含磷脂組合物的制造方法及含磷脂組合物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供含磷脂組合物整體中含有10重量％以上的磷脂酰絲氨酸、且構(gòu)成脂肪酸整體中高度不飽和脂肪酸的含量為10～40重量％的含磷脂組合物的制造方法，利用包括以下的工序(1)、(2)及工序(3)、(4)的方法，低價(jià)且穩(wěn)定地供給包含2位鍵合有大量高度不飽和脂肪酸的磷脂酰絲氨酸的含磷脂組合物。工序(1)：利用磷脂酶A2(PLA2)，進(jìn)行溶血磷脂與高度不飽和脂肪酸的酯化反應(yīng)，得到磷脂；工序(2)：在工序(1)之后，使磷脂中的PLA2活性為10U/g(磷脂)以下；工序(3)：在磷脂酶D(PLD)的存在下，進(jìn)行磷脂與絲氨酸的混合物中的堿交換反應(yīng)，形成包含磷脂酰絲氨酸的含磷脂組合物；工序(4)：分離該組合物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】含磯脂組合物的制造方法及含磯脂組合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及包含磯脂醜絲氨酸的含磯脂組合物的制造方法及含磯脂組合物。

【背景技術(shù)】
[0002] 磯脂醜絲氨酸被認(rèn)為對(duì)認(rèn)知功能障礙、記憶力、集中力的改善等腦功能的提高是 有效的，已知通過(guò)鍵合DHA(二十二碳六帰酸）其效果進(jìn)一步提高。DHA鍵合磯脂醜絲氨酸 可W通過(guò)從牛腦中萃取來(lái)生產(chǎn)，但出于瘋牛病的影響近年來(lái)沒(méi)有進(jìn)行。另外，已知DHA鍵合 磯脂醜絲氨酸可W通過(guò)在絲氨酸的存在下使磯脂酶D作用于DHA鍵合磯脂醜膽堿、DHA鍵 合磯脂醜己醇胺等來(lái)合成（專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。另外，關(guān)于作為DHA鍵合磯脂醜絲氨酸的原料的 DHA鍵合磯脂醜膽堿，有從包含大量多元不飽和脂肪酸的、金槍魚(yú)、纏魚(yú)、始魚(yú)、沙下魚(yú)、秋刀 魚(yú)、竹芙魚(yú)等魚(yú)類(lèi)的組織；由用包含多元不飽和脂肪酸的飼料飼養(yǎng)的雞得到的雞蛋中萃取 的方法（專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。另外，還已知將來(lái)自大豆的磯脂醜絲氨酸與海洋性的DHA鍵合磯脂 醜絲氨酸（絲氨酸甘油磯脂接合體）混合來(lái)使用的方法（專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。但是，該些方法中 原料高價(jià)，且供給不穩(wěn)定。
[0003] 另一方面，作為使DHA鍵合于磯脂來(lái)制作DHA鍵合磯脂的方法，有使用磯脂酶A2 將磯脂的2位的脂肪酸水解而得的溶血磯脂、或在市售的溶血磯脂中導(dǎo)入DHA的方法（專(zhuān) 利文獻(xiàn)3)。
[0004] 但是，在專(zhuān)利文獻(xiàn)3中記載的方法中，未進(jìn)行將磯脂的2位的脂肪酸水解時(shí)所使用 的磯脂酶A2的除去和失活操作，因此磯脂酶A2等量殘留，因而有時(shí)鍵合于溶血磯脂的DHA 在保存中經(jīng)時(shí)性脫離。另外，若想要將該DHA鍵合磯脂按照專(zhuān)利文獻(xiàn)1記載的方法進(jìn)行絲 氨酸化，則基于絲氨酸和磯脂酶D的絲氨酸化需要水，因而存在反應(yīng)中在2位發(fā)生水解的問(wèn) 題，未能高效地進(jìn)行DHA鍵合磯脂醜絲氨酸的合成。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) [000引專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0007] 專(zhuān)利文獻(xiàn)1 ;日本特開(kāi)平9 - 121879號(hào)公報(bào)
[0008] 專(zhuān)利文獻(xiàn)2 :日本特表2011 - 525525公報(bào)
[0009] 專(zhuān)利文獻(xiàn)3 ;日本特開(kāi)2010 - 068799號(hào)公報(bào)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 發(fā)明要解決的課題
[0011] 使用安全的原料低價(jià)且穩(wěn)定地供給大量鍵合有高度不飽和脂肪酸的磯脂醜絲氨 酸、尤其是DHA鍵合磯脂醜絲氨酸的方法尚未知。
[0012] 因此，本發(fā)明的目的在于，提供能夠低價(jià)且穩(wěn)定地供給包含2位鍵合有大量高度 不飽和脂肪酸的磯脂醜絲氨酸的含磯脂組合物的制造方法、W及包含大量鍵合有高度不飽 和脂肪酸的磯脂醜絲氨酸的含磯脂組合物。
[0013] 用于解決課題的手段
[0014] 本發(fā)明人為了解決上述課題而反復(fù)認(rèn)真研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，若W磯脂和高度不飽和 脂肪酸為原料，并實(shí)施包括特定的工序的制造方法，則能夠得到W高效率導(dǎo)入了高度不飽 和脂肪酸的含磯脂組合物，并完成了本發(fā)明。
[0015] 目P，本發(fā)明的第一發(fā)明涉及一種含磯脂組合物的制造方法，其是含磯脂組合物整 體中含有10重量％W上的磯脂醜絲氨酸、且構(gòu)成脂肪酸整體中高度不飽和脂肪酸的含量 為10?40重量％的含磯脂組合物的制造方法，并包括W下的工序（1)、（2)及工序（3)、 (4)。
[001引工序（1);通過(guò)磯脂酶A2(PLA2)，進(jìn)行溶血磯脂與高度不飽和脂肪酸的醋化反應(yīng)， 得到磯脂。
[0017] 工序（2);在工序（1)之后，使磯脂中的PLA2活性為lOU/g(磯脂）W下。
[0018] 工序（3);在磯脂酶D(PLD)的存在下，進(jìn)行磯脂與絲氨酸的混合物中的堿交換反 應(yīng)，形成包含磯脂醜絲氨酸的含磯脂組合物。
[0019] 工序（4);將包含磯脂醜絲氨酸的含磯脂組合物分離。
[0020] 作為本發(fā)明的實(shí)施方式，可W采用在上述工序（2)中從磯脂除去PLA2的方式、和 在上述工序（2)中使磯脂中的PLA2失活的方式中的至少一種。
[0021] 本發(fā)明的一實(shí)施方式中，在工序（2)中，在工序（1)之后，向磯脂中添加無(wú)機(jī)鹽 的甘油溶液、碳數(shù)4W下的醇、W及不與甘油混溶且溶解磯脂的有機(jī)溶劑，攬拌后靜置，形 成包含磯脂的有機(jī)溶劑層、和包含PLA2的甘油溶液層，將該有機(jī)溶劑層從該甘油溶液層分 離，由此從磯脂中除去PLA2。
[0022] 在此，優(yōu)選無(wú)機(jī)鹽的甘油溶液中的水分量為10重量％W下。
[0023] 優(yōu)選不與甘油混溶且溶解磯脂的有機(jī)溶劑是碳數(shù)為5?8的姪溶劑和/或離。
[0024] 優(yōu)選甘油溶液中的無(wú)機(jī)鹽濃度為0. 2?40重量％。
[00巧]優(yōu)選無(wú)機(jī)鹽為選自由硫酸鋒、氯化鐘、氯化鎮(zhèn)、硫酸鎮(zhèn)、氯化軸及氯化巧構(gòu)成的組 的至少1種。
[0026] 優(yōu)選有機(jī)溶劑為己焼。
[0027] 優(yōu)選碳數(shù)4W下的醇為己醇。
[002引本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，在工序（2)中，在工序（1)之后，向磯脂中添加酸性蛋 白酶，使磯脂中的PLA2失活。另外，還可W用酸性蛋白酶處理磯脂后，進(jìn)一步向該磯脂中添 加中性蛋白酶，使磯脂中的PLA2失活。
[0029] 在本發(fā)明中，例如，高度不飽和脂肪酸為DHA。另外，溶血磯脂為來(lái)自植物或蛋黃的 溶血卵磯脂。進(jìn)一步，溶血磯脂為來(lái)自大豆的溶血卵磯脂。
[0030] 本發(fā)明的第二發(fā)明涉及一種含磯脂組合物，其是W來(lái)自植物的磯脂、或來(lái)自植物 及來(lái)自蛋黃的磯脂為原料而合成的含磯脂組合物，其中，含有10重量％^上的磯脂醜絲氨 酸，構(gòu)成脂肪酸整體中DHA的含量為10?40重量％且亞油酸的含量為15?40重量％。 [00引]發(fā)明效果
[0032] 根據(jù)本發(fā)明，能夠低價(jià)且穩(wěn)定地供給在2位鍵合有高度不飽和脂肪酸的磯脂醜絲 氨酸、尤其是包含DHA鍵合磯脂醜絲氨酸的含磯脂組合物。

【具體實(shí)施方式】
[0033] W下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)地進(jìn)行說(shuō)明。本發(fā)明的含磯脂組合物的制造方法的特 征在于，包括特定的工序。另外，本發(fā)明的含磯脂組合物的特征在于，其是W來(lái)自植物、蛋黃 的磯脂等為原料而合成的含磯脂組合物，含有特定量的磯脂醜絲氨酸，并包含特定量的高 度不飽和脂肪酸作為磯脂的構(gòu)成脂肪酸。
[0034] 本發(fā)明的磯脂醜絲氨酸是磯脂的一種，集中存在于神經(jīng)細(xì)胞中，在腦內(nèi)的信息傳 遞、血流中發(fā)揮重要的作用。
[00巧]本發(fā)明的高度不飽和脂肪酸是指碳一碳間的雙鍵為4個(gè)W上的不飽和脂肪酸、W及共輛亞油酸。高度不飽和脂肪酸具有提高學(xué)習(xí)能力、預(yù)防動(dòng)脈硬化、改善脂質(zhì)代謝等功 能。對(duì)于該些高度不飽和脂肪酸而言，與磯脂鍵合的形態(tài)被認(rèn)為比與甘油H醋鍵合的形態(tài) 的抗氧化性強(qiáng)，穩(wěn)定性提高，攝取時(shí)的吸收性也好。作為具體的高度不飽和脂肪酸，可W舉 出DHA、EPA、花生四帰酸等，從獲得的容易程度和功能的強(qiáng)度的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選DHA。
[0036] 本發(fā)明的含磯脂組合物優(yōu)選在組合物整體中含有磯脂醜絲氨酸10重量％W上， 更優(yōu)選為10?80重量％、進(jìn)一步優(yōu)選為30?80重量％、特別優(yōu)選為40?80重量％。若 含量少于10重量％，則有時(shí)不能得到本發(fā)明的效果。另外，含磯脂組合物中的高度不飽和 脂肪酸的含量?jī)?yōu)選在構(gòu)成脂肪酸整體中為10?40重量％。若高度不飽和脂肪酸的含量少 于10重量％，則存在基于高度不飽和脂肪酸的效果低的情況，多于40重量％時(shí)存在制造上 成本花費(fèi)過(guò)高的情況。
[0037] <磯脂醜絲氨酸的定量方法>
[00測(cè)磯脂或含磯脂組合物中的磯脂醜絲氨酸的定量按照化urnalof化曲Resolution C虹omatography,13 (1990)，PP126-129中記載的方法，利用HPLC_化SD裝置進(jìn)行分析。對(duì) 于磯脂醜絲氨酸的定量，使用預(yù)先用標(biāo)準(zhǔn)的方法由大豆卵磯脂使用磯脂酶D進(jìn)行合成并利 用娃膠柱色譜法精制的磯脂醜絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品制成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，W其為基準(zhǔn)進(jìn)行定量。
[0039] 本發(fā)明的含磯脂組合物的制造方法基本上按順序包括W下的工序（1)、（2)，且按 順序包括工序（3)、（4)。
[0040] < 工序（1) >
[0041] 使用磯脂酶A2 (W下也稱(chēng)PLA2)，進(jìn)行溶血磯脂與高度不飽和脂肪酸的醋化反應(yīng)， 得到鍵合有高度不飽和脂肪酸的磯脂。所述醋化反應(yīng)按照常法進(jìn)行即可，但考慮到酶的最 適溫度、脂肪酸的氧化等，優(yōu)選在30?8(TC的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，更優(yōu)選在40?7(TC的范圍 內(nèi)進(jìn)行。若低于3(TC則存在酶活性低的情況，若超過(guò)8(TC則存在酶失活、或脂肪酸發(fā)生氧 化的情況。另外，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為3?72小時(shí)。PLA2的添加量相對(duì)于每100重量份的溶血 磯脂優(yōu)選為1?100重量份。優(yōu)選反應(yīng)在分析磯脂的脂肪酸組成，并確認(rèn)高度不飽和脂肪 酸達(dá)到構(gòu)成脂肪酸中的至少10重量％W上后結(jié)束。
[0042] 在此使用的磯脂酶A2是用于將磯脂的2位水解、或在溶血磯脂的2位導(dǎo)入脂肪酸 的酶。對(duì)于其來(lái)源沒(méi)有特別要求，但通常優(yōu)選能夠用于食用的酶，可W舉出來(lái)自豬膜臟的 酶、來(lái)自微生物的酶。
[0043] 本發(fā)明的溶血磯脂可W通過(guò)將工業(yè)上通過(guò)磯脂酶A2而鍵合于磯脂的2位的脂肪 酸進(jìn)行水解而得到。其中，從獲得的容易程度出發(fā)，優(yōu)選由來(lái)自植物或蛋黃的卵磯脂得到的 溶血卵磯脂，更優(yōu)選由大豆、蛋黃中含有的卵磯脂得到的溶血卵磯脂，從成本方面考慮，進(jìn) 一步優(yōu)選來(lái)自大豆的溶血卵磯脂。將鍵合于來(lái)自大豆的磯脂的2位的脂肪酸按照常法通過(guò) 磯脂酶A2進(jìn)行水解而得到的糊狀、粉末狀的來(lái)自大豆的溶血卵磯脂中，溶血磯脂醜膽堿的 含量為18?30重量％左右，濃縮后的含量為60?75重量％。另外，將鍵合于來(lái)自蛋黃 的磯脂的2位的脂肪酸按照常法進(jìn)行水解而得到的糊狀、粉末狀的來(lái)自蛋黃的溶血卵磯脂 中，溶血磯脂醜膽堿的含量為50?80重量％左右。
[0044] 如上所述，使用來(lái)自大豆的溶血卵磯脂作為溶血磯脂時(shí)，最終在工序（2)或（4)中 得到的含磯脂組合物中，含有大量亞油酸作為構(gòu)成脂肪酸。此時(shí)，構(gòu)成脂肪酸整體中的亞油 酸的含量大致在15?40重量％的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在20?40重量％的范圍內(nèi)。
[0045] < 工序（2) >
[0046] 在工序（1)之后，使工序（1)中得到的磯脂中的PLA2活性為lOU/g(磯脂）W下。 具體來(lái)說(shuō)，該工序通過(guò)W下說(shuō)明的從磯脂中除去PLA2的工序（2) - 1、或使磯脂中的PLA2 失活的工序（2) - 2來(lái)實(shí)現(xiàn)。也可W并用工序（2) - 1和工序（2) - 2該兩個(gè)。
[0047] < 工序（2) _ 1 >
[0048] 在工序（1)之后，對(duì)磯脂（從在工序（1)中發(fā)生醋化反應(yīng)而得到的含磯脂反應(yīng)溶 液中將磯脂萃取到有機(jī)溶劑中的萃取溶液、從該萃取溶液中蒸觸除去有機(jī)溶劑而得到的含 磯脂組合物、或進(jìn)一步利用丙麗等除去了脂肪酸的含磯脂組合物）添加無(wú)機(jī)鹽的甘油溶 液、碳數(shù)4W下的醇、W及不與甘油混溶且溶解磯脂的有機(jī)溶劑，進(jìn)行混合。它們的添加量 考慮PLA2的除去效果來(lái)適當(dāng)決定即可，所述反應(yīng)溶液、萃取溶液預(yù)先包含該溶劑的情況下 可W進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
[0049] 在混合后，將溫度調(diào)整到20?6(TC，強(qiáng)力攬拌W使溶解有磯脂的有機(jī)溶劑與甘油 不分離。優(yōu)選將溫度調(diào)整到40?6(TC。然后充分?jǐn)埌韬箪o置，形成包含PLA2的甘油溶液 層、和包含磯脂的有機(jī)溶劑層，分離（分取）該有機(jī)溶劑層。即，通過(guò)使在磯脂中殘留的PLA2 轉(zhuǎn)移到甘油溶液層側(cè)而將其除去，從而降低磯脂中的磯脂酶A2活性?？紤]到純度的提高和 工作效率，可W適當(dāng)重復(fù)上述那樣的規(guī)定溶劑的添加和分取操作。
[0050] 在分離上述有機(jī)溶劑層后，蒸觸除去有機(jī)溶劑能夠回收磯脂。優(yōu)選在蒸觸除去有 機(jī)溶劑后，用不溶解磯脂而溶解脂肪酸、水的溶劑進(jìn)行洗涂處理，并回收沉淀的磯脂的方 法。
[0051] 在此，作為上述碳數(shù)4 W下的醇，可W舉出甲醇、己醇、丙醇及下醇，可W使用選自 它們中的至少1種。其中，從毒性低可W作為食品添加物利用出發(fā)，優(yōu)選己醇。
[0052] 作為無(wú)機(jī)鹽，若為具有對(duì)甘油的溶解性的無(wú)機(jī)鹽則沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選使用選 自由氯化鎮(zhèn)、硫酸鎮(zhèn)、硫酸鋒、氯化鐘、氯化軸及氯化巧構(gòu)成的組的至少1種。優(yōu)選無(wú)機(jī)鹽按 照在甘油溶液整體中為0. 2重量％W上的方式進(jìn)行混合來(lái)使用。若無(wú)機(jī)鹽的濃度少于0. 2 重量％則存在PLA2的除去不充分的情況。無(wú)機(jī)鹽的濃度越濃則PLA2的除去效率越變高， 但優(yōu)選在甘油溶液整體中為40重量％ ^下。若無(wú)機(jī)鹽的濃度超過(guò)40重量％，則存在甘油 溶液的粘度上升、或無(wú)機(jī)鹽析出而變得難W使用的情況。
[0053] 上述無(wú)機(jī)鹽的甘油溶液的制備考慮到無(wú)機(jī)鹽向甘油的分散性，優(yōu)選使無(wú)機(jī)鹽形成 水溶液后再與甘油進(jìn)行混合。另外，無(wú)機(jī)鹽的甘油溶液整體中的水分量越少越優(yōu)選，優(yōu)選為 30重量％ ^下，更優(yōu)選為10重量％ ^下，進(jìn)一步優(yōu)選為1重量％ ^下。若甘油溶液中的水 分量超過(guò)30重量％，則存在PLA2的除去不能充分進(jìn)行的情況。另外，使無(wú)機(jī)鹽形成水溶液 后制備甘油溶液的情況下，優(yōu)選在蒸觸除去甘油溶液中的水后使用。
[0054]作為不與甘油混溶且溶解磯脂的有機(jī)溶劑，優(yōu)選碳數(shù)為5?8的姪溶劑和/或離。 具體來(lái)說(shuō)，可W舉出庚焼、己焼、戊焼、二己基離、二異丙基離等，從在食品用途中的利用的 觀點(diǎn)出發(fā)，更優(yōu)選己焼。
[0055]作為不溶解磯脂而溶解脂肪酸、水的溶劑，可W舉出丙麗等。
[005引在工序似一1之后，磯脂中的磯脂酶A2活性越低越化優(yōu)選為lOU/g(磯脂）W下，更優(yōu)選為lU/gW下。若磯脂酶A2活性高于lOU/g，則存在工序（1)中鍵合于磯脂的高 度不飽和脂肪酸過(guò)度脫離的情況。
[0057] 需要說(shuō)明的是，作為工序（2)，可W實(shí)施工序（2) - 1，也可W實(shí)施下面的工序 (2) - 2〇
[0058] < 工序（2) _ 2 >
[005引在工序（1)之后，向磯脂添加酸性蛋白酶，從而使磯脂中的PLA2失活而降低磯脂 中的磯脂酶A2活性。該蛋白酶是切斷蛋白質(zhì)中的膚鍵的酶，在動(dòng)物、植物、微生物中廣泛存 在。
[0060]具體來(lái)說(shuō)，從工序（1)中發(fā)生醋化反應(yīng)而得到的含磯脂反應(yīng)溶液中利用有機(jī)溶劑 萃取磯脂，從萃取溶劑中蒸觸除去溶劑，優(yōu)選向?qū)⒗帽惖热軇┏チ酥舅岬暮壷?組合物分散于水中的含磯脂水溶液（酸性的水溶液）中添加酸性蛋白酶，優(yōu)選保持在規(guī)定 溫度并攬拌0. 5?48小時(shí)來(lái)發(fā)生酶反應(yīng)。若反應(yīng)時(shí)間短于0. 5小時(shí)，則存在磯脂酶A2活 性降低效果小的情況，若長(zhǎng)于48小時(shí)，則存在磯脂劣化、或磯脂凝集、或蛋白酶失活等而磯 脂酶A2活性降低效果令人頭疼的情況。上述規(guī)定溫度可W是酶的最適溫度，為了防止磯脂 的劣化優(yōu)選不超過(guò)6(TC的溫度。作為酸性蛋白酶，可W舉出例如，來(lái)自動(dòng)物的胃蛋白酶、來(lái) 自Aspergillusniger的酸性蛋白酶等。酸性蛋白酶的添加量相對(duì)于每含磯脂溶液100重 量份優(yōu)選為0. 1?10重量份。
[006。工序似一2可W在使用酸性蛋白酶的處理后結(jié)束，但優(yōu)選在使用酸性蛋白酶的 處理后，繼續(xù)將含磯脂溶液的抑中和到4. 0?8. 0,并向其中添加中性蛋白酶。更優(yōu)選將含 磯脂溶液的抑中和到5. 0?7. 0,并向其中添加中性蛋白酶。優(yōu)選在添加中性蛋白酶后， 保持在規(guī)定溫度并攬拌0. 5?48小時(shí)來(lái)發(fā)生酶反應(yīng)。若反應(yīng)時(shí)間短于0. 5小時(shí)，則存在磯 脂酶A2活性降低效果小的情況，若長(zhǎng)于48小時(shí)，則存在磯脂劣化、或磯脂凝集、或蛋白酶失 活等而磯脂酶A2活性降低效果令人頭疼的情況。上述規(guī)定溫度可W是酶的最適溫度，為 了防止磯脂的劣化優(yōu)選不超過(guò)6(TC的溫度。作為中性蛋白酶，可W舉出來(lái)自Aspergillus 化yzae、來(lái)自BacillusSubtilis等。中性蛋白酶的添加量相對(duì)于每含磯脂溶液100重量 份優(yōu)選為0. 1?10重量份。
[0062] 可W在利用酸性蛋白酶的酶反應(yīng)、或利用酸性蛋白酶及中性蛋白酶的酶反應(yīng)結(jié)束 后，相對(duì)于含磯脂水溶液100重量份，添加10?200重量份的溶解磯脂且不與水混溶的溶 劑（例如己焼等）并進(jìn)行攬拌，分取上層（溶劑層），從該層除去溶劑而萃取磯脂。在含磯 脂水溶液的粘度變高等、而難W僅憑上述溶劑萃取磯脂的情況下，有時(shí)進(jìn)一步加入己醇等 與水混溶的醇溶劑從而提高萃取效率。在加入醇溶劑的情況下，優(yōu)選相對(duì)于含磯脂水溶液 100重量份加入10?100重量份。通過(guò)W上的處理而得的磯脂中的磯脂酶A2活性大幅降 低。
[0063] 在上述中，從上層除去溶劑后，優(yōu)選用丙麗洗涂磯脂。通過(guò)丙麗洗涂，能夠除去殘 留的水分、因水解而游離的脂肪酸等。
[0064]在工序似一2之后，磯脂中的磯脂酶A2活性越低越化優(yōu)選為lOU/g(磯脂）W下，更優(yōu)選為lU/gW下。若高于lOU/g，則存在工序（1)中鍵合于磯脂的高度不飽和脂肪酸 過(guò)度脫離的情況。
[0065] <磯脂酶A2活性的測(cè)定方法>
[0066]本發(fā)明中的磯脂中的磯脂酶A2活性的測(cè)定方法如下。首先，在脫脂大豆卵磯脂6g中加入蒸觸水400mL在室溫下攬拌30分鐘。在該脫脂大豆卵磯脂溶液中，加入將脫氧膽酸 軸0. 7g及氯化巧二水合物0. 5g溶于水110血的溶液，邊用冰浴冷卻邊W8000巧m均化15 分鐘。將得到的溶液作為活性測(cè)定溶液。將活性測(cè)定溶液20mL稱(chēng)取至50mL的樣品瓶中， 加入IM氨氧化軸水溶液將抑調(diào)整到8. 0。將作為測(cè)定對(duì)象的磯脂樣品20mg分散于ImL的 蒸觸水中，將該溶液加入調(diào)整到抑8. 0的活性測(cè)定溶液中，再次將抑調(diào)整到8. 0,測(cè)定為了 將抑保持在8. 0所需的20mM氨氧化軸溶液的每1分鐘的滴定量。利用預(yù)先用酶標(biāo)準(zhǔn)溶液 制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，算出磯脂中的PLA2活性。
[0067] < 工序（3) >
[006引將工序似中得到的磯脂或市售的磯脂與絲氨酸進(jìn)行混合，在磯脂酶D(W下也稱(chēng)PLD)的存在下，進(jìn)行堿交換反應(yīng)，在磯酸基上鍵合絲氨酸。由此，形成包含磯脂醜絲氨酸的 含磯脂組合物。作為上述堿交換反應(yīng)，有W溶解磯脂的有機(jī)溶劑與溶解絲氨酸、磯脂酶D的 水的二層系來(lái)實(shí)施的方法、或者僅W水來(lái)實(shí)施的方法等，可W采用任意方法，但從磯脂的溶 解性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選W二層系實(shí)施的方法。
[0069] 具體來(lái)說(shuō)，展示W(wǎng)二層系實(shí)施的方法。首先，制備溶解了工序（2)中得到的磯脂或 市售的磯脂的有機(jī)溶劑溶液。另外，預(yù)先制備溶解了絲氨酸及磯脂酶D的水。然后將它們 混合，優(yōu)選在20?55C的溫度下按照不發(fā)生層分離的方式強(qiáng)力攬拌0. 5?48小時(shí)而使其 反應(yīng)。若在低于2(TC的溫度下使其反應(yīng)，則存在反應(yīng)效率差的情況，若在高于55C的溫度 下使其反應(yīng)，則存在磯脂酶D失活的情況。另外，若反應(yīng)時(shí)間少于0. 5小時(shí)，則存在反應(yīng)效 率差的情況，若反應(yīng)時(shí)間超過(guò)48小時(shí)，則存在水解等副反應(yīng)進(jìn)行的情況。
[0070] 工序做中使用的有機(jī)溶劑的種類(lèi)沒(méi)有特別要求，可W使用例如己焼、丙麗、己酸 己醋等。在并用己焼和丙麗的情況下，優(yōu)選將己焼/丙麗（體積比）設(shè)為20/1?1/1。若 己焼/丙麗（體積比）大于20,則存在與水的混溶性變差而反應(yīng)效率變差的情況，若己焼/ 丙麗（體積比）小于1，則存在磯脂的溶解變差而反應(yīng)效率變差的情況。
[0071]有機(jī)溶劑的量若為磯脂充分溶解的量則沒(méi)有問(wèn)題，但相對(duì)于磯脂100重量份，優(yōu) 選使用500?20000重量份。若有機(jī)溶劑的量少于500重量份，則存在磯脂的溶解不充分 而反應(yīng)效率變差的情況，若有機(jī)溶劑的量多于20000重量份，則存在溶劑的使用量多而回 收等的成本過(guò)度增加的情況。
[0072]對(duì)于水的量，若為能夠與溶劑混溶并高效地?cái)埌璧牧考纯?，但相?duì)于溶劑100重 量份優(yōu)選使用10?1000重量份。若水的量少于10重量份，則存在絲氨酸、酶的溶解不充 分因而反應(yīng)效率降低的情況，若水的量多于1000重量份，則存在基于磯脂酶D的水解占優(yōu) 勢(shì)而反應(yīng)效率降低的情況。
[0073] 關(guān)于絲氨酸的量，與所使用的水的量等相關(guān)，但相對(duì)于磯脂100重量份優(yōu)選使用 50?5000重量份。若絲氨酸的量少于50重量份，則存在反應(yīng)效率降低的情況，若絲氨酸的 量多于5000重量份，則存在成本過(guò)度增加的情況。
[0074] 本發(fā)明的磯脂酶D是用于交換鍵合于磯脂中的磯酸基上的氨基的酶，可W舉出 來(lái)自洋白菜等植物的磯脂酶、來(lái)自植物中的花生等豆類(lèi)的磯脂酶、來(lái)自Actinoma化ra屬、Str巧tomyces屬等微生物的磯脂酶。關(guān)于磯脂酶D的量，優(yōu)選按照每Ig磯脂為20?IOOOU 左右的方式使用，若磯脂酶D的量少于20U，則存在反應(yīng)效率降低的情況，若磯脂酶D的量超 過(guò)1000U，則存在成本過(guò)度增加的情況。
[00巧] < 工序（4) >
[0076] 分離在工序（3)中形成的包含磯脂醜絲氨酸的含磯脂組合物。
[0077]W二層系實(shí)施工序（3)的情況下，若在反應(yīng)結(jié)束后停止攬拌，則含有磯脂醜絲氨 酸的含磯脂組合物轉(zhuǎn)移至有機(jī)溶劑層，因此，在回收有機(jī)溶劑層后，通過(guò)水洗來(lái)除去酶，然 后進(jìn)行濃縮。然后，優(yōu)選用丙麗洗涂，再進(jìn)行干燥，由此能夠得到包含磯脂醜絲氨酸的精制 的含磯脂組合物。
[007引另外，僅W水來(lái)實(shí)施工序（3)的情況下，在反應(yīng)結(jié)束后，例如可W通過(guò)W下方式回 收該組合物；（1)相對(duì)于水100重量份，添加己焼等有機(jī)溶劑25?200重量份，充分?jǐn)埌?后，將含有磯脂醜絲氨酸的含磯脂組合物轉(zhuǎn)移至有機(jī)溶劑層，回收有機(jī)溶劑層后，通過(guò)水洗 來(lái)除去酶，然后進(jìn)行濃縮；或者（2)對(duì)從水層析出的含有磯脂醜絲氨酸的含磯脂組合物進(jìn) 行過(guò)濾?；厥蘸螅瑑?yōu)選用丙麗洗涂，再進(jìn)行干燥，由此能夠得到含有磯脂醜絲氨酸的精制的 含磯脂組合物。
[0079]W上，對(duì)于按照工序（1)、工序（2)、工序（3)、及工序（4)的順序進(jìn)行本發(fā)明的制 造方法的情況進(jìn)行了說(shuō)明。但是，本發(fā)明并不限于該順序，根據(jù)其它方式，本發(fā)明還可W按 照工序（3)、工序（4)、工序（1)、工序（2)的順序來(lái)實(shí)施。該種情況下，在工序（4)之后，使 PLA2作用于工序（4)中得到的磯脂，從而將鍵合于磯脂的2位的脂肪酸水解而得到溶血磯 脂即可。使用該溶血磯脂實(shí)施工序（1)。而且，在工序（2)中使PLA2活性降低而得到的磯 脂相當(dāng)于作為目標(biāo)生成物的大量包含磯脂醜絲氨酸和高度不飽和脂肪酸的含磯脂組合物。 另外，如上所述在工序（3)中，將轉(zhuǎn)移有含磯脂組合物的有機(jī)溶劑層回收后，可W通過(guò)水洗 來(lái)除去酶，因此若不考慮成本增加，也可W按照工序（3)、（1)、（2)、（4)的順序來(lái)實(shí)施本發(fā) 明的制造方法。
[0080] 按照工序（3)、工序（4)、工序（1)、工序似的順序?qū)嵤┑姆绞街?，為了在工序?) 中抑制水解反應(yīng)進(jìn)行，優(yōu)選在不過(guò)度抑制醋化反應(yīng)的反應(yīng)速度的范圍內(nèi)，降低工序（1)的 醋化反應(yīng)的體系中所含水分量。因此，優(yōu)選在減壓下實(shí)施工序（1)中的醋化反應(yīng)，并預(yù)先降 低原料中所含水分量。
[0081] 本發(fā)明的含磯脂組合物的制造方法能夠適宜地用于制造食用、飼料用的含磯脂組 合物。為此，在制造過(guò)程中也不使用不適合食用的原料、甲苯、甲醜胺等溶劑等即可。另外， 本發(fā)明的含磯脂組合物可W適宜地用作高機(jī)能的食用或飼料用磯脂。此時(shí)，可W添加在食 品中，也可W直接攝取。
[00的]實(shí)施例
[0083]W下示出實(shí)施例，更具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于該些實(shí)施例。需要說(shuō)明 的是，實(shí)施例中"份％ "為重量基準(zhǔn)。
[0084] <含磯脂組合物的脂肪酸組成的分析>
[00財(cái)將實(shí)施例、比較例中得到的含磯脂組合物IOmg溶于異辛焼2mL，加入0. 2M甲醇軸 的甲醇溶液ImU邊在60°C攬拌邊加熱10分鐘。用己酸進(jìn)行中和，加入水后回收上層的異 辛焼層，用氣相色譜儀進(jìn)行分析。此時(shí)，作為氣相色譜儀，使用了安捷倫公司制"5890系列 II"。作為柱，使用安捷倫公司制"DB- 23"(長(zhǎng)度30m、內(nèi)徑0. 25mm、膜厚0.25ym)，在注 入口溫度；26(TC、檢測(cè)溫度；26(TC、爐溫度；20(TC固定的條件下進(jìn)行分析。
[008引（實(shí)施例1)
[0087]進(jìn)行W下的工序（1)?（4)，得到含磯脂組合物。
[008引（工序（1))鍵合有高度不飽和脂肪酸的磯脂的制作
[0089] 向IL的玻璃制反應(yīng)容器注入甘油（阪本藥品公司制）；200g，向其中加入溶血磯 脂〇'3山1OilMilleCo. ,Ltd.制"5口^_'卡7U：/，，、溶血磯脂醜膽堿含量規(guī)格；18? 30 重量％) ;15g、磯脂酶A2(SanyoFineCo. ,Ltd.制"Lysonase"、活性；5 萬(wàn)U/g) ;6g、含 有DHA的甘油H醋（CrodaJapan"INCR0MEGADHA-J46"、DHA含量；49. 7 重量％ )、利用 常規(guī)方法堿水解的脂肪酸；6g、甘氨酸；6g、丙氨酸；6g、W及2M氯化巧水溶液；2mU邊進(jìn)行 攬拌邊在300Pa的減壓下，在5(TC反應(yīng)24小時(shí)。
[0090](工序（2))降低了磯脂酶A2活性的磯脂的回收
[0091] 在工序（1)的反應(yīng)結(jié)束后，加入己醇；100血、己焼；100血而形成甘油溶液層和有 機(jī)溶劑層該兩層。從中回收作為上層的有機(jī)溶劑層，蒸觸除去溶劑而得到含磯脂回收物 15g。向該回收物中加入丙麗；50mL充分混合，回收在(TC冷卻1小時(shí)而得到的沉淀，得到含 磯脂組合物lOg。該含磯脂組合物中殘留的PLA2的活性為75U/g。另外，磯脂中的脂肪酸 組成內(nèi)，DHA的含量為16. 5重量％。
[009引向甘油；50g中，加入2M氯化巧水溶液；10血、飽和氯化軸水溶液=IOmL,在300Pa的減壓下，在6(TC除去水分30分鐘，從而制備了甘油溶液。向該甘油溶液中，加入上述得到 的含磯脂回收物；lOg、己焼；50血及己醇；50血，在5(TC攬拌1小時(shí)。攬拌結(jié)束后，經(jīng)過(guò)靜 置回收上層（有機(jī)溶劑層），從該層蒸觸除去溶劑后，加入丙麗；50mL在OC靜置1小時(shí)，回 收含磯脂組合物的沉淀?；厥盏暮壷M合物中的PLA2殘留活性示于表1。
[0093] [表1]
[0094] (PLA2活性單位；U/g、含量單位；重量％ )
[0095]

【權(quán)利要求】
1. 一種含磷脂組合物的制造方法，其是含磷脂組合物整體中含有10重量％以上的磷 脂酰絲氨酸、且構(gòu)成脂肪酸整體中高度不飽和脂肪酸的含量為10?40重量％的含磷脂組 合物的制造方法，包括以下的工序（1)、⑵及工序（3)、（4)， 工序（1):通過(guò)磷脂酶A2即PLA2,進(jìn)行溶血磷脂與高度不飽和脂肪酸的酯化反應(yīng)，得到 憐脂； 工序⑵：在工序⑴之后，使憐脂中的PLA2活性為10U/g憐脂以下； 工序（3):在磷脂酶D即PLD的存在下，進(jìn)行磷脂與絲氨酸的混合物中的堿交換反應(yīng)， 形成包含磷脂酰絲氨酸的含磷脂組合物； 工序（4):將包含磷脂酰絲氨酸的含磷脂組合物分離。
2. 如權(quán)利要求1所述的含磷脂組合物的制造方法，其特征在于， 在所述工序（2)中從磷脂中除去PLA2和/或在所述工序（2)中使磷脂中的PLA2失活。
3. 如權(quán)利要求2所述的含磷脂組合物的制造方法，其特征在于， 在工序⑵中，在工序⑴之后，向磷脂中添加無(wú)機(jī)鹽的甘油溶液、碳數(shù)4以下的醇、以 及不與甘油混溶且溶解磷脂的有機(jī)溶劑，攪拌后靜置，形成包含磷脂的有機(jī)溶劑層和包含 PLA2的甘油溶液層，將該有機(jī)溶劑層從該甘油溶液層分離，由此從磷脂中除去PLA2。
4. 如權(quán)利要求2所述的含磷脂組合物的制造方法，其特征在于， 在工序⑵中，在工序⑴之后，向磷脂中添加酸性蛋白酶，使磷脂中的PLA2失活。
5. 如權(quán)利要求4所述的含磷脂組合物的制造方法，其特征在于， 用酸性蛋白酶處理磷脂后，進(jìn)一步向該磷脂中添加中性蛋白酶，使磷脂中的PLA2失 活。
6. 如權(quán)利要求1?5中任一項(xiàng)所述的含磷脂組合物的制造方法，其中， 高度不飽和脂肪酸為DHA。
7. 如權(quán)利要求1?6中任一項(xiàng)所述的含磷脂組合物的制造方法，其中， 溶血磷脂為來(lái)自植物或蛋黃的溶血卵磷脂。
8. 如權(quán)利要求7所述的含磷脂組合物的制造方法，其中， 溶血磷脂為來(lái)自大豆的溶血卵磷脂。
9. 如權(quán)利要求3所述的含磷脂組合物的制造方法，其中， 無(wú)機(jī)鹽的甘油溶液中的水分量為10重量％以下。
10. 如權(quán)利要求3所述的含磷脂組合物的制造方法，其中， 不與甘油混溶且溶解磷脂的有機(jī)溶劑是碳數(shù)為5?8的烴溶劑和/或醚。
11. 如權(quán)利要求3所述的含磷脂組合物的制造方法，其中， 甘油溶液中的無(wú)機(jī)鹽濃度為〇. 2?40重量％。
12. 如權(quán)利要求3所述的含磷脂組合物的制造方法，其中， 無(wú)機(jī)鹽為選自由硫酸鋅、氯化鉀、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鈉及氯化鈣構(gòu)成的組的至少1 種。
13. 如權(quán)利要求3所述的含磷脂組合物的制造方法，其中， 有機(jī)溶劑為己烷。
14. 如權(quán)利要求3所述的含磷脂組合物的制造方法，其中， 碳數(shù)4以下的醇為乙醇。
15. -種含磷脂組合物，其是以來(lái)自植物的磷脂、或來(lái)自植物及來(lái)自蛋黃的磷脂為原料 而合成的含磷脂組合物，其中， 含有10重量％以上的磷脂酰絲氨酸，構(gòu)成脂肪酸整體中DHA的含量為10?40重量％ 且亞油酸的含量為15?40重量％。
【文檔編號(hào)】C12P7/64GK104379757SQ201380031182
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年6月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月13日
【發(fā)明者】重枝麻由美, 田中立志, 井上良計(jì) 申請(qǐng)人:株式會(huì)社鐘化