專利名稱：含過氧化氫酶基因的重組食品級乳酸菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因及食品制劑領域，涉及一種新的過氧化氫酶基因以及新型食品工 程菌的構建及相關制備工藝。
背景技術：
乳酸菌屬異源型細菌，在動物、人體和植物的各種環(huán)境下均有發(fā)現(xiàn)。在污水、發(fā)酵 生產(如青貯飼料、果酒、啤酒、泡菜、醬油、酸奶、干酪)的培養(yǎng)物、動物消化道等處乳酸菌 含量均較高。這類細菌長期以來，用于生產各種發(fā)酵食品，在食品工業(yè)上具有重要的利用 價值。另外，乳酸菌與人體的健康有著非常密切的關系，腸道乳酸菌能夠防止腐敗菌的生 長而起到延長壽命的作用。在醫(yī)學上，乳酸菌可用于輪狀病毒和柯薩奇病毒引起的急性腹 瀉，緩解習慣性便秘和結腸功能障礙，以及由于放射性治療引起的毒、副作用。還可用于抗 腫瘤治療。乳酸菌制劑還能克服使用抗生素后引起的菌群失調和二重感染，避免濫用抗生 素等產生的不良后果。有報道，乳酸菌具有激活機體細胞內超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, S0D)，過氧化氫酶(Catalase, CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, (GTP)的作用，促使抗氧化物產生，減少自由基的損傷，是已知的抗衰老因素之 一 [1]。實驗證明，口服乳酸菌的動物，經放射線照射后，比未服此種菌劑的對照動物存活 時間長，或免于死亡，其機制可能是乳酸菌及其發(fā)酵產物有保護造血系統(tǒng)和抗突變的作用 [1]。由于人體正常微生物群的存在，宿主、正常微生物群和外環(huán)境構成一個微生態(tài)系統(tǒng)，在 正常條件下，這個系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，對宿主和寄居的微生物均有利。但由于抗生素、 放射治療、手術和過敏性疾病等因素將引起正常微生物種群(定性)、數量(定量)與定植 部位(定位)的變化，微生態(tài)平衡將遭到破壞，引起由菌群失調所導致的雙重感染和免疫功 能低下等。乳酸菌對人和動物都有保健和治療功效，這一點，國內外均有大量實驗報道[1， 2]。因此，利用宿主體內的正常微生物群中的優(yōu)勢菌，制成益生菌制劑，可調節(jié)失調的菌群。 還有大量臨床試驗證明，乳酸菌具有作為保健輔佐劑或飼料添加劑的功能。乳酸菌發(fā)揮作用是通過定植于粘膜或皮膚上皮細胞之間，從而影響過路菌或外來 致病菌的定植、占位、生長和繁殖。乳酸菌的代謝產物例如乙酸、乳酸及細菌素等活性物質， 可阻止或殺滅病原微生物在體內的定植。乳酸菌屬厭氧菌或兼性厭氧細菌。厭氧菌是腸道 整個微生態(tài)系統(tǒng)中數量最多優(yōu)勢菌株。當使用需氧型和兼性厭氧型益生菌治療腸道菌群失 調癥時，可利用其“生物奪氧”使需氧型或兼性厭氧型致病菌大幅度下降，腸道優(yōu)勢菌(無 芽孢厭氧菌)則大量生長，因而起到治療的作用.我國微生態(tài)制劑研究速度在近年發(fā)展迅 速，品種逐漸增多。目前市場上銷售的品種主要有昂立1號、麗珠腸樂、回春生、促菌生、 培菲康、佳士康、雙歧多寶、五株王、六株寶等。新品種還在不斷地踴向市場。微生態(tài)制劑不 但在人類中廣泛應用，而且在獸醫(yī)臨床上也開始了應用.我們知道，細菌新陳代謝有兩個 突出的特點①代謝活躍。②代謝類型多樣化。各種細菌其營養(yǎng)要求、能量來源、酶系統(tǒng)、代 謝產物各不相同，形成多種多樣的代謝類型，適應復雜的外界環(huán)境。細菌代謝所需能量，絕 大多數是通過生物氧化作用而獲得的。厭氧菌不能呼吸，只能發(fā)酵。其原因是，厭氧菌缺乏細胞色素與細胞色素氧化酶，因此不能氧化那些氧化還原電勢較高的物質。特別是，某些厭 氧菌缺乏過氧化氫酶(CAT)，不能清除因氧環(huán)境下所產生的過氧化氫(H202)，而過氧化氫 (H202)又是對細菌生長和生存有毒性的物質，故成為限制一些厭氧菌生存定植的主要因素 之一 [4]。乳酸菌絕大多數都是厭氧菌或兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，生長繁殖于厭氧或微好 氧、礦物質和有機營養(yǎng)物豐富的微酸性環(huán)境中，因而，氧環(huán)境的脅迫成為限制乳酸菌生長定 植的主要因素之一。另有報道，由于活性氧存在所引起的的氧化作用可導致細胞的癌化、老化，以及動 脈硬化、關節(jié)炎、等各種自我免疫疾病。故認為活性氧不僅是老化的原因，也和多種疾病 有密切的關系，在原因不明的疑難雜癥中，也有不少是因活性氧所引起的[1’2]。所以如何 合理清除細胞內的活性氧又是擺在科學工作者面前一項急需解決的課題之一。乳酸球菌 (Lactococcus lactis)是乳酸菌中的一員，屬兼性厭氧型細菌，是生物體內的益生菌之一， 能分解葡萄糖或乳糖，產生乳酸，過氧化氫酶陰性、革蘭氏染色陽性[2]。乳酸乳球菌的另一 個特性是在腸道內不能長期定植，其原因還不清楚，是否與其不含過氧化氫酶有一定關系， 有待實驗證明。另外，機體內產生的H2O2主要靠過氧化氫酶去清除，它可使產生的活性氧完 全無毒化。近年來的研究表明，過氧化氫酶是細菌的一種高活力、穩(wěn)定、保守的蛋白酶[3]， 與SOD共同構成機體內的抗氧化保護系統(tǒng)。SOD可催化超氧陰離子與氫離子反應形成H2O2 和水，而過氧化氫酶(Catalase，CAT)則催化過氧化氫分解生成分子氧和水，從而解除氧自 由基對乳酸菌的殺傷作用[4’5]。動物模型研究證明，CAT還能誘導良好的免疫保護反應氣 在其它生物中的的研究發(fā)現(xiàn)，在光、空氣、除草劑、鹽、冷和病原感染的影響下，CAT的表達受 到影響M。對鹽地堿蓬(suaeda salsa)研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫可導致其細胞內CAT基因表達升 高，說明CAT的表達與環(huán)境脅迫有密切關系(5’6)。若能夠使可以在生物體內定植生存的乳酸 菌經過遺傳改造，使其具備了能夠分解生物在代謝過程中產生的活性氧，同時能減輕細胞 內活性氧的毒性，并能在機體內生存的特性，那么對乳酸菌這一益生菌的理論的發(fā)展以及 開發(fā)應用都具有十分重要的理論意義和現(xiàn)實意義；另外為探討過氧化氫酶作為基因工程疫 苗后選抗原或作為解除乳酸菌定植生存遇到環(huán)境脅迫，特別是氧的危害，并闡明其對乳酸 球菌生存與脅迫關系，在乳球菌中轉移過氧化氫酶基因，研究乳球菌中植入CAT基因后，對 其生存、生長的影響以及對環(huán)境的脅迫抗性能力也是非常必要的。從理論上分析，乳球菌轉 入CAT基因是有利的，它不僅可以消除內源性活性氧，也可以協(xié)助機體消除外源性活性氧。 再者，乳酸乳球菌作為基因工程益生菌，表達目的蛋白已有很多成功的報道，目前，在益生 菌的基因工程改造的技術上比較成熟[2_6’8]，這些分析為課題的提出提供了理論基礎。在創(chuàng) 新方面，目前，在抗氧脅迫的生物研究中，多見的是關于SOD的研究報道，而關于CAT的抗脅 迫研究報道很少，關于CAT在乳酸菌中重組，并對其抗環(huán)境脅迫的研究，還未見報道。參考文獻1. MartirosyanA. 0. ,Sh. L. Mndzhoyan,L. M. Charyan,Antimicrobial Activity of Lactic AcidBacteria from Sour Milk Products Narine, Karine, and Matsun. Applied biochemistry andMicrobiology 2004 ；40 (2) : 178—180.2. Yeonhee Lee, Taik-Soo Lee, enhancement in Ex Vivo Phagocytic Capacity of PeritonealLeukocytes in Mice by Oral Delivery of Various Lactic—Acid—Producing Bacteria. CurrentMicrobiology 2005 ；50 24-27.
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發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的食品級重組乳酸乳球菌。本發(fā)明所述的一種含過氧化氫酶基因的重組食品級乳酸菌，是以乳酸乳球菌 NZ9000為菌種，經基因工程重組構建的含如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的過氧化氫酶 基因的食品級重組乳酸菌。本發(fā)明所述的含過氧化氫酶基因的重組食品級乳酸菌的制備方法，包括以下步 驟①培養(yǎng)大腸桿菌，提取染色體DNA，采用限制性內切酶Sau3AI進行部分酶切，分離 純化2. 5kb以上的DNA片段；②大腸桿菌質粒pUC18/19經BamHI酶切后，與經Sau3AI進行部分酶切的不同片 段用T4DNA連接酶連接，電擊轉化大腸桿菌(例如，大腸桿菌TGl)，構建不同大小片段的大 腸桿菌基因組文庫；③選擇含有單寧酸及150ug/ml氨芐青霉素的腦心浸液(brain heartinfusion,BHI)作為培養(yǎng)介質，先于37°C厭氧培養(yǎng)2天，再于37°C有氧培養(yǎng)24小時， 在培養(yǎng)平板上篩選出可導致單寧酸降解的克隆，即過氧化氫酶陽性細菌克??；④根據已報道的細菌過氧化氫酶基因的序列和保守區(qū)，設計以下三組引物引物 組一包含序列為SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 3的引物；引物組二包含序列為SEQ ID N0. 4 和SEQ ID N0. 5的引物；引物組三包含序列為SEQ ID N0. 6和SEQ ID N0. 7的引物；所述引 物組二與引物組三均帶有Notl/SphI酶切位點；分別合成上述引物，對從陽性克隆中提取的質粒進行PCR檢測；⑤提取陽性克隆中的質粒，進行基因測序，測序結果為如SEQ ID NO. 1所示的核苷
5酸序列；⑥經BamHI酶切，將陽性克隆的質粒的重組過氧化氫酶基因插入乳酸乳球菌載體 PGK12或pRV300中，將該重組載體電擊轉化乳酸乳球菌(Lactococcuslactis) NZ9000，用紅 霉素或氯霉素抗性篩選重組乳酸乳球菌，構建成含過氧化氫酶基因的食品級重組乳酸菌。本發(fā)明采用鳥槍法構建不同大小片段的大腸桿菌基因組文庫，然后通過含單寧酸 的心腦浸液(BHI)培養(yǎng)介質篩選具含有重組過氧化氫酶基因的克隆，通過PCR檢測確定后， 再進行序列測定，確定為新的重組過氧化氫酶基因。然后將該過氧化氫酶基因插入乳酸乳 球菌載體PRV300中，轉化乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000，構建成含CAT的基因 的食品級工程重組乳酸菌。本發(fā)明還采用乳酸菌素(nisin)誘導其表達，SDS-PAGE和CAT抗體進行 Western-blot檢測CAT的表達。再通過人為制造不同的乳酸球菌生長脅迫環(huán)境(如鹽、冷、 熱和加氧環(huán)境)，檢測和分析重組乳酸球菌在不同環(huán)境脅迫下的生長情況和活性變化，確定 重組食品級工程乳酸菌的生理生化特性。實驗表明，本發(fā)明所述的重組乳酸乳球菌具有一 定的抗氧化能力和抵抗環(huán)境脅迫的能力，從而提供了一種新的食品級基因工程乳酸球菌。


圖1為從陽性克隆中提取的質粒進行PCR檢測的電泳圖譜，圖中，1為DL3000DNA 標記物，2為陰性對照，3為PCR產物；圖2為重組質粒pGK12/cat酶切鑒定電泳圖譜，圖中，1為DNA marker ；2為重組 質粒 pGK/cat ;3 為重組質粒 pRV300/cat(BamH I+Nhe I)；圖3為重組過氧化氫酶可溶蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜，圖中，1為低分子量蛋白標 記物，2為對照乳酸菌，3為含重組過氧化氫酶基因的乳酸菌；圖4為重組過氧化氫酶可溶蛋白的western blot鑒定圖譜，圖中，1為低分子量蛋 白標記物，2為對照，3為重組過氧化氫酶，4為過氧化氫酶蛋白。
具體實施例方式實施例一含過氧化氫酶基因的食品級重組乳酸菌的構建①培養(yǎng)大腸桿菌，提取染色體DNA，采用限制性內切酶Sau3AI進行部分酶切，分離 純化2. 5kb以上的DNA片段。②大腸桿菌質粒pUC18/19經BamHI酶切后，與經Sau3AI進行部分酶切的不同片 段用T4 DNA連接酶連接，電擊轉化大腸桿菌TG1，構建不同大小片段的大腸桿菌基因組文庫。③選擇含有單寧酸及150ug/ml氨芐青霉素的腦心浸液(brain heartinfusion,BHI)作為培養(yǎng)介質，先于37°C厭氧培養(yǎng)2天，再于37°C有氧培養(yǎng)24小時， 誘導過氧化氫酶活性。由于在有氧培養(yǎng)時，過氧化氫酶可導致單寧酸降解。因此，在培養(yǎng)平 板上篩選出可導致單寧酸降解的克隆，即為過氧化氫酶陽性細菌克隆。在篩選到的陽性克隆中，可以提到含有過氧化氫酶基因的質粒，酶切證明，含有 1. 2kb的片段，與已報道的過氧化氫酶基因的長度一致(見圖2)。④根據已報道的細菌過氧化氫酶(cat)基因(例如，Pseudomonasaeruginosa PA7過氧化氫酶基因序列，GenBank接受號AE004091)的序列和保守區(qū)，用Primer軟件設計設 計以下三組引物引物組一Fl :SEQ ID NO. 25，-CAA AAT ATG CAA TGG GAT TT-3，以及Fl' :SEQ ID NO. 35’ -ACC TTG TAG TAA TTT GTC GGG-3，，引物組二F2 :SEQ ID NO. 45，-TGATGCAGGCGCGGCCGCTTCACCAGTCAGCAGAGCG-3’ 以及F2' :SEQ ID NO. 55 ’ -GGTTTACAGCATGCAGATGAGACTTACAGAAACG-3’，上述劃線處為Notl/SphI酶切位點；引物組三F3 :SEQ ID NO. 65' -GGGCATGGCGGCCGCAGTTTGGCACAAAGCACAACC-3'以及F3' :SEQ ID NO. 75' -GGGCGCGCATGCCAAACAGAGGTATTGTTCGTTTG-3'，上述劃線處為Notl/SphI酶切位點；分別合成上述引物，對從陽性克隆中提取的質粒進行PCR檢測，確定可能含有與 過氧化氫酶基因同源的基因(見圖1)；⑤提取陽性克隆中的質粒，送專業(yè)測序公司進行基因測序，測序結果為如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。再將CAT基因插入經BamHI酶切的乳酸乳球菌載體pGK12或pRV300中(大腸桿 菌和乳酸菌穿梭質粒來自于法國農業(yè)科學院Dr. Alexandra Gruss)，電擊轉化乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)NZ9000，用紅霉素或氯霉素抗性篩選重組乳酸乳球菌。構建成含過 氧化氫酶基因的食品級重組乳酸菌。實施例二 對本發(fā)明將大腸桿菌CAT蛋白在乳酸乳球菌中的表達①在MG17培養(yǎng)基中，30°C，厭氧培養(yǎng)重組乳酸乳球菌，測OD值(600nm0. 5)變化， 約3. 5小時后，采用乳酸菌素nisin誘導其表達，收集培養(yǎng)的上清液和菌體，菌體超聲波破 碎后同培養(yǎng)上清一起做SDS-PAGE，觀察cat基因的表達，并購置CAT抗體，做Western-blot 檢測。結果見圖3和圖4。②待重組乳酸菌中有CAT蛋白出現(xiàn)，則進行下一步的環(huán)境脅迫抗性實驗。人為制 造不同的生理環(huán)境，先在厭氧環(huán)境下培養(yǎng)3. 5h，然后置乳酸菌于冷(4°C -O0C -20°C )、熱 (300C -800C )、鹽 NaCl (0-500mmol)、氧(加 H2020. 2mmol/L)或搖動培養(yǎng))的環(huán)境下培養(yǎng)， 在600nm下，測定細菌OD值變化，確定重組乳酸乳球菌對不同環(huán)境脅迫的影響變化，并與對 照乳酸菌作比較。③根據H2O2的消耗和泡沫在培養(yǎng)基中量的變化，在600nm下測定重組乳酸菌的OD 值變化，從而分析到重組乳酸乳球菌具有過氧化氫酶的活性。
7
不同生理環(huán)境可引起含cat的重組乳酸球菌的生長差異。在低溫(4°C -O0C )下， 表現(xiàn)出比普通乳酸乳球菌NZ9000有提高生存力的能力表現(xiàn)在復活時可以很快生長。在不 同的鹽濃度下，重組乳酸乳球菌與正常乳酸乳球菌生存活力基本沒有差異。但是在加氧 (加H2O2O. 2mmol/L)搖動培養(yǎng))的環(huán)境下培養(yǎng)，重組細菌600nm下，OD值變化顯著提高，而 且消氣泡程度也明顯加快。結果表明重組的工程菌有一定的抗氧化能力和抵抗環(huán)境脅迫 的能力實施例三過氧化氫酶的活性檢測(a)酸菌破碎，離心取上清；(b)用磷酸鹽(K2 HP04+KH2P04，0. lmol/L)與 NaCl (2mol/L)的緩沖液配制 10% 的Tween 80溶液，取5ml與30%的雙氧水5ml混合。分對照管與cat管；(c)在cat管內加入不同容積的破菌上清(20,40,80,160 μ 1)；(d)對照管在過氧化氫反應系統(tǒng)中加入只含質粒PRV300的乳酸菌破菌上清(20、 40、80、160、320μ 1)；(e)比較氣泡產生情況，發(fā)現(xiàn)加入含pRV-cat表達質粒的菌株破菌上清的各管均 有氣泡產生，且均較對照管為明顯；(f)提示重組過氧化氫酶(cat)表達產物具有過氧化氫酶活性。序列表(SEQUENCELISTING)<110>肇慶學院<120>含過氧化氫酶基因的重組食品級乳酸菌<130><160>7<170>PatentIn version 3. 4<210>1<211>1156<212>DNA<213>大腸桿菌<400>1ggcatggcggccgcagtttggcacaaagcacaaccgctcagcattagcgcaaacgtacct60
gccagtatgcctttgataacattcttttgaaccgccatggtgcgactcctttttttctca120
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<211>35<212>DNA<213>人工合成<400>7gggcgcgcat gccaaacaga ggtattgttc gtttg3權利要求
一種含過氧化氫酶基因的重組食品級乳酸菌，其特征在于該乳酸菌是以乳酸乳球菌NZ9000為菌種，經基因工程重組構建的含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的過氧化氫酶基因的食品級重組乳酸菌。
2.如權利要求1所述的含過氧化氫酶基因的重組食品級乳酸菌的制備方法，其特征在 于，包括以下步驟①培養(yǎng)大腸桿菌，提取染色體DNA，采用限制性內切酶Sau3AI進行部分酶切，分離純化 2. 5kb以上的DNA片段；②大腸桿菌質粒PUC18/19經BamHI酶切后，與經Sau3AI進行部分酶切的不同片段用 T4DNA連接酶連接，電擊轉化大腸桿菌，構建不同大小片段的大腸桿菌基因組文庫；③選擇含有單寧酸及150ug/ml氨芐青霉素的腦心浸液作為培養(yǎng)介質，先于37°C厭 氧培養(yǎng)2天，再于37°C有氧培養(yǎng)24小時，在培養(yǎng)平板上篩選出可導致單寧酸降解的克隆，即 過氧化氫酶陽性細菌克?。虎芨鶕褕蟮赖募毦^氧化氫酶基因的序列和保守區(qū)，設計以下三組引物引物組一 包含序列為SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3的引物；引物組二包含序列為SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5的引物；引物組三包含序列為SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7的引物；所述引物組二 與引物組三均帶有Notl/SphI酶切位點；分別合成上述引物，對從陽性克隆中提取的質粒進行PCR檢測；⑤提取陽性克隆中的質粒，進行基因測序，測序結果為如SEQID NO. 1所示的核苷酸序列；⑥經BamHI酶切，將陽性克隆的質粒的重組過氧化氫酶基因插入乳酸乳球菌載體 PGK12或pRV300中，將該重組載體電擊轉化乳酸乳球菌NZ9000，用紅霉素或氯霉素抗性篩 選重組乳酸乳球菌，構建成含過氧化氫酶基因的食品級重組乳酸菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含過氧化氫酶基因的重組食品級乳酸菌，該乳酸菌是以乳酸乳球菌NZ9000為菌種，經基因工程重組構建的含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的過氧化氫酶基因的食品級重組乳酸菌。本發(fā)明采用鳥槍法構建不同大小片段的大腸桿菌基因組文庫，通過含單寧酸的心腦浸液培養(yǎng)介質篩選具含完整過氧化氫酶基因的克隆，再將過氧化氫酶基因插入乳酸乳球菌載體pGK12或pRV300中，轉化乳酸乳球菌NZ9000，構建成含過氧化氫酶基因的食品級工程重組乳酸菌。本發(fā)明所述的重組乳酸乳球菌具有一定的抗氧化能力和抵抗環(huán)境脅迫的能力，從而提供了一種新的食品級基因工程乳酸球菌。
文檔編號C12N15/74GK101942408SQ20091004097
公開日2011年1月12日 申請日期2009年7月8日 優(yōu)先權日2009年7月8日
發(fā)明者孫帆, 李充璧, 李妍, 李廣宏, 李蕓瑛, 李賽男, 梁盛年, 趙建芬, 陳慶華, 黃麗華 申請人:肇慶學院