專利名稱：微生物催化合成間苯三酚的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是在耐受間苯三酚的大腸桿菌中構(gòu)建間苯三酚代謝合成途徑，利用微生物
細(xì)胞催化合成間苯三酚，即是一種工程大腸桿菌生物催化合成間苯三酚的方法。
背景技術(shù)：
間苯三酚是重要的化工中間體，主要用于藥物合成、染料偶合劑、輪胎增粘劑以及 偶氮復(fù)合油墨等原料；同時(shí)，在紡織品及皮革染色工藝、生產(chǎn)塑料膠囊、替代碘化銀用于人 工降雨以及某些合成材料的防腐劑等方面也有重要應(yīng)用。 間苯三酚的市場(chǎng)價(jià)格為50萬元/噸左右，價(jià)格十分昂貴。間苯三酚的來源主要 是通過化學(xué)合成。早在20世紀(jì)50年代，M. L. Kasrens就以2，4，6_三硝基甲苯(TNT)為原 料，經(jīng)2，4，6-三硝基苯甲酸、間苯三胺工業(yè)化生產(chǎn)間苯三酚，該法具有原料便宜、生產(chǎn)工藝 成熟等優(yōu)點(diǎn)，但后處理較難，污染環(huán)境，且原料為炸藥，存在安全隱患。到20世紀(jì)80年代， 德國(guó)的ZielkeRainer給出了經(jīng)C6C16酯化、脫氯、水解制備間苯三酚的工藝。該工藝路線復(fù) 雜，工業(yè)化生產(chǎn)困難。隨后，研究者們開發(fā)了以1，3，5-三異丙基苯為原料，經(jīng)氧化、酸解合 成間苯三酚的工藝路線。收率60% ，純度99. 8% ，但原料不易獲得。 綜上所說，傳統(tǒng)的化學(xué)合成路線由于對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，存在安全隱患等等，因此這 樣的合成工藝在美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家已禁止使用，目前，只有中國(guó)和印度等少數(shù)國(guó)家在應(yīng)用此 法生產(chǎn)該化合物。新的合成工藝的研究勢(shì)在必行。 生物催化是以分離酶或微生物為催化劑來完成的化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和，對(duì)環(huán) 境友好；以可再生原料，如葡萄糖，為底物的生物催化合成，是解決全球能源危機(jī)的有效途 徑，近年來研究非常活躍。生物合成間苯三酚在已往還沒有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用微生物大腸桿菌細(xì)胞催化合成間苯三酚的方法，以 克服公知技術(shù)合成路線的缺陷。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是，以Pseudomonas fluorescensPf-5基因組 DNA模版，PCR擴(kuò)增獲得目的基因，根據(jù)細(xì)菌密碼子的偏愛性，定點(diǎn)突變phlD為phlDl基因， 將phlDl基因酶切后，連接到pET載體上，轉(zhuǎn)化到耐受間苯三酚大腸桿菌中，篩選獲得陽(yáng)性 重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)后，獲得工程大腸桿菌，工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，提取 發(fā)酵液中的間苯三酚。本發(fā)明的工程大腸桿菌已由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中心保藏，保藏編號(hào)CGMCCNo. 2560，分類命名大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，保 時(shí)日期2008年6月26日。 具體地說，本發(fā)明提供的生物催化合成間苯三酚的方法步驟是 [ooog]( — )抗間苯三酚突變株的篩選 將菌體稀釋到一定濃度，然后取菌液加入NaN02溶液和HAC-NaAC緩沖液的混合液 中，在37t:左右水浴振蕩培養(yǎng)。分別加入到Na2HP04緩沖溶液混勻，并涂在含LiCl的平板上，37t:左右避光培養(yǎng)。 ( 二 )phlDl基因克隆及重組菌株的獲得 提取細(xì)菌Pseudomonas fluorescens Pf_5基因組DNA， PCR擴(kuò)增獲得多聚酮合成 酶基因(phlD);再利用定點(diǎn)突變方法獲得變異基因phlDl，膠回收試劑盒回收目的片段，相 應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切目的片段，37t:左右，3-4小時(shí)，乙醇沉淀純化目的片斷；用相同的 限制性內(nèi)切酶酶切原核表達(dá)載體pET-30a(+)，膠回收試劑盒回收純化；載體與外源片段按 摩爾比l : 3-10的比例，16t:左右連接過夜，即為構(gòu)建好的原核表達(dá)載體pET-phlDl ;將構(gòu) 建好的重組質(zhì)粒42t:熱擊轉(zhuǎn)化到抗間苯三酚大腸桿菌中，經(jīng)酶切鑒定、PCR鑒定和測(cè)序篩 選獲得陽(yáng)性重組菌株；-8(TC左右保存該菌株。 [OO13](三)工程大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá) 將工程菌接種到LB液體培養(yǎng)液中(內(nèi)含30-50 y g mL—1的卡那霉素)，37。C左右 振蕩培養(yǎng)至0D6。。約為0. 4-0. 6時(shí)，在菌液中加入誘導(dǎo)劑IPTG，繼續(xù)在37t:左右培養(yǎng)3-5小 時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；取出誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液，取沉淀用磷酸緩沖液洗滌，按l : io的比例 (w/v)再用此緩沖液重懸細(xì)胞，加入2 X SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸，SDS-PAGE電泳檢測(cè)，即 可檢測(cè)到表達(dá)的相應(yīng)融合蛋白條帶。
(四)間苯三酚的發(fā)酵 配制發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌，冷卻時(shí)進(jìn)行無菌接種。按照正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，培養(yǎng)基初 始，并通過溫度電極和pH電極感應(yīng)，自動(dòng)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的溫度和pH，攪拌發(fā)酵培養(yǎng)。
(五)間苯三酚的提取 發(fā)酵上清液中的間苯三酚，經(jīng)乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯并減壓濃縮，制得間苯三酚。
與背景技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
1)以可再生原料生物合成間苯三酚 傳統(tǒng)的間苯三酚合成以石油源的三硝基甲苯為原料；而本研究采用可再生的葡萄 糖為原料，對(duì)解決能源短缺問題有益。
2)綠色合成技術(shù) 傳統(tǒng)的間苯三酚合成工藝中使用了重鉻酸鉀和硫酸等為催化劑，對(duì)環(huán)境有污染， 在發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)禁止，目前只有中國(guó)、印度等在繼續(xù)生產(chǎn)；而本研究利用重組工程大腸桿菌 生物合成間苯三酚，是對(duì)環(huán)境友好的綠色合成。
具體實(shí)施例方式( — )抗間苯三酚突變株的篩選取2ml菌液加入lml 0. lmol/L NaN02溶液和7ml pH4. 4HAC-NaAC緩沖液的混合液 中，在37t:水浴振蕩培養(yǎng)l-5min。分別取0. 5ml加入到9. 5ml 0. 07mol/L pH 8. 6Na2HP04 緩沖溶液混勻，并涂在含5g/L LiCl平板，37t:避光培養(yǎng)。
(二)phlDl基因克隆及重組菌株的獲得 提取細(xì)菌Pseudomonas fluorescens Pf_5基因組DNA，以其為模板，根據(jù)GenBank 序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增獲得多聚酮合成酶基因(phlD)。
(三)定點(diǎn)突變phlD基因
根據(jù)細(xì)菌氨基酸密碼子的偏愛性，利用TaKaRa MutanBEST試劑盒，用定點(diǎn)突變方 法獲得變異基因phlDl，將phlD基因突變成phlDl，突變位點(diǎn)規(guī)律如下
Gly :GGG突變?yōu)镚GC ;Arg :CGG-突變?yōu)镃GT ;Leu :CTT， TTG， CTC均突變?yōu)镃TG ;Pro : CCC突變?yōu)镃CG 突變后的phlDl基因序列已提交至GenBank，其登錄序列號(hào)為EU554263。
(四)pET-phlDl重組載體的構(gòu)建及重組菌侏的獲得 膠回收試劑盒回收目的片段，將變異的多聚酮合成酶基因(phlDl)與pET-30a(+)
載體用相同的酶進(jìn)行酶切，37t:，4h，乙醇沉淀純化目的片斷；載體與外源片段按摩爾比
1 : 3-10的比例，16t:連接過夜，獲得重組載體pET-phlDl ;將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒42t:
熱擊轉(zhuǎn)化到抗間苯三酚大腸桿菌中，經(jīng)酶切鑒定、PCR鑒定和測(cè)序篩選獲得陽(yáng)性重組菌
株；-8(TC保存該菌株。(五)工程大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá) 將工程菌按1 %的接種量接種到50mL LB液體培養(yǎng)液中(內(nèi)含30-50 y g mL—1的 卡那霉素)，37t:快速劇烈振蕩培養(yǎng)(約3h)，當(dāng)0D6。。約為0. 4-0. 6時(shí)，在菌液中加入誘導(dǎo)劑 IPTG至終濃度lmmol *L—、繼續(xù)在37。C快速振蕩培養(yǎng)3_5h，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；取出誘導(dǎo)后 的培養(yǎng)液，8000rpm離心10min，取沉淀并稱重，將沉淀用0. 05mol/L的磷酸緩沖液(pH7. 8) 洗滌一次，按l : 10的比例再用此緩沖液重懸細(xì)胞，加入等體積2XSDS-PAGE上樣緩沖液， 煮沸3-5min， 10% SDS-PAGE電泳檢測(cè)，即可檢測(cè)到表達(dá)的相應(yīng)融合蛋白條帶。
(六)間苯三酚的發(fā)酵 配制3L發(fā)酵培養(yǎng)基，放入5L發(fā)酵罐中，12rC在位滅菌25min，冷卻至30°C時(shí)按 8%的接種量進(jìn)行無菌接種。按照正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，培養(yǎng)基初始pH 8， 35t:培養(yǎng)，并通過溫 度電極和pH電極感應(yīng)，自動(dòng)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的溫度和pH，使其保持在最初設(shè)定的參數(shù)。攪拌速 度(200r/min)，培養(yǎng)期間罐壓要保持在0. 04-0. 06MPa。發(fā)酵培養(yǎng)26h結(jié)束。
(七)間苯三酚的提取 發(fā)酵上清液中的間苯三酚，經(jīng)乙酸乙酯萃取三次(發(fā)酵液乙酸乙酯體積比= 1 : 3)，回收乙酸乙酯并減壓濃縮，制得間苯三酚。獲得的發(fā)酵間苯三酚濃度達(dá)到8克/升， 與文獻(xiàn)報(bào)道相比，間苯三酚得率提高4倍。
權(quán)利要求
一種微生物催化合成間苯三酚的方法，其步驟為A)利用HNO2和LiCl復(fù)合誘變篩選抗間苯三酚突變株；B)以Pseudomonas fluorescens Pf-5基因組DNA模版，定點(diǎn)突變phlD為phlD1基因，其登錄序列號(hào)為EU554263；C)將phlD1基因酶切后，連接到pET載體上，轉(zhuǎn)化到耐受間苯三酚大腸桿菌中，篩選獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)后，獲得工程大腸桿菌，保藏編號(hào)CGMCCNo.2560，分類命名大腸埃希氏菌；D)工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，提取發(fā)酵液中的間苯三酚。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的微生物催化合成間苯三酚的方法，其中，步驟A是先將菌體加 入至NaN02溶液和HAC-NaAC緩沖液的混合液中培養(yǎng)l_5min，然后加入到Na2HP04緩沖溶液 混勻，避光培養(yǎng)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物催化合成間苯三酚的方法，其中，步驟B是用PCR擴(kuò)增 獲得多聚酮合成酶基因，再利用定點(diǎn)突變方法獲得變異基因phlDl。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物催化合成間苯三酚的方法，其中，步驟C中酶切后用乙 醇沉淀純化目的片斷。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物催化合成間苯三酚的方法，其中，步驟C中載體與外源 片段的摩爾比為1 : 3-10。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物催化合成間苯三酚的方法，其中，步驟C中的工程大腸 桿菌在含30-50 g mL—1的卡那霉素LB液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)至0D6。。約為0. 4-0. 6時(shí)，在菌 液中加入誘導(dǎo)劑IPTG培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物催化合成間苯三酚的方法，其中，步驟D中，提取發(fā)酵 液的間苯三酚是用乙酸乙酯萃取。
全文摘要
一種微生物生物催化合成間苯三酚的方法，它涉及一種利用工程大腸桿菌細(xì)胞催化合成間苯三酚的方法。本發(fā)明按照下述步驟利用工程大腸桿菌細(xì)胞催化合成間苯三酚利用HNO2和LiCl復(fù)合誘變篩選抗間苯三酚突變株；以細(xì)菌Pseudomonas fluorescens Pf-5基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得多聚酮合成酶基因(phlD)；酶切后連接到pET載體上，轉(zhuǎn)化到抗間苯三酚大腸桿菌突變株中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，即可獲得催化合成間苯三酚的工程大腸桿菌。工程大腸桿菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，在發(fā)酵液中可獲得間苯三酚，間苯三酚經(jīng)萃取、濃縮后，即為制備好的間苯三酚。本發(fā)明首次通過工程大腸桿菌催化合成間苯三酚，為今后應(yīng)用綠色合成工藝催化合成間苯三酚奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/52GK101724662SQ20081022540
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2008年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月29日
發(fā)明者仝新利, 何玉財(cái), 咸漠, 孟鑫, 張磊, 徐鑫, 李強(qiáng), 楊建明 申請(qǐng)人:青島生物能源與過程研究所