專利名稱：一種分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明具體涉及一種分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基及其應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)認(rèn)為，用一般的分離方法從環(huán)境樣品中獲得的微生物純培養(yǎng)物重復(fù)性非常高，也很難再分離到新物種。尤其是放線菌，由于其產(chǎn)生多種具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物而受到微生物學(xué)家的廣泛關(guān)注，但是目前用普通的分離方法篩選到的菌株大部分都是已知菌和常見菌，這給當(dāng)前活性物質(zhì)的篩選帶來了極大的困難。因此，探索有效的微生物分離方法，從不同角度、不同層次建立分離微生物的新方法就成了微生物領(lǐng)域長期的研究任務(wù)和難點。目前國內(nèi)外對放線菌分離方法的研究主要集中在樣品的預(yù)處理，抑制劑 的選擇和培養(yǎng)基成分的改變等方面。對土壤樣品進(jìn)行預(yù)處理和加入抑制劑的主要目的是增加目的菌的數(shù)量，減少或抑制非目的菌的生長。司美茹等研究發(fā)現(xiàn)，將土樣在120°C處理Ih有利于放線菌孢子萌發(fā)，增加放線菌的種類和數(shù)量；75μ g/ml的重鉻酸鉀和2 μ g/ml的青霉素配合使用可以使細(xì)菌的數(shù)量明顯減少而不影響放線菌的種類和數(shù)量。薛清等研究發(fā)現(xiàn)將土樣在120 W功率模式下微波輻照3min對提高放線菌的出菌率有促進(jìn)作用。姜怡等研究發(fā)現(xiàn)使用100 mg/L的放線菌酮和100 mg/L制霉菌素能有效抑制真菌而不影響放線菌的生長。Li等使用極高頻福射{extremely high frequency radiation,EHF)與連續(xù)照射聯(lián)合使用的方法分離出了較多種類的稀有放線菌 細(xì)onrnra等使用6%的酵母提取物溶液處理樣品能分離到新的放線菌物種。Esther使用噬菌體作為指示物定向分離稀有放線菌\Hayakawa等以腐殖酸維生素培養(yǎng)基為基礎(chǔ),加入不同種類的抗生素，再結(jié)合不同的樣品前處理方法，分離出了小雙孢菌、野野村氏菌(Nonomuraea)、鏈孢囊菌{Streptosporangiuni)、螺旋游動菌{SpiriIIiplanes)、草孢菌屬Q(mào)ierbidospora)、馬杜拉放線菌、指抱囊菌 Qjactylosporangium')
抱菌(Microtetraspord)、地嗜皮菌{Geodermatophilus)、游魚抱菌{Sporichthya)等大量稀有放線菌。迄今為止，沒有那一種培養(yǎng)基能同時分離所有的微生物。由于放線菌是一類具有巨大應(yīng)用價值的微生物，所以開發(fā)放線菌資源就顯得尤為重要。一直以來，分離方法一直是限制人們開發(fā)利用這類微生物資源的“瓶頸”，尤其是高鹽環(huán)境下放線菌的純培養(yǎng)技術(shù)一直沒有突破，特別是針對高鹽環(huán)境下放線菌，沒有報道一種適合多種放線菌的培養(yǎng)基。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中未見報道一種適合多種放線菌的培養(yǎng)基的技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明目的在于提供一種分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基及其應(yīng)用，填補(bǔ)了國內(nèi)外針對高鹽、寡營養(yǎng)的特殊環(huán)境和高鹽環(huán)境沒有一種培養(yǎng)基適合多種高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)分離問題，為放線菌資源的開發(fā)提供菌種支撐具有廣泛的應(yīng)用價值。
本發(fā)明采用的主要技術(shù)方案
本發(fā)明結(jié)合嗜鹽放線菌對不同鹽離子類型的選擇和適應(yīng)性生理學(xué)特點，設(shè)計分離培養(yǎng)基，全面挖掘鹽湖沉積物放線菌資源，客觀認(rèn)識鹽湖沉積環(huán)境中放線菌的物種多樣性，結(jié)合沉積物樣品離子類型如陽離子Na+、K+、Mg2+、Ca2+等、陰離子Cl' CO廣、SO42' HCO3的多樣性，設(shè)計分離培養(yǎng)基，從而獲得更多的放線菌資源。本發(fā)明提供的一種分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基，按照重量百分比計，培養(yǎng)基由甘露醇 1%、丙氨酸 O. 1%、K2HPO4 O. 1%、MgSO4* 7H20 O. 1%、CaCO3 O. 02%、FeSO4·7Η20 O. 001%、Agar I. 8%、微量鹽O. 0003 %、復(fù)合維生素O. 0004%、生物素O. 000025%、重鉻酸鉀O. 005%組成；其中，微量鹽由FeS04*7H20、MnCl2·4Η20和ZnS04.7H20各O. 0001 %組成；復(fù)合維生素由BI、B2、B6、煙酸、肌醇、泛酸、對氨基苯甲酸、葉酸各O. 00005%組成；pH 7. 2_7. 4。該分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基以下簡稱Z5分離培養(yǎng)基。本發(fā)明中提供的重鉻酸鉀為培養(yǎng)基的非目的菌抑制劑。
通過實施本發(fā)明具體的發(fā)明內(nèi)容，可以達(dá)到以下效果
本發(fā)明提供的分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基與現(xiàn)有技術(shù)相比，現(xiàn)有技術(shù)中報道的經(jīng)典培養(yǎng)基，分離放線菌種類都比較單一，最多也只能分離到3個屬5個不同種的放線菌；而本發(fā)明提供的培養(yǎng)基分離放線菌結(jié)果為11個屬22個種，適合高鹽、寡營養(yǎng)的特殊環(huán)境和高鹽環(huán)境放線菌的分離。本發(fā)明站在營養(yǎng)生理學(xué)的角度，考慮到鹽湖是一個高鹽、寡營養(yǎng)的特殊環(huán)境和高鹽環(huán)境放線菌生長緩慢等因素，以微生物對滲透壓的反應(yīng)為指導(dǎo)，設(shè)計了以不同碳源和氮源為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基，適合高鹽、寡營養(yǎng)的特殊環(huán)境中分離多種放線菌，是目前報道能夠分離高鹽環(huán)境放線菌最多的一種培養(yǎng)基。
具體實施例方式下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。另外，在下述的說明中，如無特別說明，％皆指質(zhì)量百分比。主要儀器PCR儀為德國SensoQuest Labcycler ;高速冷凍離心機(jī)為BeckMan公司Allegra 64R Centrifuge ;凝膠成像分析系統(tǒng)為Bio-Rad公司Gel Doc 2000;電泳儀為北京六一 DYY-6C。試劑用于PCR擴(kuò)增的全套試劑均購自廣州東盛生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶HaeIII及連接試劑盒PMD18-T購自TaKaRa公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。本實驗所有培養(yǎng)基中均添加I. 5%、5%、10%、15%、20%、25% 6個濃度梯度的NaCl，分
離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基以下簡稱Z5分離培養(yǎng)基。本發(fā)明中選用的所有試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實施方式的實施。實施例一分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基的制備
按照重量百分比計，培養(yǎng)基由甘露醇1%、丙氨酸O. 1%、K2HPO4 O. 1%、MgSO4·7Η20 O. 1%、CaCO3 O. 02%, FeSO4·7Η20 O. 001%、Agar I. 8%、微量鹽 O. 0003 %、復(fù)合維生素 O. 0004%、生物素O. 000025%、重鉻酸鉀O. 005%組成;其中，微量鹽由FeS04*7H20、MnCl2·4Η20和ZnS04.7H20各O. 0001 %組成；復(fù)合維生素由BI、B2、B6、煙酸、肌醇、泛酸、對氨基苯甲酸、葉酸各 O. 00005% 組成；pH 7. 2-7. 4。實施例二 分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基的供試土樣
鹽湖樣品采自位于新疆阿圖什市境內(nèi)的硝爾庫勒湖。該湖呈東北-西南向分布，湖長 18-20 km,寬 2-4 km,面積 45 km2,海拔為 1585 m ( 76。53’ E，40。10’ N )。樣品采集后立即裝入無菌的封口袋并置于車載冰箱。運(yùn)抵實驗室后于_20°C保存?zhèn)溆?。實驗選取其中一份沉積物樣品進(jìn)行分離模型的研究。I.樣品離子成分的測定
主要測定樣品中的CO廣、Cl' SO42' Ca2+、Mg2+、Na+、K+的含量以及可溶性總鹽含量，由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點實驗室-省部共建國家重點實驗室 培育基地綜合測試中心完成，樣品離子成分的測定方法為常規(guī)所見。2.樣品離子成分測定結(jié)果
根據(jù)采樣點的不同植被將樣品混合成3份(A、B、C)，由表2. 2可以看出，硝爾庫勒湖樣品的可溶性總鹽含量很高，主要的陽離子為Na+，陰離子為Cl—，因此推測該鹽湖的鹽成分以NaCl為主。可見本發(fā)明選用以硝爾庫勒湖土樣為高鹽環(huán)境土樣的典型代表。表I硝爾庫勒湖樣品離子成分測定結(jié)果
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以上表ι實驗表明，本發(fā)明選用的鹽湖硝爾庫勒湖土樣為高鹽環(huán)境土樣的典型代表，本發(fā)明是基于一個高鹽、寡營養(yǎng)的特殊環(huán)境和高鹽環(huán)境，現(xiàn)有技術(shù)清楚放線菌生長緩慢，以此決定了本發(fā)明設(shè)計的培養(yǎng)基具有廣泛而適用于高鹽、寡營養(yǎng)的特殊環(huán)境。實施例三經(jīng)典培養(yǎng)基對放線菌分離的影響
選取6種現(xiàn)有技術(shù)中已報道的分離放線菌較好的經(jīng)典培養(yǎng)基，經(jīng)典培養(yǎng)基能夠代表放線菌領(lǐng)域常見的有代表性的培養(yǎng)基，結(jié)果見表2可以看出，共獲得6個屬16個不同種的放線菌。TP培養(yǎng)基和F6培養(yǎng)基分離效果最好，均能獲得3個屬5個不同種的放線菌。Gffl培養(yǎng)基、HV培養(yǎng)基和SCK培養(yǎng)基分離效果次之，Gffl培養(yǎng)基能獲得3個屬4個不同種的放線菌，HV培養(yǎng)基和SCK培養(yǎng)基均能獲得3個屬3個不同種的放線菌。從培養(yǎng)基組成來看，TP培養(yǎng)基使用的碳源是海藻糖，氮源是脯氨酸；F6培養(yǎng)基的碳源是殼聚糖，氮源是酸水解酪蛋白并補(bǔ)充了一定量的天冬酰胺；GW1培養(yǎng)基的碳源是甘露醇，氮源是酸水解酪蛋白；HV培養(yǎng)基的碳源是腐殖酸，培養(yǎng)基中補(bǔ)充了一定量的復(fù)合維生素；SCK培養(yǎng)基使用的淀粉是一種遲效碳源。海藻糖、脯氨酸和甘露醇都是比較重要的滲透調(diào)節(jié)物，殼聚糖是一種氨基葡萄糖，腐殖酸是一種高交聯(lián)度的復(fù)合物，只能被放線菌利用；由于高鹽環(huán)境放線菌生長緩慢，所以淀粉可以持久的為放線菌提供營養(yǎng)物質(zhì)。因此認(rèn)為，分離鹽湖放線菌時滲透調(diào)節(jié)物是比較理想的碳源，同時放線菌專一性的碳源和遲效碳源有利于放線菌的分離，復(fù)合維生素可能會促進(jìn)放線菌孢子的萌發(fā)。因此嘗試從不同碳源和不同氮源的角度設(shè)計新的培養(yǎng)基。表2經(jīng)典培養(yǎng)基對硝爾庫勒湖沉積物中放線菌的分離結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基，其特征在于，按照重量百分比計，所述的培養(yǎng)基由甘露醇 1%、丙氨酸 0. 1%、K2HPO4 0. 1%、MgSO4*7H20 0. 1%、CaCO3 0. 02%、FeSO4*7H200.001%、Agar I. 8%、微量鹽0. 0003 %、復(fù)合維生素0. 0004%、生物素0. 000025%、重鉻酸鉀0.005% 組成；其中，微量鹽由 FeS04*7H20、MnCl2*4H20 和 ZnS04.7H20 各 0.0001 % 組成;復(fù)合維生素由BI、B2、B6、煙酸、肌醇、泛酸、對氨基苯甲酸、葉酸各0. 00005%組成；pH7.2-7. 4。
2.如權(quán)利要求I所述分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基在放線菌分離中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基及其應(yīng)用。培養(yǎng)基由甘露醇1%、丙氨酸0.1%、K2HPO4 0.1%、MgSO4 7H2O 0.1%、CaCO3 0.02%、FeSO4 7H2O 0.001%、Agar 1.8%、微量鹽0.0003%、復(fù)合維生素0.0004%、生物素0.000025%、重鉻酸鉀0.005%組成；微量鹽由FeSO4 7H2O、MnCl2 4H2O和ZnSO4 7H2O各0.0001%組成；復(fù)合維生素由B1、B2、B6、煙酸、肌醇、泛酸、對氨基苯甲酸、葉酸各0.00005%組成；該培養(yǎng)基適合高鹽、寡營養(yǎng)的高鹽環(huán)境放線菌的分離，具有廣泛的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N1/02GK102965308SQ20121045012
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月13日
發(fā)明者張利莉, 陳正軍, 李艷賓, 關(guān)統(tǒng)偉, 夏占峰, 張瑤, 張嬌, 呂玲玲, 賈曉宇 申請人:塔里木大學(xué)