專利名稱：仔豬水腫病滅活疫苗的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種滅活疫苗的制備方法，尤其涉及仔豬水腫病滅活疫苗的制備方法以及由該制備方法得到的滅活疫苗產(chǎn)品，屬于仔豬水腫病滅活疫苗的生產(chǎn)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
仔豬水腫病(Edema disease,ED)病原屬于腸桿菌科埃希菌屬大腸埃希菌種，產(chǎn)類志賀毒素大腸桿菌。研究證明，有％個(gè)0抗原血清型與仔豬水腫病發(fā)生有關(guān)，其中主要有 0 2,0 8,0 138,0 139,0 141等0抗原血清型，這些菌株多具有溶血性，其中，C83684屬于 0 139的一個(gè)種屬。在臨床上，該病主要引起仔豬眼瞼水腫和神經(jīng)癥狀，部分仔豬伴有腹瀉癥狀，剖檢可見眼瞼、胃壁、腸系膜水腫，組織病變?yōu)槠鞴贊{液性炎癥及廣泛性小動(dòng)脈炎癥。 仔豬水腫病主要發(fā)生在斷乳后1-2周的仔豬，尤其在發(fā)育良好的仔豬群，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，是斷奶仔豬危害較嚴(yán)重的疾病。此病分布于全世界，中國也常見報(bào)道，是多年來困擾中國養(yǎng)豬業(yè)的問題之一。雖然此病可采用抗生素及磺胺類藥物進(jìn)行治療，但會造成藥物殘留，據(jù)現(xiàn)地調(diào)查90%以上的大型養(yǎng)豬場均采用接種疫苗的方式來防治該病。目前，中國國內(nèi)一些生物制品生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的仔豬水腫病疫苗均為滅活疫苗。其主要的工藝方法如下1、制備一級斜面菌種將大腸桿菌菌種稀釋接種營養(yǎng)肉湯平板，37 °C培養(yǎng) 22-24h ；選典型菌落接種營養(yǎng)肉湯斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)Mh，得到一級斜面菌種；2、制備二級菌種取一級斜面菌種接種于營養(yǎng)肉湯基中37°C振蕩培養(yǎng)18_20h，得到二級菌種，備用；3、菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中用生物發(fā)酵罐培養(yǎng)；37°C通氣培養(yǎng)18-20h，純檢確認(rèn)無菌后，滅活，即得。按照現(xiàn)有的方法進(jìn)行生產(chǎn)所制備得到的仔豬水腫病滅活疫苗的培養(yǎng)菌數(shù)一般都在100-200億/ml。此外，現(xiàn)有的仔豬水腫病滅活疫苗的制備方法還存在培養(yǎng)基營養(yǎng)成分少，生產(chǎn)成本高，產(chǎn)量低等缺陷，有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的仔豬水腫病滅活疫苗的制備方法中所普遍存在的培養(yǎng)菌數(shù)低、生產(chǎn)成本高等缺陷，提供一種新的仔豬水腫病滅活疫苗的制備方法，該制備方法具有培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種仔豬水腫病滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟(1)、制備一級斜面菌種將大腸桿菌菌種稀釋接種合成平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)；選取所培養(yǎng)的典型菌落接種合成斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)，得到一級斜面菌種；(2)、制備二級菌種取一級斜面菌種接種于合成培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，得到二級菌種，備用；
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(3)、菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到合成培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；將發(fā)酵培養(yǎng)液滅活，即得。其中，步驟(1)中所述的大腸桿菌菌種為大腸桿菌C83684菌種；所述的合成平板培養(yǎng)基或合成斜面培養(yǎng)基的成分包括蒸餾水100ml、牛肉粉0. 5g、酵母提取物0. 5g、胰蛋白胨lg、氯化鈉lg、瓊脂粉1. 5g、葡萄糖0. 5g、DMEM0. Ig ；所述的培養(yǎng)優(yōu)選在以下條件下進(jìn)行培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時(shí)間為22-24h。優(yōu)選的，步驟(1)中選10-20個(gè)所培養(yǎng)的典型菌落接種合成斜面培養(yǎng)基；步驟⑵或步驟(3)中所述合成培養(yǎng)基的成分包括蒸餾水3000ml、牛肉粉15g、 酵母提取物15g、胰蛋白胨30g、氯化鈉30g、葡萄糖15g、DMEM 3g ；其pH值為7. 2-7. 4。步驟O)中所述的振蕩培養(yǎng)優(yōu)選在以下條件下進(jìn)行振蕩轉(zhuǎn)速為100-200r/min， 培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時(shí)間為16h。步驟(3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)選為培養(yǎng)溫度為37°C;轉(zhuǎn)速為100-200r/min ； 培養(yǎng)時(shí)間為12h ；本發(fā)明人經(jīng)過進(jìn)一步的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，采用逐漸加大通氣量的方法，能夠顯著提高培養(yǎng)菌數(shù)。本發(fā)明針對現(xiàn)有的仔豬水腫病滅活疫苗的制備方法所存在的培養(yǎng)基營養(yǎng)成分少， 生產(chǎn)成本高，產(chǎn)量低等缺陷，改進(jìn)培養(yǎng)基配方并優(yōu)化了生產(chǎn)工藝，最終在培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)方法上獲得突破，培養(yǎng)菌數(shù)相比于現(xiàn)有的方法有大幅度提高，平均達(dá)到了 279. 875億/ml， 本發(fā)明方法培養(yǎng)時(shí)間縮短了 8-10h，有效降低了生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。1、大腸桿菌C83684菌種購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。2、各培養(yǎng)基的具體組成成分及配制(1)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基牛肉湯1000ml、蛋白胨10g、氯化鈉5g ；
(2)合成平板培養(yǎng)基蒸餾水100ml、牛肉粉0. 5g、酵母提取物0. 5g、胰蛋白胨lg、 氯化鈉lg、瓊脂粉1. 5g、葡萄糖0. 5g、DMEMO. Ig ；(3)合成斜面培養(yǎng)基成分與合成平板培養(yǎng)基相同；(4)合成培養(yǎng)基蒸餾水3000ml、牛肉粉15g、酵母提取物15g、胰蛋白胨30g、氯化鈉 30g、葡萄糖 15g、DMEM3g ；調(diào) pH7. 2-7. 4、115°C滅菌 40 分鐘。實(shí)施例11、一級斜面菌種制備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種合成平板培養(yǎng)基37°C培養(yǎng) 22h，選典型菌落10個(gè)接種合成斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)Mh，得到一級斜面菌種，放置4°C冰箱待用；2、二級菌種制備取一級斜面菌種接種于合成培養(yǎng)基中全溫振蕩器37°C培養(yǎng) 16h，純檢確認(rèn)無菌后，得到二級菌種，備用；3、菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到合成培養(yǎng)基中用生物發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度
437°C，轉(zhuǎn)速lOOr/min，進(jìn)氣量18m3/h，罐內(nèi)壓0. 05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間12h ；取樣平板活菌計(jì)數(shù)、純檢確認(rèn)無菌后，滅活，即得。采用《獸用生物制品規(guī)程》活菌計(jì)數(shù)法，營養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)菌數(shù)，培養(yǎng)菌數(shù)的檢測結(jié)果見表1。實(shí)施例21、一級斜面菌種制備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種合成平板培養(yǎng)基37°C培養(yǎng) Mh，選典型菌落20個(gè)接種合成斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)Mh，得到一級斜面菌種，放置4°C冰箱待用；2、二級菌種制備取一級斜面菌種接種于合成培養(yǎng)基中全溫振蕩器37°C培養(yǎng) 16h，純檢確認(rèn)無菌后，得到二級菌種，備用；3、菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到合成培養(yǎng)基中用生物發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度 37°C，轉(zhuǎn)速200r/min，進(jìn)氣量18m3/h，罐內(nèi)壓0. 05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間12h ；取樣平板活菌計(jì)數(shù)、純檢確認(rèn)無菌后，滅活，即得。采用《獸用生物制品規(guī)程》活菌計(jì)數(shù)法，營養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)菌數(shù)，培養(yǎng)菌數(shù)的檢測結(jié)果見表1。實(shí)施例31、一級斜面菌種制備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種合成平板培養(yǎng)基37°C培養(yǎng) 23h，選典型菌落15個(gè)接種合成斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)Mh，得到一級斜面菌種，放置4°C冰箱待用；2、二級菌種制備取一級斜面菌種接種于合成培養(yǎng)基中全溫振蕩器37°C培養(yǎng) 16h，純檢確認(rèn)無菌后，得到二級菌種，備用；3、菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到合成培養(yǎng)基中用生物發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度 37°C，轉(zhuǎn)速150r/min，罐內(nèi)壓0. 05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間12h ；在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，采用逐漸加大通氣量的方法，其中0- 靜置培養(yǎng)，2-4h進(jìn)氣量12m3/h，4-Mi進(jìn)氣量14m3/h，6_1池進(jìn)氣量 18m3/h。取樣平板活菌計(jì)數(shù)，純檢確認(rèn)無菌后，滅活，即得。采用《獸用生物制品規(guī)程》活菌計(jì)數(shù)法，營養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)菌數(shù)，培養(yǎng)菌數(shù)的檢測結(jié)果見表1。實(shí)施例41、一級斜面菌種制備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種合成平板培養(yǎng)基37°C培養(yǎng) 22h，選典型菌落20個(gè)接種合成斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)Mh，得到一級斜面菌種，放置4°C冰箱待用；2、二級菌種制備取一級斜面菌種接種于合成培養(yǎng)基中全溫振蕩器37°C培養(yǎng) 16h，純檢確認(rèn)無菌后，得到二級菌種，備用；3、菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到合成培養(yǎng)基中用生物發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度 37°C，轉(zhuǎn)速120r/min，罐內(nèi)壓0. 05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間12h ；在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，采用逐漸加大通氣量的方法，其中0- 靜置培養(yǎng)，2-4h進(jìn)氣量12m3/h，4-Mi進(jìn)氣量14m3/h，6_1池進(jìn)氣量 18m3/h。取樣平板活菌計(jì)數(shù)，純檢確認(rèn)無菌后，滅活，即得。采用《獸用生物制品規(guī)程》活菌計(jì)數(shù)法，營養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)菌數(shù)，培養(yǎng)菌數(shù)的檢測結(jié)果見表1。
實(shí)施例51、一級斜面菌種制備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種合成平板培養(yǎng)基37°C培養(yǎng) Mh，選典型菌落10個(gè)接種合成斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)Mh，得到一級斜面菌種，放置4°C冰箱待用；2、二級菌種制備取一級斜面菌種接種于合成培養(yǎng)基中全溫振蕩器37°C培養(yǎng) 16h，純檢確認(rèn)無菌后，得到二級菌種，備用；3、菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到合成培養(yǎng)基中用生物發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度 37°C，轉(zhuǎn)速180r/min，罐內(nèi)壓0. 05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間1 ；在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，采用逐漸加大通氣量的方法，其中0- 靜置培養(yǎng)，2-4h進(jìn)氣量12m3/h，4-Mi進(jìn)氣量14m3/h，6_1池進(jìn)氣量 18m3/h。取樣平板活菌計(jì)數(shù)，純檢確認(rèn)無菌后，滅活，即得。采用《獸用生物制品規(guī)程》活菌計(jì)數(shù)法，營養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)菌數(shù)，培養(yǎng)菌數(shù)的檢測結(jié)果見表1。實(shí)施例61、一級斜面菌種制備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種合成平板培養(yǎng)基37°C培養(yǎng) 23h，選典型菌落16個(gè)接種合成斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)Mh，得到一級斜面菌種，放置4°C冰箱待用；2、二級菌種制備取一級斜面菌種接種于合成培養(yǎng)基中全溫振蕩器37°C培養(yǎng) 16h，純檢確認(rèn)無菌后，得到二級菌種，備用；3、菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到合成培養(yǎng)基中用生物發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度 37°C，轉(zhuǎn)速140r/min，進(jìn)氣量18m3/h，罐內(nèi)壓0. 05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間12h ；取樣平板活菌計(jì)數(shù)，純檢確認(rèn)無菌后，滅活，即得。采用《獸用生物制品規(guī)程》活菌計(jì)數(shù)法，營養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)菌數(shù)，培養(yǎng)菌數(shù)的檢測結(jié)果見表1。實(shí)施例71、一級斜面菌種制備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種合成平板培養(yǎng)基37°C培養(yǎng) Mh，選典型菌落17個(gè)接種合成斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)Mh，得到一級斜面菌種，放置4°C冰箱待用；2、二級菌種制備取一級斜面菌種接種于合成培養(yǎng)基中全溫振蕩器37°C培養(yǎng) 16h，純檢確認(rèn)無菌后，得到二級菌種，備用；3、菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到合成培養(yǎng)基中用生物發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度 37°C，轉(zhuǎn)速190r/min，進(jìn)氣量18m3/h，罐內(nèi)壓0. 05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間12h ；取樣平板活菌計(jì)數(shù)，純檢確認(rèn)無菌后，滅活，即得。采用《獸用生物制品規(guī)程》活菌計(jì)數(shù)法，營養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)菌數(shù)，培養(yǎng)菌數(shù)的檢測結(jié)果見表1。實(shí)施例81、一級斜面菌種制備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種合成平板培養(yǎng)基37°C培養(yǎng) Mh，選典型菌落18個(gè)接種合成斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)Mh，得到一級斜面菌種，放置4°C冰箱待用；2、二級菌種制備取一級斜面菌種接種于合成培養(yǎng)基中全溫振蕩器37°C培養(yǎng)16h，純檢確認(rèn)無菌后，得到二級菌種，備用；3、菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到合成培養(yǎng)基中用生物發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度 37°C，轉(zhuǎn)速200r/min，罐內(nèi)壓0. 05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間1 ；在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，采用逐漸加大通氣量的方法，其中0- 靜置培養(yǎng)，2-4h進(jìn)氣量12m3/h，4-Mi進(jìn)氣量14m3/h，6_1池進(jìn)氣量 18m3/h。取樣平板活菌計(jì)數(shù)，純檢確認(rèn)無菌后，滅活，即得。培養(yǎng)菌數(shù)的檢測結(jié)果見表1。采用《獸用生物制品規(guī)程》活菌計(jì)數(shù)法，營養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)菌數(shù)，培養(yǎng)菌數(shù)的檢測結(jié)果見表1。對照實(shí)施例11、一級斜面菌種制備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種營養(yǎng)瓊脂平板37°C培養(yǎng) 22h，選典型菌落10個(gè)接種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)Mh，得到一級斜面菌種，放置 4°C冰箱待用；2、二級菌種制備取一級斜面菌種接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中全溫振蕩器37°C培養(yǎng)18h，純檢確認(rèn)無菌后，得到二級菌種，備用；3、菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中用生物發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度37°C，轉(zhuǎn)速lOOr/min，進(jìn)氣量18m3/h，罐內(nèi)壓0. 05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間18h ；取樣平板活菌計(jì)數(shù)純檢確認(rèn)無菌后，滅活，即得。采用《獸用生物制品規(guī)程》活菌計(jì)數(shù)法，營養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)菌數(shù)，培養(yǎng)菌數(shù)的檢測結(jié)果見表1。對照實(shí)施例21、一級斜面菌種制備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種營養(yǎng)瓊脂平板37°C培養(yǎng) 24h,選典型菌落20個(gè)接種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，370C培養(yǎng)Mh，得到一級斜面菌種，放置 4°C冰箱待用；2、二級菌種制備取一級斜面菌種接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中全溫振蕩器37°C培養(yǎng)18h，純檢確認(rèn)無菌后，得到二級菌種，備用；3、菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中用生物發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度37°C，轉(zhuǎn)速200r/min，進(jìn)氣量18m3/h，罐內(nèi)壓0. 05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間18h ；取樣平板活菌計(jì)數(shù)純檢確認(rèn)無菌后，滅活，即得。采用《獸用生物制品規(guī)程》活菌計(jì)數(shù)法，營養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)菌數(shù)，培養(yǎng)菌數(shù)的檢測結(jié)果見表1。對照實(shí)施例31、一級斜面菌種制備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種營養(yǎng)瓊脂平板37°C培養(yǎng) 23h，選典型菌落15個(gè)接種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)Mh，得到一級斜面菌種，放置 4°C冰箱待用；2、二級菌種制備取一級斜面菌種接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中全溫振蕩器37°C培養(yǎng)18h，純檢確認(rèn)無菌后，得到二級菌種，備用；3、菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中用生物發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度37°C，轉(zhuǎn)速150r/min，進(jìn)氣量18m3/h，罐內(nèi)壓0. 05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間18h ；取樣平板活菌計(jì)數(shù)純檢確認(rèn)無菌后，滅活，即得。采用《獸用生物制品規(guī)程》活菌計(jì)數(shù)法，營養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)菌數(shù)，培養(yǎng)菌數(shù)的檢測結(jié)果見表1。對照實(shí)施例41、一級斜面菌種制備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種營養(yǎng)瓊脂平板37°C培養(yǎng) 22h，選典型菌落20個(gè)接種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，370C培養(yǎng)Mh，得到一級斜面菌種，放置 4°C冰箱待用；2、二級菌種制備取一級斜面菌種接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中全溫振蕩器37°C培養(yǎng)18h，純檢確認(rèn)無菌后，得到二級菌種，備用；3、菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中用生物發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度37°C，轉(zhuǎn)速120r/min，進(jìn)氣量18m3/h，罐內(nèi)壓0. 05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間18h ；取樣平板活菌計(jì)數(shù)，純檢確認(rèn)無菌后，滅活，即得。采用《獸用生物制品規(guī)程》活菌計(jì)數(shù)法，營養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)菌數(shù)，培養(yǎng)菌數(shù)的檢測結(jié)果見表1。對照實(shí)施例51、一級斜面菌種制備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種營養(yǎng)瓊脂平板37°C培養(yǎng) Mh，選典型菌落10個(gè)接種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)Mh，得到一級斜面菌種，放置 4°C冰箱待用；2、二級菌種制備取一級斜面菌種接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中全溫振蕩器37°C培養(yǎng)18h，純檢確認(rèn)無菌后，得到二級菌種，備用；3、菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中用生物發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度37°C，轉(zhuǎn)速180r/min，進(jìn)氣量18m3/h，罐內(nèi)壓0. 05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間1 ；取樣平板活菌計(jì)數(shù)，純檢確認(rèn)無菌后，滅活，即得。采用《獸用生物制品規(guī)程》活菌計(jì)數(shù)法，營養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)菌數(shù)，培養(yǎng)菌數(shù)的檢測結(jié)果見表1。對照實(shí)施例61、一級斜面菌種制備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種營養(yǎng)瓊脂平板37°C培養(yǎng) 23h，選典型菌落16個(gè)接種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，370C培養(yǎng)Mh，得到一級斜面菌種，放置 4°C冰箱待用；2、二級菌種制備取一級斜面菌種接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中全溫振蕩器37°C培養(yǎng)18h，純檢確認(rèn)無菌后，得到二級菌種，備用；3、菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中用生物發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度37°C，轉(zhuǎn)速140r/min，進(jìn)氣量18m3/h，罐內(nèi)壓0. 05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間18h ；取樣平板活菌計(jì)數(shù)，純檢確認(rèn)無菌后，滅活，即得。采用《獸用生物制品規(guī)程》活菌計(jì)數(shù)法，營養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)菌數(shù)，培養(yǎng)菌數(shù)的檢測結(jié)果見表1。對照實(shí)施例71、一級斜面菌種制備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種營養(yǎng)瓊脂平板37°C培養(yǎng) Mh，選典型菌落17個(gè)接種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)Mh，得到一級斜面菌種，放置 4°C冰箱待用；2、二級菌種制備取一級斜面菌種接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中全溫振蕩器37°C培養(yǎng)18h，純檢確認(rèn)無菌后，得到二級菌種，備用；3、菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中用生物發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度37°C，轉(zhuǎn)速190r/min，進(jìn)氣量18m3/h，罐內(nèi)壓0. 05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間18h ；取樣平板活菌計(jì)數(shù)，純檢確認(rèn)無菌后，滅活，即得。采用《獸用生物制品規(guī)程》活菌計(jì)數(shù)法，營養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)菌數(shù)，培養(yǎng)菌數(shù)的檢測結(jié)果見表1。對照實(shí)施例8 1、一級斜面菌種制備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種營養(yǎng)瓊脂平板37°C培養(yǎng) Mh，選典型菌落18個(gè)接種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)Mh，得到一級斜面菌種，放置 4°C冰箱待用；2、二級菌種制備取一級斜面菌種接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中全溫振蕩器37°C培養(yǎng)18h，純檢確認(rèn)無菌后，得到二級菌種，備用；3、菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中用生物發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度37°C，轉(zhuǎn)速200r/min，罐內(nèi)壓0. 05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間18h ；在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，采用逐漸加大通氣量的方法，其中0- 靜置培養(yǎng)，2-4h進(jìn)氣量12m3/h，4-6h進(jìn)氣量14m3/h，6-18h進(jìn)氣量18m3/h。取樣平板活菌計(jì)數(shù)，純檢確認(rèn)無菌后，滅活，即得。培養(yǎng)菌數(shù)的檢測結(jié)果見表1。采用《獸用生物制品規(guī)程》活菌計(jì)數(shù)法，營養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)菌數(shù)，培養(yǎng)菌數(shù)的檢測結(jié)果見表1。表1現(xiàn)在生物制品廠普遍采用的工藝培養(yǎng)方法和本發(fā)明方法培養(yǎng)菌數(shù)對比
權(quán)利要求
1.一種仔豬水腫病滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟(1)、將大腸桿菌菌種稀釋接種合成平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)；選取所培養(yǎng)的典型菌落接種合成斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)，得到一級斜面菌種；(2)、取一級斜面菌種接種于合成培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，得到二級菌種，備用；(3)、將二級菌種接種到合成培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；將發(fā)酵培養(yǎng)液滅活，即得。
2.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的大腸桿菌菌種為大腸桿菌C83684菌種。
3.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中選10-20個(gè)所培養(yǎng)的典型菌落接種合成斜面培養(yǎng)基。
4.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的培養(yǎng)在以下條件下進(jìn)行培養(yǎng)培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時(shí)間為22-24h。
5.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的合成平板培養(yǎng)基或合成斜面培養(yǎng)基的成分包括蒸餾水100ml、牛肉粉0. 5g、酵母提取物0. 5g、胰蛋白胨lg、 氯化鈉lg、瓊脂粉1. 5g、葡萄糖0. 5g、DMEMO. lg。
6.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)或步驟(3)中所述合成培養(yǎng)基的成分包括蒸餾水3000ml、牛肉粉15g、酵母提取物15g、胰蛋白胨30g、氯化鈉30g、 葡萄糖 15g、DMEM 3g ；pH 值為 7. 2-7. 4。
7.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的振蕩培養(yǎng)為振蕩轉(zhuǎn)速為100-200r/min，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時(shí)間為16h。
8.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)為培養(yǎng)溫度為37°C ；轉(zhuǎn)速為100-200r/min ；培養(yǎng)時(shí)間為12h。
9.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，采用逐漸加大通氣量的方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
10.由權(quán)利要求1-9任何一項(xiàng)制備方法制備得到的仔豬水腫病滅活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種仔豬水腫病滅活疫苗的制備方法及其產(chǎn)品，包括(1)、將大腸桿菌菌種稀釋接種合成平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)；選取典型菌落接種合成斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)，得到一級斜面菌種；(2)、取一級斜面菌種接種于合成培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，得到二級菌種；(3)、二級菌種接種到合成培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；滅活發(fā)酵培養(yǎng)液，即得。本發(fā)明針對仔豬水腫病滅活疫苗制備方法所存在的培養(yǎng)基營養(yǎng)成分少，生產(chǎn)成本高，產(chǎn)量低等缺陷，改進(jìn)培養(yǎng)基配方并優(yōu)化了生產(chǎn)工藝，本發(fā)明方法培養(yǎng)菌數(shù)相比于現(xiàn)有的方法有大幅度提高，平均達(dá)到了279.875億/ml，培養(yǎng)時(shí)間縮短了8-10h，有效降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號C12N1/20GK102266553SQ20111020201
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月19日
發(fā)明者丁國杰, 付麗杰, 孫建富, 孫德君, 孟福強(qiáng), 張楊, 曲海波, 柴華, 王彬, 王琪, 田路路, 謝德炎, 鄭鐵鑫, 郝建偉 申請人:哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司