專利名稱：：番紅花的組織培養(yǎng)快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物的組織培養(yǎng)及繁殖方法，具體涉及番紅花的組織培養(yǎng)快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
：番紅花(CrocussativusL.)又名藏紅花、西紅花，系鳶尾科(Iridaceae)番紅花屬多年生草本植物。原產(chǎn)南歐各國及伊朗等地，后經(jīng)印度轉(zhuǎn)入西藏再傳入中國，引種栽培成功，故又名藏紅花或西紅花。由于番紅花只是柱頭入藥，產(chǎn)量極低，采收耗時費力；同時種源少，適宜栽培地區(qū)有限、條件苛刻等因素致使其價格昂貴，在被列為珍稀名貴中藥材，并被譽為"植物黃金"。番紅花的雌蕊柱頭是名貴中藥，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神之功效，是傳統(tǒng)的婦科、傷科良藥。臨床上還主要用于胃病、調(diào)經(jīng)、麻疹、發(fā)熱、肝脾腫大等的治療。尤其是近年來在治療心腦血管疾病方面取得了較好的療效。由于番紅花不能進行有性生殖，只能通過球莖進行無性繁殖，且栽培條件下其球莖退化現(xiàn)象嚴重，導(dǎo)致種質(zhì)資源嚴重缺乏。中國自引種以來，栽培番紅花產(chǎn)量一直較低，遠遠不能滿足人們的需要。近年來組織培養(yǎng)技術(shù)在藥用植物上得到了廣泛的應(yīng)用，這為繁殖能力較差的名貴中藥藥用資源的保存和生產(chǎn)提供了新的途徑。利用生物技術(shù)、組織培養(yǎng)的方法進行種苗生產(chǎn)，在很多植物上已成為工廠化的商品生產(chǎn)，并帶來了豐厚的經(jīng)濟效益。因此，采用組織培養(yǎng)的方法，進行番紅花愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽的誘導(dǎo)以及球莖的再生，是探索快速、大量、持續(xù)地獲得有效新生球莖的途徑。利用組織培養(yǎng)的方法建立優(yōu)系番紅花的繁殖體系，進行種苗的工廠化育苗生產(chǎn)，具有快速大量繁殖優(yōu)系品種的優(yōu)勢，可以解決番紅花的種質(zhì)資源質(zhì)量問題。為了探索擴大種源的途徑，采用組織培養(yǎng)技術(shù)進行了番紅花愈傷組織及小球莖誘導(dǎo)進行研究，以期為其種質(zhì)資源的保存與利用奠定一定的基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，研究建立番紅花無菌快繁體系，并提高增殖率，適宜大規(guī)模生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種苗。本發(fā)明提供一種番紅花組織培養(yǎng)快速繁殖方法。本發(fā)明利用組織培養(yǎng)的方法，進行了番紅花愈傷組織及小球莖誘導(dǎo)，建立優(yōu)系番紅花的繁殖體系，進行種苗的工廠化育苗生產(chǎn)，快速大量繁殖優(yōu)系品種。本發(fā)明所述方法包括下列步驟(1)外植體滅菌將球莖用水洗凈，除去皮膜，置于超凈工作臺上消毒接種；先于70%酒精中漂洗30-40秒，再用0.1%HgCl2消毒8-10分鐘，最后用無菌水沖洗45次，徹底洗去殘余的HgCl^將消毒后的球莖切成1-1.5cm接種于培養(yǎng)基上；(2)愈傷組織誘導(dǎo)將經(jīng)過消毒滅菌后的上述球莖在無菌環(huán)境中接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+0.5mg/LNAA+5.0mg/L6-BA培養(yǎng)基上中，培養(yǎng)20天收獲愈傷組織；(3)叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)將愈傷組織接種到MS+0.5mg/LNAA+2.Omg/L6-BA培養(yǎng)基上，20天后在黑暗條件(24h無光照)下，2(TC培養(yǎng)，可誘導(dǎo)出大量叢生芽；(4)不定芽繼代培養(yǎng)將叢生芽切割成單個芽后轉(zhuǎn)接到MS+0.5mg/LNAA+2.Omg/L6-BA培養(yǎng)基上，在黑暗條件下，20士2t:培養(yǎng)，15天后芽長到2-3cm;(5)球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)當芽高2-3cm時轉(zhuǎn)接到MS+0.5mg/LNAA+3.Omg/L6-BA培養(yǎng)基，在光照條件(光照時間12h/d，光照強度150020001x)下誘導(dǎo)出球莖。本發(fā)明方法所述培養(yǎng)基MS、NAA和6-BA均可從市售得到。本發(fā)明方法基于下列試驗研究，其結(jié)果如下(一)方法(1)外植體滅菌將球莖用水洗凈，除去皮膜，置于超凈工作臺上消毒接種；先于70%酒精中漂洗30-40秒，再用0.1%HgCl2消毒8-10分鐘，最后用無菌水沖洗45次，徹底洗去殘余的HgCl^將消毒后的球莖切成1-1.5cm接種于培養(yǎng)基上；(2)愈傷組織誘導(dǎo)將經(jīng)過消毒滅菌后的上述球莖在無菌環(huán)境中接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+0.5mg/LNAA+5.Omg/L6-BA培養(yǎng)基上中，在黑暗條件(24h無光照)下培養(yǎng)；考察了MS、B5、White三種不同培養(yǎng)基對番紅花愈傷組織誘導(dǎo)率的影響，不同植物生長調(diào)節(jié)劑和光照條件對番紅花愈傷組織誘導(dǎo)和生長的影響。(3)叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)將愈傷組織接種到不同濃度激素配比的MS培養(yǎng)基上，用于誘導(dǎo)叢生芽；考察光照和溫度條件對誘導(dǎo)叢生芽的影響。(4)不定芽繼代培養(yǎng)將叢生芽切割后轉(zhuǎn)接到不同濃度激素配比的MS培養(yǎng)基中，進行芽增殖實驗。考察光照和溫度條件對不定芽增殖的影響。(5)球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)當芽高2-3cm時進行球莖誘導(dǎo)實驗。將叢生苗轉(zhuǎn)接到不同濃度激素配比的MS培養(yǎng)基中，分別在光照和黑暗條件下誘導(dǎo)球莖。(二)結(jié)果1.外植體滅菌滅菌時間短，外植體邊緣褐化程度輕，但污染率較高；滅菌時間太長，污染率較低，但外植體會被灼燒，大多數(shù)不能形成愈傷組織。經(jīng)步驟1方法滅菌的番紅花球莖消毒效果好，能形成愈傷組織。2.愈傷組織誘導(dǎo)MS為適宜的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基(見表1)，不同濃度激素配比中，以MS+0.5mg/LNAA(萘乙酸)+5.Omg/L6_BA(6-芐氨基腺嘌呤)為宜(見表2)。黑暗條件下(24h無光照)有利于愈傷組織的生長(見表3)。表1不同培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>表2不同激素配比對愈傷組織生長的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表3光照條件對愈傷組織誘導(dǎo)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>3.叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)經(jīng)過30天的培養(yǎng)，部分培養(yǎng)基中愈傷組織分化成芽。其中，以MS+O.5mg/LNAA+2.0mg/L6-BA培養(yǎng)基長芽的時間較短，且生長速度較快。愈傷組織分化出小芽，幼芽數(shù)逐漸增多形成芽叢。進行了光照條件對叢生芽的誘導(dǎo)，結(jié)果表明黑暗條件下可誘導(dǎo)出大量叢生芽，而光照條件不利于愈傷組織分化成芽。溫度過高不利于誘導(dǎo)叢生芽，適宜溫度為20±2°C。4.不定芽繼代培養(yǎng)在2.0mg/L6-BA(6_節(jié)氨基腺嘌呤)的MS培養(yǎng)基上，改變NAA的濃度，對幼芽的繼代增殖影響較大。不加NAA(萘乙酸)時，形成的叢芽數(shù)較少，但所形成的幼芽節(jié)間較長，且容易再次繼代。NAA濃度大于1.Omg/L時，形成的叢芽數(shù)較多，且芽較瘦弱不利于再次繼代，NAA濃度越大，所形成的幼芽越短，苗高也逐漸降低，基部形成的愈傷組織塊逐漸增大。其中仍以MS+0.5mg/LNAA+2.0mg/L6_BA培養(yǎng)基芽增殖效果為好。進行了光照條件對叢生芽的增殖，結(jié)果表明黑暗條件叢生芽能夠增殖，而光照條件不利于叢生芽增殖。溫度過高不利于叢生芽增殖，適宜溫度為20士2t:。5.球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)將叢生苗轉(zhuǎn)接到不同濃度激素配比的MS培養(yǎng)基中，MS+O.5mg/LNAA+3.0mg/L6-BA培養(yǎng)基誘導(dǎo)出球莖所需時間短，且球莖生長快。黑暗條件下不能誘導(dǎo)出球莖，40天后光照條件下不定芽的小球莖誘導(dǎo)率可達65.2%。影響番紅花快繁的因素激素濃度組織培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵在于培養(yǎng)的條件，其中生長素和細胞分裂素的濃度是其中極為重要的因素。光照條件在番紅花愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽誘導(dǎo)和芽增殖培養(yǎng)都應(yīng)在黑暗條件下進行，誘導(dǎo)球莖應(yīng)在光照條件下進行。溫度影響番紅花每年11月到次年4月生長，5月到10月休眠。在組培中，溫度過高，苗的長勢差，并伴有褐化發(fā)生。2(TC左右時，苗生長旺盛。3(TC以上時，苗會褐化死亡，這與番紅花田間生長習性相一致，栽培番紅花亦表現(xiàn)為5月進入枯萎休眠狀態(tài)。具體實施例方式下面根據(jù)實施例對本發(fā)明進一步詳細說明實施例1(1)以當年生番紅花的球莖為外植體，將球莖于自來水中沖洗干凈，除去皮膜，置于超凈工作臺上消毒接種。先于70%酒精中漂洗30s，再用0.1%HgCl2消毒8-10min，最后用無菌水沖洗5次，徹底洗去殘余的HgCl2。(2)將消毒后的球莖切成lcm3大小，接種于MS+0.5mg/LNAA+5.0mg/L6-BA培養(yǎng)基上，在黑暗條件(24小時無光照)下培養(yǎng)20天可收獲愈傷組織。愈傷組織可在此條件下長期繼代，不褐化。(3)將愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS+0.5mg/LNAA+2.Omg/L6-BA培養(yǎng)基上，20天后在黑暗條件下，20°C培養(yǎng)，可誘導(dǎo)出大量叢生芽。(4)將叢生芽切剖成單個芽后轉(zhuǎn)接到MS+0.5mg/LNAA+2.Omg/L6-BA培養(yǎng)基上，在黑暗條件(24小時無光照)下，2(TC培養(yǎng)，15天后芽長到2cm。(5)轉(zhuǎn)接到MS+0.5mg/LNAA+3.Omg/L6-BA培養(yǎng)基，在光照條件(光照時間12小時/天，光照強度15001x)下誘導(dǎo)出球莖。權(quán)利要求一種番紅花組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)外植體滅菌將球莖用水洗凈，除去皮膜，置于超凈工作臺上消毒接種；先于70％酒精中漂洗30-40秒，再用0.1％HgCl2消毒8-10分鐘，最后用無菌水沖洗4～5次，徹底洗去殘余的HgCl2，將消毒后的球莖切成1-1.5cm3，接種于培養(yǎng)基上；(2)愈傷組織誘導(dǎo)將經(jīng)過消毒滅菌后的上述球莖在無菌環(huán)境中接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+0.5mg/LNAA+5.0mg/L6-BA培養(yǎng)基上中，培養(yǎng)20天收獲愈傷組織；(3)叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)將愈傷組織接種到MS+0.5mg/LNAA+2.0mg/L6-BA培養(yǎng)基上，20天在黑暗條件下，20℃培養(yǎng)20天，誘導(dǎo)出叢生芽；(4)不定芽繼代培養(yǎng)將叢生芽切割成單個芽后轉(zhuǎn)接到MS+0.5mg/LNAA+2.0mg/L6-BA培養(yǎng)基上，在黑暗條件24小時無光照下，20±2℃培養(yǎng)，15天后芽長到2-3cm；(5)球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)當芽高2-3cm時轉(zhuǎn)接到MS+0.5mg/LNAA+3.0mg/L6-BA培養(yǎng)基，在光照條件下誘導(dǎo)出球莖。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種番紅花組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其特征在于所述步驟(2)、(3)和(4)的黑暗條件為24小時無光照。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種番紅花組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其特征在于所述步驟(5)的光照條件為光照時間12h/d，光照強度150020001x。全文摘要本發(fā)明公開了一種番紅花組織培養(yǎng)快速繁殖方法，該方法包括外植體滅菌、愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、不定芽繼代培養(yǎng)和球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)等步驟，最后誘導(dǎo)出球莖。本發(fā)明利用組織培養(yǎng)的方法，進行番紅花愈傷組織及小球莖誘導(dǎo)，建立優(yōu)系番紅花的繁殖體系，進行種苗的工廠化育苗生產(chǎn)，能快速大量繁殖優(yōu)系品種。文檔編號C12N5/04GK101720667SQ20081020102公開日2010年6月9日申請日期2008年10月10日優(yōu)先權(quán)日2008年10月10日發(fā)明者宋嬿,楊弘,汪洋,秦路平申請人:上海華宇藥業(yè)有限公司