專(zhuān)利名稱(chēng)：蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病pcr及熒光pcr快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
囊狀幼蟲(chóng)病(sacbrood disease)簡(jiǎn)稱(chēng)囊幼病，又叫尖頭病、囊雛病，是由囊狀幼蟲(chóng) 病毒(sacbrood bee virus, SBV)引起的蜜蜂幼蟲(chóng)腸道傳染病，也是中蜂的主要病害之一。 在養(yǎng)蜂生產(chǎn)上時(shí)有發(fā)生，發(fā)病輕時(shí)，出現(xiàn)近百只幼蟲(chóng)死亡，工蜂采集活動(dòng)正常；發(fā)病嚴(yán)重時(shí)， 蜂群只見(jiàn)幼蟲(chóng)增多卻不見(jiàn)成蜂增加，造成大批幼蟲(chóng)死亡，工蜂表現(xiàn)不安，采集力明顯下降， 甚至整群飛逃，給蜂農(nóng)造成嚴(yán)重?fù)p失。蜜蜂囊幼病最早在1913年發(fā)現(xiàn)，但直到1964年才證實(shí)其病原體為囊狀幼蟲(chóng)病毒 [9]，1971年，囊幼病在廣東省佛R、從化、增城等地發(fā)生。第二年開(kāi)始流行，并迅速蔓延至全 國(guó)乃至東南亞，尤其在東南亞一帶幾乎形成毀滅性的災(zāi)害。囊幼病多流行于夏秋高溫季節(jié)， 其危害大，傳染快，蜂群患病后輕者影響蜂群的繁殖和采集，重者會(huì)造成全場(chǎng)蜂群覆滅[1°]。 SBV主要感染幼蟲(chóng)使其致病死亡。一般在1 2日齡小幼蟲(chóng)階段侵入，在5 6日齡大幼蟲(chóng) 階段出現(xiàn)明顯的癥狀，也可在成蜂體內(nèi)繁殖，但不表現(xiàn)出癥狀。SBV—般在1 2日齡小幼蟲(chóng) 階段侵入，在中腸細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、王漿腺細(xì)胞和氣管等組織中大量增殖，被害幼蟲(chóng)無(wú)法化 蛹，一般都在幼蟲(chóng)封蓋前后表現(xiàn)癥狀，感染幼蟲(chóng)失去光澤，然后軟塌下陷，貼于巢房下半部， 頭部離開(kāi)巢房壁翹起，形成鉤狀幼蟲(chóng)，蟲(chóng)體由蒼白色逐漸變?yōu)榈稚捎谙x(chóng)體后部皮下滲 出液增多，用鑷子夾出呈現(xiàn)典型的囊狀[11]。幼蟲(chóng)通常在5 6日齡時(shí)死亡，發(fā)病高峰期患 病幼蟲(chóng)約有1/3死于封蓋前，2/3死于封蓋后[12]。發(fā)病初期出現(xiàn)“花子”，接著即可在脾面 上出現(xiàn)“尖頭”，幼蟲(chóng)頭部離開(kāi)巢房壁翹起，形成鉤狀幼蟲(chóng)，體色由珍珠白變黃，繼而變褐、黑 褐色。抽出后蟲(chóng)體呈現(xiàn)典型的囊狀袋。封蓋的病蟲(chóng)房蓋下陷，工蜂將房蓋咬一小孔或啟開(kāi) 拖出巢房，未被拖出的死幼蟲(chóng)，體色由淡褐色變?yōu)樯詈稚蚝谏?，后期呈一干片，似龍船狀?病死蟲(chóng)體干后不翹，無(wú)臭，無(wú)粘性，易清除。SBV是類(lèi)小核糖核酸病毒(picornavirus)，屬于正鏈RNA病毒，病毒粒子直徑 28nm，無(wú)囊膜，圓形?；蚪MRNA堿基組成G+C含量37%到39%，對(duì)酸敏感。包含3種結(jié)構(gòu) 蛋白，25、28和31. 5kDa，此外還有一個(gè)小的VP4樣蛋白尚未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道，SBV是蜜蜂病毒中 第一個(gè)完成全基因組測(cè)序的病毒，基因組RNA全長(zhǎng)8832核苷酸，稍長(zhǎng)于典型的哺乳動(dòng)物微 小RNA病毒(大約7500核苷酸)，包含一個(gè)單獨(dú)的開(kāi)放閱讀框(179到8752核苷酸)編碼 2858氨基酸的蛋白。5'末端有結(jié)構(gòu)基因，3'末端有非結(jié)構(gòu)基因。SBV對(duì)外界不良環(huán)境的 抵抗力不強(qiáng)，在59°C熱水中只能生存10分鐘，室溫干燥情況下可以存活3星期，在病蟲(chóng)尸 體可以存活1個(gè)月，如果病蟲(chóng)尸體腐敗只能存活7 10天。據(jù)資料報(bào)道，在蜂糧中可存活 100 120天，殘留在巢房壁上的病毒夏季能存活80 90天，冬天則可存活90 100天。 陽(yáng)光直射4 7小時(shí)可以殺死。蜜蜂囊幼病的防治重在如何及早發(fā)現(xiàn)病毒的感染。在蜂群內(nèi)有明顯的感染癥狀 時(shí)，已經(jīng)對(duì)蜂群產(chǎn)生了很大的危害，隨后的防治措施也難以避免業(yè)已造成的巨大損失。在病毒的檢測(cè)方面，傳統(tǒng)的病毒離子的分離和形態(tài)觀測(cè)需要繁瑣的步驟和較高的試驗(yàn)條件。隨 著分子生物學(xué)的發(fā)展，使得利用生物技術(shù)進(jìn)行囊狀病毒的檢測(cè)成為可能。到目前為止，對(duì)囊 狀幼蟲(chóng)病病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷還主要基于電子顯微鏡的觀察，以及傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如瓊脂擴(kuò) 散試驗(yàn)、放射性免疫測(cè)定、ELISA等免疫學(xué)方法，這些方法的敏感性和特異性較低，無(wú)法避免 假陽(yáng)性反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是建立PCR檢測(cè)方法，為蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病診斷、防治、檢疫以及蜂產(chǎn)品 病原污染檢測(cè)提供快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病PCR及熒光PCR快速檢測(cè)方法。本發(fā)明步驟是a、首先采集成蜂標(biāo)本和幼蟲(chóng)標(biāo)本；b、引物設(shè)計(jì)與合成蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病PCR檢測(cè)用引物SBVl 5' -ACC AAC CGA TTC CTC AGT AG-3'SBV2 5' -CCT TGG AAC TCT GCT GTG TA-3'蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)用Taqman探針及引物SBV311F 5’ -AAGTTGGAGGCGCGTAATTG-3’SBV380R 5’ -AAATGTCTTCTTACTAGAGGTAAGGATTG-3，SBV331T 5’ -FAM-CGGAGTGGAAAGATTATCTACAATCCTTACCTCTA-TAMRA-3’c、(1)取單只蜜蜂，用PBS溶液清洗多次，盡可能棄去多余PBS，加入500μ L Trizol試劑，用研磨器盡可能研磨，再加入500 μ L Trizol試劑，快速混勻，室溫靜置 IOmin ；(2)加入200 μ L氯仿，將蓋子蓋緊，用手劇烈振蕩15s，室溫靜置IOmin ；(3) 40C 12000g離心15min，取上清液加等體積的異丙醇，顛倒混勻液體，室溫靜 置 IOmin ；(4) 40C 12000g離心15min，棄去上清，用ImL 75%乙醇洗滌RNA沉淀，振蕩混勻， 4°C，12000g 離心 IOmin ；(5)棄去上清，在超凈工作臺(tái)上干燥IOmin ；用20 μ L DEPC水溶解RNA沉淀，由于 RNA易降解，故本試驗(yàn)每次將所提的RNA立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，防止降解；d、將提取的病毒基因組RNA 10 μ L，通用引物2 μ L，離心混勻后煮沸變性lOmin， 立即冰浴5min，以消除RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)；各組分混勻，65°C作用10min，42°C反應(yīng)90min，最 后99°C 5min,4°C 5min以滅活反轉(zhuǎn)錄酶，整個(gè)過(guò)程完成后即可進(jìn)行PCR。本發(fā)明為我國(guó)蜜蜂囊幼病診斷、防治、檢疫以及蜂產(chǎn)品病原污染檢測(cè)提供快速、準(zhǔn) 確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，為有效控制囊幼病的傳播、降低蜂蜜中藥物殘留、提高蜂產(chǎn)品質(zhì)量提 供技術(shù)保障。


圖1是本發(fā)明SBV PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖2是本發(fā)明SBV PCR特異性檢測(cè)結(jié)果；
圖3是本發(fā)明PCR敏感性檢測(cè)結(jié)果；圖4是本發(fā)明特異性試驗(yàn)結(jié)果；圖5是本發(fā)明熒光PCR敏感性試驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的步驟是a、首先采集成蜂標(biāo)本和幼蟲(chóng)標(biāo)本；b、引物設(shè)計(jì)與合成蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病PCR檢測(cè)用引物SBV1 5， -ACC AAC CGA TTC CTC AGT AG-3，SBV2 5' -CCT TGG AAC TCT GCT GTG TA-3'蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)用Taqman探針及引物SBV311F 5’ -AAGTTGGAGGCGCGTAATTG-3，SBV380R 5， AAATGTCTTCTTACTAGAGGTAAGGATTG-3，SBV331T 5’ -FAM-CGGAGTGGAAAGATTATCTACAATCCTTACCTCTA-TAMRA-3’c、(1)取單只蜜蜂，用PBS溶液清洗多次，盡可能棄去多余PBS，加入500μ L Trizol試劑，用研磨器盡可能研磨，再加入500 μ L Trizol試劑，快速混勻，室溫靜置 IOmin ；(2)加入200 μ L氯仿，將蓋子蓋緊，用手劇烈振蕩15s，室溫靜置IOmin ；(3) 40C 12000g離心15min，取上清液加等體積的異丙醇，顛倒混勻液體，室溫靜 置 IOmin ；(4) 40C 12000g離心15min，棄去上清，用ImL 75%乙醇洗滌RNA沉淀，振蕩混勻， 4°C，12000g 離心 IOmin ；(5)棄去上清，在超凈工作臺(tái)上干燥IOmin ；用20 μ L DEPC水溶解RNA沉淀，由于 RNA易降解，故本試驗(yàn)每次將所提的RNA立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，防止降解；d、將提取的病毒基因組RNA 10 μ L，通用引物2 μ L，離心混勻后煮沸變性lOmin， 立即冰浴5min，以消除RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)；各組分混勻，65°C作用10min，42°C反應(yīng)90min，最 后99°C 5min,4°C 5min以滅活反轉(zhuǎn)錄酶，整個(gè)過(guò)程完成后即可進(jìn)行PCR。材料1.病料蜜蜂病料來(lái)自2005年以來(lái)對(duì)吉林省不同地區(qū)40個(gè)蜂場(chǎng)的蜜蜂及蜂產(chǎn)品檢疫樣 品；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所病料37份；福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)院蜜蜂病料20份；包括的蜂 種有意大利蜜蜂，高加索蜜蜂，浙江漿蜂，中華蜜蜂。蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病病料、蜜蜂急性麻痹病病料、蜜蜂慢性麻痹病病料、殘翼病病料、 黑蜂王臺(tái)病病料、美洲幼蟲(chóng)腐臭病病料、歐洲幼蟲(chóng)腐臭病病料、患白堊病蜜蜂幼蟲(chóng)病料由中 國(guó)農(nóng)科院蜂病研究所和福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)院提供。2.試齊[JTaqHS DNA 聚合酶、dNTP(各 2. 5mmol/L) UOXbuffer 緩沖液、6XLoading buffer, IOObp DNA Ladder Marker等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。TRIzol試劑盒GIBC0BRL公司產(chǎn)品；One Step RNA PCR(AMV)試劑盒購(gòu)自大連寶 生物工程有限公司；焦碳酸二乙酯(DEPC)等購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；DEPC水配制與器皿處理配制0. 的DEPC水溶液，37°C磁力攪拌24h。取出適 量高壓，用高壓后DEPC水配制成75%的酒精，剩余分裝以備RT-PCR和提取RNA使用。用未 高壓DEPC水處理離心管和槍頭，將離心管和槍頭在未高壓處理的DEPC水中浸泡過(guò)夜，晾干 后高壓除去DEPC。3.實(shí)驗(yàn)儀器高速冷凍離心機(jī)(SIGMA 3K30，德國(guó)西格馬公司)，核酸蛋白分析儀(Gene Spec V, Hitachi NaKa instruments Co. , Ltd. B^), PCRifiIft (Biometra Tgradient-96, ΙΗ Biometra 公司)，熒光定量 PCR 擴(kuò)增儀(ABI Sequence Detection system 7000)，電泳儀 (SAVANT PS500A美國(guó))，凝膠成像系統(tǒng)(Kodak EDAS290，美國(guó)柯達(dá)公司)，生化恒溫培養(yǎng)箱， 微量移液器(0. 1 1000 μ 1 BIOHIT芬蘭)、恒溫水浴鍋等。方法1.病料的采集和處理病料的采集和保存按如下步驟進(jìn)行①成蜂標(biāo)本的采集和保存對(duì)患成年蜂病的蜂群可取蜂群內(nèi)巢脾上或蜂箱底部帶 有典型病狀的蜜蜂及在蜂箱前面爬行的垂死蜜蜂和死亡蜜蜂20 30只。裝入密封袋內(nèi)， 作好記錄和標(biāo)記，注意不要用酒精浸泡，盡快轉(zhuǎn)移到液氮中保存。②幼蟲(chóng)標(biāo)本的采集和保存第一，割取一小塊有病蟲(chóng)或死蟲(chóng)的巢脾，裝入密封袋 內(nèi)。第二，挑取單個(gè)幼蟲(chóng)若干只裝入已消毒的凍存管內(nèi)，盡快轉(zhuǎn)移到液氮中保存。注意，凡 是供作微生物檢驗(yàn)的標(biāo)本，均不能加任何防腐劑，也不能用化學(xué)劑處理。2.引物設(shè)計(jì)與合成2. 1蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病PCR檢測(cè)用引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)Genebank網(wǎng)站公布的蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病病毒全基因組核苷酸序列 (GeneBankAF092924)，設(shè)計(jì)引物SBV1和SBV2由大連TaKaRa寶生物工程有限公司合成，理論 擴(kuò)增片段大小為487bp，其引物序列見(jiàn)表1-1。表1-1蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病病毒PCR引物Tab 1—1 The primers ofPCR for SBV
NamePrimerSizeSBV1 SBV25'-ACC AAC CGA TTC CTC AGT AG-3 ’ 5’-CCT TGG AAC TCT GCT GTG TA-3’487 bp2. 2蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)用Taqman探針及引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)Genebank網(wǎng)站公布的蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病病毒病毒核苷酸序列(GeneBank AF092924)，應(yīng)用DNAman軟件設(shè)計(jì)出一對(duì)引物SBV311F、SBV380R及探針SBV331T。核酸探針 SBV331T兩端用熒光染料修飾，5’端報(bào)告熒光為-FAM(6-Carboxyf luoresciein)，在518nm 處有最大的吸光值；3，端淬滅熒光為-TAMRA(6-Carboxytetramethylrhodamine)，在 582nm
6處有最大吸光值，由TakaRa寶生物工程(大連)有限公司合成，引物及探針序列見(jiàn)表l_2t表1-2蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病病毒實(shí)時(shí)定量熒光PCR引物及探針
權(quán)利要求
一種蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病PCR及熒光PCR快速檢測(cè)方法，其特征在于a、首先采集成蜂標(biāo)本和幼蟲(chóng)標(biāo)本；b、引物設(shè)計(jì)與合成蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病PCR檢測(cè)用引物SBV15’ ACC AAC CGATTC CTC AGTAG 3’SBV25’ CCT TGGAAC TCT GCT GTG TA 3’蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)用Taqman探針及引物SBV311F5’ AAGTTGGAGGCGCGTAATTG 3’SBV380R5’ AAATGTCTTCTTACTAGAGGTAAGGATTG 3’SBV331T5’ FAM CGGAGTGGAAAGATTATCTACAATCCTTACCTCTA TAMRA 3’；c、(1)取單只蜜蜂，用PBS溶液清洗多次，盡可能棄去多余PBS，加入500μL Trizol試劑，用研磨器盡可能研磨，再加入500μL Trizol試劑，快速混勻，室溫靜置10min；(2)加入200μL氯仿，將蓋子蓋緊，用手劇烈振蕩15s，室溫靜置10min；(3)4℃12000g離心15min，取上清液加等體積的異丙醇，顛倒混勻液體，室溫靜置10min；(4)4℃12000g離心15min，棄去上清，用1mL 75％乙醇洗滌RNA沉淀，振蕩混勻，4℃，12000g離心10min；(5)棄去上清，在超凈工作臺(tái)上干燥10min；用20μL DEPC水溶解RNA沉淀，由于RNA易降解，故本試驗(yàn)每次將所提的RNA立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，防止降解；d、將提取的病毒基因組RNA 10μL，通用引物2μL，離心混勻后煮沸變性10min，立即冰浴5min，以消除RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)；各組分混勻，65℃作用10min，42℃反應(yīng)90min，最后99℃5min，4℃5min以滅活反轉(zhuǎn)錄酶，整個(gè)過(guò)程完成后即可進(jìn)行PCR。
全文摘要
一種蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病PCR及熒光PCR快速檢測(cè)方法，屬于生物領(lǐng)域。本發(fā)明目的是建立PCR檢測(cè)方法，為蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病診斷、防治、檢疫以及蜂產(chǎn)品病原污染檢測(cè)提供快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病PCR及熒光PCR快速檢測(cè)方法。設(shè)計(jì)與合成蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病PCR檢測(cè)用引物、蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)用Taqman探針及引物。本發(fā)明為我國(guó)蜜蜂囊幼病診斷、防治、檢疫以及蜂產(chǎn)品病原污染檢測(cè)提供快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，為有效控制囊幼病的傳播、降低蜂蜜中藥物殘留、提高蜂產(chǎn)品質(zhì)量提供技術(shù)保障。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101956020SQ201010163488
公開(kāi)日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月30日
發(fā)明者劉和平, 劉金華, 宋戰(zhàn)昀, 王振國(guó), 石建平, 羅雁非, 肖成蕊, 魏春艷 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局