/v)。
[0047]1.2實施方法
[0048]1.2.1 培養(yǎng)基
[0049]種子培養(yǎng)基MYC/01 (g/L):甘油20，檸檬酸2，NH4N032,檸檬酸鐵銨0.05，K2HPO4.3Η200.5，MgSO4.7Η200.5。初始 pH8,121°C，20min，滅菌備用。
[0050]生長培養(yǎng)基MYC/03 (g/L):葡萄糖20，檸檬酸2，(NH4) 2HP043.5，檸檬酸鐵銨0.05，K2HPO4.3Η200.5，MgSO4.7Η200.5，可溶性淀粉 2，玉米漿 I。初始 pH8,115°C，20min，滅菌備用。
[0051]1.2.2培養(yǎng)條件:
[0052]種子培養(yǎng):100mL種子培養(yǎng)基MYC/01( 1000mL搖瓶)，30°C,200rpm,培養(yǎng)周期2_3d。
[0053]菌體培養(yǎng):搖瓶培養(yǎng)，IOOmL生長培養(yǎng)基MYC/03 (1000mL搖瓶)，30°C，200rpm，培養(yǎng)周期2-3d。
[0054]甾醇轉(zhuǎn)化:搖瓶轉(zhuǎn)化IOOmL靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系(1000mL搖瓶)，30°C，200rpm,培養(yǎng)周期3d。發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化3L靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系(5L發(fā)酵罐)，30°C，通氣量0.5vvm。
[0055]1.2.3種子培養(yǎng):種子培養(yǎng)采取兩級種子培養(yǎng)。將甘油凍存的分枝桿菌接種到一級種子培養(yǎng)基MYC/01中，待生長達(dá)到對數(shù)中期時，以5%接種量接種到二級種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)中期。其中，二級種子培養(yǎng)基與一級種子培養(yǎng)基是一樣的，一級種子作為活化菌株用，二級種子作為擴(kuò)大培養(yǎng)增強(qiáng)菌體生長能力用。
[0056]1.2.4菌體培養(yǎng)過程:將準(zhǔn)備好的二級種子以10%接種量接種到生長培養(yǎng)基MYC/03中，培養(yǎng)3d，收集菌體。
[0057]1.2.5菌體收集處理過程:將培養(yǎng)好的菌體6000rpm, IOmin離心，以去離子水(pH8)洗兩遍,離心稱重菌體。
[0058]1.2.6植物留醇母液配制:因為植物留醇是微水溶性化合物，要提前將之配成均勻的懸濁液。植物留醇懸濁液配置的過程(每L):準(zhǔn)確稱量200g植物留醇粉末，加入少量水，置于電爐上攪拌邊加熱至留醇處于懸濁狀態(tài)，繼續(xù)加熱攪拌一段時間至留醇處于較均勻狀態(tài)后，移至磁力攪拌器中持續(xù)攪拌至室溫，備用。
[0059]1.2.7植物留醇轉(zhuǎn)化過程:轉(zhuǎn)化體系中，將β -環(huán)糊精或化學(xué)修飾后的β -環(huán)糊精及配好的植物留醇懸濁母液及備好的菌體，快速混合均勻，定容至體系額定體積。定期補(bǔ)充水量至額定體積。整個體系為去離子水(ρΗ8)。
[0060]1.2.8菌體的重復(fù)使用:β -環(huán)糊精或化學(xué)修飾后的β -環(huán)糊精的加入使得菌體與產(chǎn)物易于分離。此外，由于環(huán)糊精或化學(xué)修飾后的環(huán)糊精的加入，菌體還呈現(xiàn)非常好的分散狀態(tài)，易于反應(yīng)的進(jìn)行及菌體的分離。由于環(huán)糊精或化學(xué)修飾后的環(huán)糊精的高溶解度及對類固醇化合物的高助溶作用，經(jīng)離心沉淀菌體時，β -環(huán)糊精或化學(xué)修飾后的β_環(huán)糊精及體系中的類固醇絕大多數(shù)處于水相中，且在轉(zhuǎn)化過程中，β_環(huán)糊精或化學(xué)修飾后的環(huán)糊精的無毒性質(zhì)使菌體的活性可以較好的保持。離心后的菌體經(jīng)水或緩沖液洗滌后可以重復(fù)使用于第二次轉(zhuǎn)化，如此重復(fù)，菌體可以重復(fù)使用多次。[0061]1.2.9 β -環(huán)糊精的重復(fù)使用:雖然β -環(huán)糊精或化學(xué)修飾后的β -環(huán)糊精這種材料在價格上不是很有優(yōu)勢，但是本發(fā)明通過增加β_環(huán)糊精或化學(xué)修飾后的β_環(huán)糊精的使用次數(shù)進(jìn)而減少成本的投入。而β_環(huán)糊精或化學(xué)修飾后的β_環(huán)糊精本身屬于易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑的。在產(chǎn)物萃取時會使得產(chǎn)物與環(huán)糊精或化學(xué)修飾后的環(huán)糊精相分離，去除有機(jī)相后，水相中溶有的極少部分的產(chǎn)物，不妨礙環(huán)糊精或化學(xué)修飾后的環(huán)糊精的下一次使用，如此重復(fù)，環(huán)糊精或化學(xué)修飾后的環(huán)糊精可以重復(fù)使用多次。
[0062]1.2.10產(chǎn)物的分離:各轉(zhuǎn)化組所取樣品，以乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取液，先TLC初步觀察轉(zhuǎn)化情況后以HPLC測定具體含量。
[0063]如圖1所示，即為根據(jù)本發(fā)明的多個優(yōu)選實施例的流程示意圖。其中，植物甾醇并不限于圖中所列出的谷留醇，豆留醇，菜油留醇，菜籽留醇，還可以是其他植物留醇的混合物，而最終產(chǎn)物的種類則僅與菌株有關(guān)，與具體的留醇種類無關(guān)。
[0064]實施例1:
[0065]1.種子準(zhǔn)備與菌體培養(yǎng):將甘油凍存的分枝桿菌Mycobacterium neoaurumNwIB- V接種到一級種子培養(yǎng)基MYC/01中，待生長達(dá)到對數(shù)中期時(3d)，以5%接種量接種到二級種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)中期(2d)，再以10%接種量接種到生長培養(yǎng)基MYC/03，培養(yǎng)3d時收集菌體。
[0066]2.菌體收集處理過程:3d時收集菌體,6000rpm, IOmin離心，以去離子水(pH8)洗兩遍，離心稱重菌體得濕菌體重量為35g。[0067]3.靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程:1L搖瓶中設(shè)定額定轉(zhuǎn)化裝液量IOOmL,準(zhǔn)確量取植物甾醇母液50mL，稱量羥丙基-β-環(huán)糊精400g (與植物甾醇摩爾比為1:1)，稱量濕菌重10_15g，三者立刻充分混勻，定容至IOOmL,調(diào)節(jié)初始pH為8，培養(yǎng)4_5d。
[0068]4.轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液1000Orpm離心分離上清和菌體，將菌體以pH為8的去離子水洗一遍，離心分離上清和水。將兩次上清合并，以4倍體積的乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，將3次所得乙酸乙酯合并，TLC、HPLC檢測。
[0069]5.菌體重復(fù)步驟3，做菌體重復(fù)使用次數(shù)實驗；步驟4中獲得的乙酸乙酯萃余相，充分揮發(fā)掉殘留乙酸乙酯后，重復(fù)步驟3代替稱量的羥丙基環(huán)糊精，做環(huán)糊精重復(fù)使用實驗。
[0070]6.第一次靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗，經(jīng)HPLC測得植物留醇的轉(zhuǎn)化率接近100%，9_0H_AD產(chǎn)量50g/L，摩爾得率可以達(dá)到72%。
[0071]7.經(jīng)步驟5反復(fù)實驗8次，菌體及環(huán)糊精可以重復(fù)使用8次，第8次，9_0H_AD產(chǎn)量可以有45g/L。
[0072]實施例2:菌株及培養(yǎng)方法同實施例1，所不同為在5L發(fā)酵罐上做靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗。實驗證明，在5L發(fā)酵罐上進(jìn)行的轉(zhuǎn)化實驗基本獲得與搖瓶相似的實驗效果。
[0073]實施例3,4:同實施例1, 2,區(qū)別在于菌株為分枝桿菌Mycobacterium neoaurumNwIB-02 ο無論是1000mL搖瓶還是5L發(fā)酵罐，經(jīng)HPLC測得植物留醇的轉(zhuǎn)化率接近100%，AD產(chǎn)量37g/L。菌體及環(huán)糊精可以重復(fù)使用8次。
[0074]實施例5,6:同實施例1, 2,區(qū)別在于菌株為分枝桿菌Mycobacterium neoaurumNwIB-04 ο無論是1000mL搖瓶還是5L發(fā)酵罐，經(jīng)HPLC測得植物留醇的轉(zhuǎn)化率接近100%，ADD產(chǎn)量38g/L。菌體及環(huán)糊`精可以重復(fù)使用8次。
[0075]實施例7，8:同實施例1，2，區(qū)別僅在于助溶劑為甲基-β-環(huán)糊精。無論是1000mL搖瓶還是5L發(fā)酵罐，經(jīng)HPLC測得植物留醇的轉(zhuǎn)化率接近100%，9-0H-AD產(chǎn)量55g/L。菌體及環(huán)糊精可以重復(fù)使用8次。
[0076]根據(jù)上述實施例，本發(fā)明所提供的方法不僅適用于小規(guī)模的實驗室需求，而且適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
[0077]以上所述的，僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非用以限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的上述實施例還可以做出各種變化。即凡是依據(jù)本發(fā)明申請的權(quán)利要求書及說明書內(nèi)容所作的簡單、等效變化與修飾，皆落入本發(fā)明專利的權(quán)利要求保護(hù)范圍。本發(fā)明未詳盡描述的均為常規(guī)技術(shù)內(nèi)容。
【權(quán)利要求】
1.一種生物轉(zhuǎn)化植物留醇制備留體藥物中間體的方法，其特征在于，包括以下步驟: . 1)提供植物留醇的懸濁液； . 2)提供一種將植物留醇轉(zhuǎn)化為留體藥物中間體的微生物菌種的靜息細(xì)胞； . 3)將所述植物留醇的懸濁液以及所述靜息細(xì)胞混合，并加入β-環(huán)糊精或化學(xué)修飾后的β -環(huán)糊精充分混勻，培養(yǎng)完成轉(zhuǎn)化； . 4)將步驟3)所得轉(zhuǎn)化液離心，分離上清和菌體，經(jīng)溶劑提取從上清中分離得到所述甾體藥物中間體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟4)中分離獲得的菌體和/或上清經(jīng)溶劑提取后獲得的水相中的β_環(huán)糊精或化學(xué)修飾后的β_環(huán)糊精直接重復(fù)使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物菌種是缺失了1，2_脫氫酶的分枝桿菌，或強(qiáng)化了 1，2-脫氫酶的分枝桿菌，或先缺失了 1，2_脫氫酶，后強(qiáng)化了 9-羥基化酶的分枝桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)修飾后的環(huán)糊精選自:甲基-β -環(huán)糊精、羥基-β -環(huán)糊精、磺?；?β -環(huán)糊精或羥丙基-β -環(huán)糊精。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物留醇選自:谷留醇，豆留醇，菜油甾醇，菜籽留醇中的至少一種或者任意混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述甾體藥物中間體包括:雄-4-烯-3，17- 二酮，雄-1，4- 二烯-3，17- 二酮或 9-羥基-雄-4-烯-3，17- 二酮。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述靜息細(xì)胞通過采用兩級種子培養(yǎng)法培養(yǎng)所述微生物菌種獲得。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述微生物菌種經(jīng)過兩級種子培養(yǎng)法培養(yǎng)之后，還包括轉(zhuǎn)入生長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述生長培養(yǎng)基的配方如下:葡萄糖 20g/L,檸檬酸 2g/L，(NH4) 2ΗΡ043.5g/L，檸檬酸鐵銨 0.05g/L, K2HPO4.3Η200.5g/L，MgSO4.7H200.5g/L，可溶性淀粉 2g/L，玉米漿 lg/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中β-環(huán)糊精與植物留醇的摩爾比為2:1到1:2之間。
【文檔編號】C12P33/02GK103740799SQ201410027059
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】王學(xué)東, 高興強(qiáng), 馮建勛, 徐辛未, 何偉, 魏東芝 申請人:華東理工大學(xué)