專利名稱：角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因及其制備方法和所用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因及其制備方法和 所用引物。
背景技術(shù)：
角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因(命名為c/z/5S)的基因序列如SEQ ID NO: l所 示，其編碼的氨基酸序列(角毛殼菌幾丁質(zhì)酶)如SEQ ID NO: 3所示。
巴斯德畢赤酵母(/^/2^/7^to;^)表達系統(tǒng)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的 優(yōu)秀的真核表達系統(tǒng)，但是在巴斯德畢赤酵母中獲得高效表達的外源基因往往 都是酵母偏愛密碼子所編碼的基因；所以角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因(c/z"S)在 巴斯德畢赤酵母中不能高效表達。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因。W5S)在巴斯德畢赤 酵母中不能高效表達的問題，而提供的一種c/z/5S密碼子偏愛性突變體基因及 其編碼的氨基酸和基因的制備方法及所用引物。
本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性改造突變體基因序列如SEQ ID NO: 2所示。
本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性改造突變體基因按以下步驟 制備
一、 提取角毛殼菌總RNA:
二、 分離角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因采用RT-PCR法分離角毛殼菌幾丁質(zhì)酶 基因，再以角毛殼菌幾丁質(zhì)酶cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增；
三、 克隆步驟二 PCR擴增產(chǎn)物回收PCR擴增產(chǎn)物，然后與pMD-18T 克隆載體連接，再轉(zhuǎn)化ECo/z'JM109感受態(tài)細胞，并進行藍白斑篩選；
四、 挑取陽性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47進行PCR， PCR反 應(yīng)條件為95'C預(yù)變性10min， 9fC變性30s、 5(TC退火30s、 72""C延伸90s、共
35個循環(huán)，72。C延伸10min;
五、 以步驟四PCR擴增產(chǎn)物pMD18-T-A/5S為模板突變擴增待融合片段 A: PCR反應(yīng)體系為50jiL，由5pL 10xpyrobest buffer、 4jiL dNTP、 lpL濃度 為20pmol/L引物Pnl、 lpL濃度為20^imol/L引物Pn2、 0.25pL高信度擴增酶 Pj;ra6e^DNApolymerase、 l(iL突變擴增模板和余量的ddH20組成；PCR反應(yīng) 條件為94。C變性30s、 56.8。C退火30s、 72。C延伸lmin，共25個循環(huán)；其中上 游 引 物 Pnl 的 基 因 序 歹U 為 5'-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3，； 下游引物Pn2的基因 序歹U為5,-TTGAGTCTCGCTCTTAGTCTCTTGAGCAGGTTGACG畫3，；
六、 以步驟四PCR擴增產(chǎn)物pMD18-T-c^'5S為模板突變擴增待融合片段 B: PCR反應(yīng)體系為50jaL，由5fiL 10xpyrobest buffer、 4(iL dNTP、 lpL濃度 為20pmol/L引物Pn3、 lpL濃度為20fimol/L引物Pn4、 0.25pL高信度擴增酶 尸,o6ewDNApolymerase、 l)iL突變擴增模板和余量的ddH20組成；PCR反應(yīng) 條件為94。C變性30s、 57.2。C退火30s、 72。C延伸lmin，共25個循環(huán)；其中上 游 引 物 Pn3 的 基 因 序 列 為 5，-GCTCAAGJ04CTA^04GCGv404CTCAACAGCATC-3，； 下游引物Pn4的 基因序列為5，-ACTCTCTCGGGGTTGATGTTGTTTCTCCAAAGCAGC-3，；
七、 以步驟四PCR擴增產(chǎn)物pMD18-T-c/z/5S為模板突變擴增待融合片段 C: PCR反應(yīng)體系為50jiL，由5pL 10xpyrobest buffer、 4pL dNTP、 lpL濃度 為20pmol/L引物Pn5、 lpL濃度為20(imol/L引物Pn6、 0.25|iL高信度擴增酶 /^ra^^DNApolymerase、 lpL突變擴增模板和余量的ddH20組成；PCR反應(yīng) 條件為94"C變性30s、 58.5匸退火30s、 72。C延伸lmin，共25個循環(huán)；其中上 游 引 物 Pn5 的 基 因 序 列 為 5,-GGJ04AACAACATCAACCCCGAGJ04GTCAACC畫3，； 下游引物Pn6的 基因序列為5'-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3，；
八、 用瓊脂糖凝膠電泳純化回收突變擴增待融合片段A、 B和C，然后進 行融合PCR:由5pL 10xpyrobest buffer、 4pL dNTP、 0.25pL高信度擴增酶 iVo&wDNApolymerase、 lpL濃度為10ng/pL的突變擴增待融合片段A、 lpL 濃度為10ng/nL的突變擴增待融合片段B、 l)iL濃度為10ng/pL的突變擴增待
融合片段C和余量的ddH20組成的體積為50|iL的融合PCR反應(yīng)體系先進行 94。C變性30s、 60。C退火2min、 72。C延伸3min， 8個循環(huán)；然后加入l^iL濃 度為20|imol/L引物Pnl和lpL濃度為20(miol/L引物Pn6，再進行94。C變性 30s、 60。C退火30s、 72。C延伸5min， 20個循環(huán)；純化、回收，即得到角毛殼 菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因。
本發(fā)明用于制備角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因的引物 Pnl的基因序列如SEQIDNO: 5所示，引物Pn2的基因序列如SEQ ID NO: 6所示，引物Pn3的基因序列如SEQIDNO: 7所示，引物Pn4的基因序列如 SEQIDNO: 8所示，引物Pn5的基因序列如SEQIDNO: 9所示，引物Pn6 的基因序列如SEQ ID NO: 10所示。
本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因與真核表達載體 pPIC9K連接構(gòu)建重組表達載體，再經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后表達的蛋白質(zhì)分子量為58 kD，等電點pl為4.47，經(jīng)測序檢測氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，證實 為角毛殼菌幾丁質(zhì)酶，說明本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體 基因是一個具有表達功能的基因。
其它條件均相同的情況下，與原角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵 母相比本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因轉(zhuǎn)化巴斯德畢 赤酵母獲得的幾丁質(zhì)酶的酶活性提高了約3倍；說明本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶 基因密碼子偏愛性突變體基因可以在巴斯德畢赤酵母中高效表達。
本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因的制備方法采用 具有互補末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，在不需要內(nèi)切酶消化和連接 酶處理的條件下實現(xiàn)DNA片段的拼接，能夠高效、快速地實現(xiàn)基因的定點突 變，且不引入其它突變，保障了非突變區(qū)序列的正確性，所獲得的角毛殼菌幾 丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因片段可用于后續(xù)的分子克隆。
角毛殼菌幾丁質(zhì)酶完整的開放讀碼框基因序列如SEQIDNO: 4所示。本 發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因的制備方法對角毛殼菌 幾丁質(zhì)酶基因5個位點進行突變，將原角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因開放讀碼框第 868bp 870bp處序列CGC換成序列AGA，將原角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因開放讀 碼框第874bp 876bp處序列CGC換成序列AGA，將原角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因
開放讀碼框第880bp 882bp處序列CGC換成序列AGA，將原角毛殼菌幾丁質(zhì) 酶基因開放讀碼框第1108bp 1110bp處序列CGC換成序列AGA，將原角毛殼 菌幾丁質(zhì)酶基因開放讀碼框第1168bp 1170bp處序列CGC換成序列AGA;角 毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體氨基酸序列與角毛殼菌幾丁質(zhì)酶氨 基酸序列相同、沒有改變。
本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因的制備方法步驟 八中引物之間都通過重疊搭橋進行擴增反應(yīng)，因此在最初的8個循環(huán)反應(yīng)中不 加引物，模板間自動退火搭橋形成長鏈，同時適當(dāng)?shù)难娱L了退火時間，提高了 反應(yīng)的成功率。
本發(fā)明中突變引物的重疊區(qū)長，重疊區(qū)堿基均在27bp左右，提高了引物 與模板結(jié)合的特異性。
具體實施例方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方 式間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體 基因序列如SEQIDNO: 2所示。
具體實施方式
二本實施方式角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體
基因按以下步驟制備-
一、 提取角毛殼菌總RNA:
二、 分離角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因采用RT-PCR法分離角毛殼菌幾丁質(zhì)酶 基因，再以角毛殼菌幾丁質(zhì)酶cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增；
三、 克隆步驟二 PCR擴增產(chǎn)物回收PCR擴增產(chǎn)物，然后與pMD-18T 克隆載體連接，再轉(zhuǎn)化ECW/JM109感受態(tài)細胞，并進行藍白斑篩選；
四、 挑取陽性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47進行PCR， PCR反 應(yīng)條件為95X:預(yù)變性10min， 94""C變性30s、 5(TC退火30s、 72'C延伸90s、共 35個循環(huán)，72。C延伸10min;
五、 以步驟四PCR擴增產(chǎn)物pMD18-T-W/5S為模板突變擴增待融合片段 A: PCR反應(yīng)體系為50pL，由5pL lOxpyrobest buffer、 4pL dNTP、 lpL濃度 為20(imol/L引物Pnl、 1^L濃度為20|amol/L引物Pn2、 0.25pL高信度擴增酶尸少ra&WDNA polymerase、 lpL突變擴增模板和余量的ddH20組成；PCR反應(yīng) 條件為94。C變性30s、 56.8。C退火30s、 72"C延伸lmin，共25個循環(huán)；其中上 游 引 物 Pnl 的 基 因 序 列 為
5'-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3，； 下游引物Pn2的基因 序歹U為5 ，-TTGAGTCTCGCTCTTAGTCTCTTGAGCAGGTTGACG-3 ，；
六、 以步驟四PCR擴增產(chǎn)物pMD18-T-c/n'5S為模板突變擴增待融合片段 B: PCR反應(yīng)體系為50pL，由5|iL 10xpyrobest buffer、 4jiL dNTP、 ljiL濃度 為20pmol/L引物Pn3、 1^iL濃度為20(xmol/L引物Pn4、 0.25pL高信度擴增酶 /Vo6eWDNApolymerase、 l(iL突變擴增模板和余量的ddH20組成；PCR反應(yīng) 條件為94。C變性30s、 57.2X:退火30s、 72"延伸lmin，共25個循環(huán)；其中上 游 引 物 Pn3 的 基 因 序 列 為 5，-GCTCAAG」04CTA^a4GCG^04CTCAACAGCATC-3，； 下游引物Pn4的 基因序列為5，-ACTCTCTCGGGGTTGATGTTGTTTCTCCAAAGCAGC國3，；
七、 以步驟四PCR擴增產(chǎn)物pMD18-T-A說為模板突變擴增待融合片段 C: PCR反應(yīng)體系為50pL，由5jiL 10xpyrobest buffer、 4pL dNTP、 lpL濃度 為20|imol/L引物Pn5、 l(iL濃度為20pmol/L引物Pn6、 0.25pL高信度擴增酶 /Vr Z^wDNA polymerase、 lfxL突變擴增模板和余量的ddH20組成；PCR反應(yīng) 條件為94。C變性30s、 58.5。C退火30s、 72。C延伸lmin，共25個循環(huán)；其中上 游 引 物 Pn5 的 基 因 序 歹U 為 5，-GG^04AACAACATCAACCCCGAG^04GTCAACC-3，； 下游引物Pn6的 基因序列為5，-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3，；
八、 用瓊脂糖凝膠電泳純化回收突變擴增待融合片段A、 B和C，然后進 行融合PCR:由5pL 10xpyrobest buffer、 4|iL dNTP、 0.25nL高信度擴增酶 iVo&WDNApolymemse、 l(iL濃度為10ng/pL的突變擴增待融合片段A、 lpL 濃度為10ngVL的突變擴增待融合片段B、 lpL濃度為10ng/VL的突變擴增待 融合片段C和余量的ddH20組成的體積為50pL的融合PCR反應(yīng)體系先進行 9fC變性30s、 6(TC退火2min、 72。C延伸3min， 8個循環(huán)；然后加入lpL濃 度為20pmol/L引物Pnl和lpL濃度為20jxmol/L引物Pn6，再進行94。C變性 30s、 6(TC退火30s、 72X:延伸5min， 20個循環(huán)；純化、回收，即得到角毛殼
菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因。
本實施方式得到的角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因序列
如SEQIDNO: 2所示，本實施方式角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變 體基因的制備方法對角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因5個位點進行突變，將原角毛殼菌 幾丁質(zhì)酶基因開放讀碼框第868bp 870bp處序列CGC換成序列AGA，將原角 毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因開放讀碼框第874bp 876bp處序列CGC換成序列AGA， 將原角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因開放讀碼框第880bp 882bp處序列CGC換成序列 AGA，將原角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因開放讀碼框第1108bp 1110bp處序列CGC 換成序列AGA，將原角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因開放讀碼框第1168bp 1170bp處 序列CGC換成序列AGA;角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體氨基酸 序列與角毛殼菌幾丁質(zhì)酶氨基酸序列相同、沒有改變。
將本實施方式得到的角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因與 真核表達載體pPIC9K重組構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pPIC9K-c/n'5&4，然后采用電轉(zhuǎn) 化方法轉(zhuǎn)化到真核表達宿主菌巴斯德畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞中，涂布于 MD平板培養(yǎng)基在3(TC條件下培養(yǎng)2~3天，之后將MD平板培養(yǎng)基上生長的 轉(zhuǎn)化菌落分別點種到MM和MD平板培養(yǎng)基的相應(yīng)位置上在3(TC條件下培養(yǎng) 2~3天，并根據(jù)菌落在MM平板上的生長情況鑒定轉(zhuǎn)化子的表型(在MM平 板培養(yǎng)基上生長正常的轉(zhuǎn)化子是Mut+型轉(zhuǎn)化子；而在MM平板培養(yǎng)基上生長 遲緩的轉(zhuǎn)化子是Muf型轉(zhuǎn)化子)；再選擇Mut+型轉(zhuǎn)化子進行誘導(dǎo)表達挑選 Mut+型轉(zhuǎn)化子單菌落置于裝有25mL BMGY培養(yǎng)基的250mL搖瓶中在 28 30°C、 250~300 r/min的條件下培養(yǎng)至OD, = 2 6 (培養(yǎng)時間為16~18h)， 然后在室溫、1500~3000g的條件下離心5min，收集菌體用BMMY重懸菌體 使OD6Q()=1.0;將BMMY重懸菌液用雙層紗布或粗棉布封口放置于28~30°C、 250-300 r/min的環(huán)境中繼續(xù)生長，每隔24h向培養(yǎng)基中添加濃度為100%的甲 醇至菌液中甲醇的終濃度為0.5 1.0%;連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)120h (幾丁質(zhì)酶活性最 高)、并在4"C、 8000 r/min條件下離心10min，得到的上清液為含有角毛殼菌 幾丁質(zhì)酶的粗酶液。
采用改良的Schales法測定角毛殼菌幾丁質(zhì)酶粗酶液的酶活性(將OD值 換算成氨基葡萄糖產(chǎn)量，以每小時分解膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)生lpg氨基葡萄糖為一個 酶活力單位，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=158.21X+1.5629，其中X為OD值，Y為 氨基葡萄糖量pg，直線相關(guān)系數(shù)112=0.9943),本實施方式角毛殼菌幾丁質(zhì)酶 粗酶液的酶活為118U/mL。經(jīng)測定本實施方式得到的角毛殼菌幾丁質(zhì)酶分子量 為58kD，等電點pl為4.47;證明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體 基因片段可用于后續(xù)的分子克隆，并在巴斯德畢赤酵母中高效表達。
本實施方式中使用的藥品、試劑、酶、感受態(tài)細胞和質(zhì)粒等均容易購得， 若無特殊要求則濃度為產(chǎn)品標(biāo)注濃度。本實施方式中的操作步驟參見試劑盒使 用操作手冊。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
二的不同點是步驟二按以 下步驟實施
a、 將5pL角毛殼菌總RNA、 8pL RNase-free H20和2pL引物01igod18 T 混勻后置于70。C的環(huán)境中5min，然后放于冰上；
b、 將5pL 5xMLVBuffer、 L25(iL dNTPmix、 0.6pL鐵調(diào)節(jié)蛋白(IRP)、 1jiL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和2.5pL ddH20混合；
c、 將a步驟和b步驟得到反應(yīng)體系混合，再置于42。C環(huán)境中反轉(zhuǎn)錄lh;
d、 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA PCR擴增PCR反應(yīng)體系為25pL，由2pL 10mM dNTP、 2pL 25mM MgCl2、 5U五x Taq DNA聚合酶、10pM上游引物Pnl、 10pM 下游引物Pn6、 2|iL步驟c反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和余量的ddH20組成，PCR反應(yīng)條件為 94°C預(yù)變性5min， 94。C變性20s、 57。C退火30s、 72'C延伸30s、 35個循環(huán)， 72。C延伸10min;
其中步驟 d 中上游引物 Pnl 的基因序列為 5，-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3,: 下游引物Pn6的基因 序列為5,-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT國3，。 其它步驟 及參數(shù)與實施方式二相同。
本實施方式引物Pnl和Pn6中分別引入Ecoi I和A^oH酶切位點(加下劃 線處為酶切位點)，兩引物之間相距1506bp，擴增產(chǎn)物去除了幾丁質(zhì)酶信號肽 序列。
具體實施方式
四本實施方式用于制備角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛 性突變體基因的引物基因序列為 Pnl: 5，-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT國3，， Pn2: 5 ，-TTGAGTCTCGCTCTTAGTCTCTTGAGCAGGTTGACG-3 ，， Pn3: 5，-GCTCAAGJ04CTA^04GCG/4G4CTCAACAGCATC國3，， Pn4: 5 ，-ACTCTCTCGGGGTTGATGTTGTTTCTCCAAAGCAGC-3 ，， Pn5: 5 ， -GGJ 04 A AC AAC ATC AACCCCGAG^ 04GTC AACC-3 ，， Pn6: 5，-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3 ，。 本實施方式引物Pnl和Pn6中分別加入了I和I酶切位點(加 下劃線部分)，引物Pn3和Pn5中斜體加粗部分為突變位點。
序列表
〈110〉哈爾濱工業(yè)大學(xué)
<120〉角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因及其制備方法和所用引物
<160〉 10
〈210〉 1 <211> 2065 〈212〉 DNA
<213〉毛殼菌屬(Chaetomium)
〈400> 1
ctgttUgtgtgccaccgttctgctctctgtgccagtctccaaccggcctgtccatcaag60
attcgaccttggtcgttgtgactgcctatcatga已gacgtctctgagctgcgtcttgctc120
tgggctgggctggccgtggcCgCgtCC3gCtatgagtctagtttcctcgtccaagcccgc180
cagagcacgaggcaa^gctctggacgcgagacgactcagacccgaagtgcaccaaggat240
attccgtgca卿tcgggtgctgtgggccattgtaggtctatcgctctcagat犯acatc300
gcgcaatgctgacggccacgaceigagacaaagacactggtgtcggcatctgcggcttggg360
accaaccttctgcggcgacgggtgcacctcgtcgtgcgactac^gagcgagtgcgaccc420
鵬ctggggcatgcagtggtccaacgcatcgacgtgccccctcaacgtgtgctgcagtga480
ctttggtttctgcggcacgaccgatgagttctgc犯gggc卿g鄉(xiāng)tgtcggtcccgca540
gtgcgacccggccgccaacagctcgcacgcgcgcaccgtcggctactatgagggctggaa600
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cg卿caggtaccctgtacggtgacgtctcggctatcaagaaccgccagccgggcgtgca780
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ttc犯acctggcc犯ggacg鄉(xiāng)cggcgcaggacgagttcttcgaggccctggtcacttt900
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t卿ggtggcagcgtcgaggactttgat犯ctacgtcaacctgctcaagcgcctacgcgc1020
gcgcctcaacagcatcggcgtgccgaagggcctgtctatcacgctgcccgcgtcgtactg1080
gt3tctg犯agggtttgacattgtcaacctcg已gccatatgtggactttttcaatgtcat1140
gacgtatgatattcgtgagtaacgttagcccatttgctgttcctcttgcttttaatccct1200
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gctgctttggtcaaccccgagcgcgtc已acctgggcctgggtttctscgg1500
tcgtagcttcaccatgaaagacccctcttgcatggccgccggctgtgagttcagctctgg1560
cggtaacggtggcagctgcacgggtaccccgggagtcctctcagcccacgagatcgtcca1620
^tcatc犯taacggcgcgacggtgaccacgg3Cg卿tggccgccgtggagattgtcac1680
ctgggacacc朋CC3gtgggtctcatgggaC3gC3CC朋gacgctggccatg3aggtc331740
ctacgccaacg解cgctgcctgggcggtgtcatggtctgggccatcgacctcgacgacgg1800
caccctaatc犯gtcacttgccgacacgggacggcccacctacaattacttgacggacct1860
cccctggatgacgggttgtttcggatccgcgtttgacgactggtcgagactgaatgactc1920
cgacatcg3tgttaatgctttagtcgtcttgtsatstgtc3tattgg33t1980
ggatactctagggtgaggaat t t ""t-HCHtXatattgcctg2040
cgataattaggttgtccgtggccag 2065
〈210> 2 〈211〉 1602 〈212〉 ■ 〈213>人工序列
〈220〉
〈221〉 CDS
〈222〉 (l)... (1602)
〈220〉
<223〉角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因。
<400> 2
atg aag acg tct ctg age tgc gtc ttg etc tgg get ggg ctg gcc gtg 48 Met Lys Thr Ser Leu Ser Cys Val Leu Leu Trp Ala Gly Leu Ala Val 15 10 15
gcc gcg tec age tat gag tct agt ttc etc gtc caa gcc cgc cag age 96 Ala Ala Ser Ser Tyr Glu Ser Ser Phe Leu Val Gin Ala Arg Gin Ser
20 25 30
acg agg caa aag etc tgg acg cga gac gac tea gate ccg aag tgc acc 144 Thr Arg Gin Lys Leu Trp Thr Arg Asp Asp Ser Asp Pro Lys Cys Thr
aag gat Lys Asp 50
act ggt Thr Gly 65
tgc acc Cys Thr
3tg cag Met Gin 100
gac ttt Asp Phe
gtg tcg Val Ser 130 acc gtc Thr Val 145
atg aag Met Lys
35
att
lie
gtc Val
tcg Ser
tgg Trp
ggt Gly 115 gtc Val
ggc Gly
ccg Pro
acc gag Thr Glu
cag ccg Gin Pro 210 gac ccc
Thr 195 ggc Gly
ccg tgc Pro Cys
ggc ate Gly lie
tcg Ser
tec Ser
tgc Cys 85
Asn
肪g ate Lys lie
55 tgc ggc Cys Gly 70
gac tac Asp Tyr
ttc tgc Phe Cys
ccg cag Pro Gin
tac tat Tyr Tyr
gcc ttc tcg Ala Phe Ser
tcg Ser
ttg Leu 180 ggt Gly
cag Gin 165 etc Leu
a_cc Thr
gca Ala 105 ggc Gly
tgc Cys
gag Glu 150 ate lie
tcg Ser
acg Thr
ggic Asp 135 ggc Gly
ccg Pro
ctg Leu
40
ggg Gly
tgc Cys
ttg gga Leu Gly
g3C ccc Asp Pro
tac Tyr
肪g Lys
acg Thr
acc Thr 120 ccg Pro
tgg Trp
etc Leu
3CC
Thr
ggt Gly 200 ate lie
age Ser
tgc Cys
gat Asp
gcc Ala
aac Asn
ggt Gly
aicc Thr 185 gac Asp
tgt Cys
CC3
Pro
gag
Glu
90
ccc
Pro
gag Glu
ggg Gly
ace
Thr
75
tgc
Cys
etc Leu 110 ttc Phe
gcc朋c Als Asn
tgg Trp
tat Tyr 170 ttc Phe
cag Gin 155 tac Tyr
egg Arg
gcc Ala
CC3
Pro 60 ttc Phe
gac Asp
犯c Asn
tgc Cys
3gc Ser 140 cgc Arg
45
tta
Leu
tgc Cys
ccg Pro
gtg Val
卿 Lys 125 tcg Ser
ccc Pro
gtc tcg Val Ser
get Ala
gac aaa gac 192 Asp Lys Asp
ggc Gly
ggc Gly
tgc Cys
geic Asp
tgg
Trp
95
tgc
Cys
ggg 240
Gly
80
ggc 288 Gly
agt 336
Ser
ggc卿gag 384 Gly Lys Glu
cac gcg cgc 432 His Ala Arg
agt cac Ser His
ctg tcg Leu Ser
ate ggc lie Gly
gtg caa gtc tgg Val Gin Val Trp 215
ggt ccg act egg ccg acg ttt tea aac
ate lie 205 tgg Trp
tgc Cys
att lie
ccc Pro 190 卿 Lys
ggc Gly
ttc Phe 175
Met
肪c Asn
acc 480
Thr
160
ttc 528 Phe
gat 576 Asp
cgc 624 Arg
gcg atg aat 672 Ala Met Asn
ggc Gly 220
ctg gcc aag gac gag 720Asp Pro Gly Pro Thr 225
gcg gcg Ala Ala_
sac gac Asn Asp
gat aga Asp Arg
aag ags Lys Arg 290 tct ate Ser Ile 305
gtc aac Val Asn
att cac Ile His
CAC GCC his ala
tgg卿 Trp Arg 370 tac ggt Tyr Gly 385
tgt gag Cys Glu
cag gac Gin Asp
tac Tyr
ggt Gly 275 eta Leu
gac Asp 260 ggc Gly
卿 Arg
acg ctg Thr Leu
etc gag Leu Glu
ggt Gly
CAC his 355
Asn
cgt Arg
ttc Phe
gtc Val 340 ACC thr
肪c Asn
age Ser
age Ser
gag Glu 245 ggt Gly
Arg Pro Thr Phe Ser 230
ttc ttc gag gcc Phe Phe Glu Ala
gtc Val
3gc gtc Ser Val
gcg aga Ala Arg
ccc Pro
CC3
Pro 325 tgg Trp
ttc Phe
tct Ser 405
3CC
Thr 390 ggc Gly
gat ate Asp Ile
gcg Ala 310
tat Tyr
gat Asp
AAC CTC asn leu
ate aac Ile Asn
gag Glu
etc Leu 295 teg Ser
gtg Val
teg Ser
ACC thr
ccc Pro 375 atg Met
gac Asp 280
Asn
tac Tyr
gac Asp
ElCg
Thr
GAG glu 360 gag Glu
aaa Lys
g3C
Asp 265 Ut Phe
ctg Leu 250 tgg Trp
gat Asp
age ate Ser Ile
tgg tat Trp Tyr
ggt aac Gly Asn
ttt Phe
gtc Val 345 ATC ile
卿 Arg
gac Asp
ggt Gly
ttc Phe 330 caa Gin
GAG glu
gtc Val
ccc Pro
ggc Gly 410
Asn 235 gtc Val
gsa_ Glu
aac Asn
ggc Gly
ctg Leu 315
Asn
sgc Ser
GAG glu
sac Asn
tct Ser 395 age Ser
Leu Ala Lys Asp Glu 240
act ttc atg atg gcc 768 Thr Phe Met Met Ala 255
tat Tyr
tac Tyr
gtg Val 300 aaa Lys
gtc Val
ctg Leu
GCA
al3
ctg Leu 380 tgc Cys
tgc Cys
ccc Pro
gtc Val 285 ccg Pro
ggg Gly
atg Met
ggg Gly
CTG leu 365 ggc Gly
artg Met
acg Thr
gtc Val 270
Asn
卿 Lys
ttt Phe
acg Thr
ccc Pro 350 AAG lys
ctg Leu
gcc Ala
ggt Gly
gcc Ala
ctg Leu
ggc Gly
gac Asp
tat Tyr 335 tat Tyr
gac 816 Asp
etc 864 Leu
ctg 912 Leu
att 960
Ile
320
gat 1008 Asp
gcc 1056 Ala
CTG CTT 1104
leu leu
ggt ttc 1152 Gly Phe
gcc Ala
Thr 415
ggc 1200
Gly
400
ccg 1248 Pro
gga gtc etc Gly Val Leu
acg gtg Thr Val
acc aac Thr Asn 450 gtc aac Val Asn 465
ate gac lie Asp
3CC
Thr 435 cag Gin
tac Tyr
etc Leu
egg ccc acc Arg Pro Thr
Uc gga Phe Gly
gat tea Asp Ser 530
tec Ser 515 ggs Gly
tea Ser 420 acg Thr
gcc Ala
gac Asp
tgg gtc Trp Vsl
gcc aac Ala Asn
gac Asp
tac Tyr 500 gcg Ala
gac Asp 485 aat Asn
ttt Phe
age agt Ser Ser
cac gag ate His Glu lie
gas Glu
tea Ser
gag Glu 470 ggc Gly
gtg Val
tgg Trp 455 cgc Arg
acc Thr
gcc Ala 440 gac Asp
tgc Cys
eta Leu
tac ttg acg Tyr Leu Thr
gac Asp
gac Asp
tgg Trp 520
taa 1602
gtc Val 425 gcc Ala
Gin
gtg Val
ate lie
gac Asp 505 teg Ser
Lys 490 etc Leu
卿 Arg
￡ltC 3tC 33t
lie lie Asn
age acc Ser Thr
ctg ggc Leu Gly
gag Glu
朋g Lys
ggt Gly 475 tea Ser
att lie
scg Thr 460 gtc Val
ctt Leu
gtc Val 445 ctg Leu
atg Met
gcc Ala
ccc tgg atg Pro Trp Met
ctg Leu
aat Asn
gac Asp 525
Asn 430
3CC
Thr
ggc Gly
tgg Trp
gcg Ala
gac Asp
1296
1344
gcc atg aag Ala Met Lys
1392
gtc Val
gac Asp
acg Thr 510
tec Ser
tgg Trp
acg Thr 495 ggt Gly
gac Asp
gcc Ala 480 gga Gly
tgt Cys
ate lie
1440
1488
1536
1584
〈210〉 3 〈211〉 533 〈212〉 PRT
<213〉毛殼菌屬(Chaetomium) 〈400〉 3
Met Lys Thr Ser Leu Ser Cys Val Leu Leu Trp Ala Gly Leu Ala Val 15 10 15
Ala Ala Ser Ser Tyr Glu Ser Ser Phe Leu Val Gin Ala Arg Gin Ser 20 25 30
Thr Arg Gin Lys Leu 35
lie Pro Cys
Lys Asp
50 Thr Gly 65
Cys Thr
Val
Ser
Gly Ser
Met Gin Trp Ser 100 Phe
lie
Cys
85
Asn
Cys
Asp Phe Gly 115
Val Ser Val Pro Gin 130
Thr Val Gly Tyr Tyr 145
Met Lys Pro Ser
Trp
Lys
Cys
70
Asp
Ala
Gly
Cys
Glu 150 lie
Thr
lie
55
Gly
Tyr
Ser
Thr
Arg
40
Gly
Leu
Asp Cys Gly
Asp Cys Pro
Ser Asp Pro 45 Leu
Gly
Thr 75 Cys
Lys Asp Gly
Asp Pro Gly
Pro 60 Phe
Cys
Lys Ser Glu 90
Pro Leu Asn Val
Thr
Cys 105
Asp Glu Phe Cys
Thr 120
Pro Ala Ala Asn
Asp 135
Gly Trp Asn Trp
Lys 125 Ser
Cys 110 Gly
His
Ser 140
Arg Pro Cys
Gin 165
Leu Asp Pro Thr
Gin 155
Tyr Ser His lie
Ala Phe Ser Leu 180
Gly Thr Leu Tyr
Pro Leu Gly Tyr 170
Phe Arg Leu Ser
Thr Glu Thr 195
Gly Val Gin Val
Thr 185
Asp Val Ser Ala
Cys Thr
Lys Asp
Asp Gly
80 Trp Gly 95
Cys Ser
Lys Glu
Ala Arg
Gly Thr 160 Phe Phe 175
Met Asp
Gin Pro 210 Asp Pro 225
Ala Als Asn Asp Asp Arg
Gly 200
lie Ala lie Gly
Pro 190
Lys Asn Arg
Gly Pro Thr Gin Tyr
Trp 215
Pro Thr Phe Ser
lie 205
Trp Ala Met Asn
Asp
Arg 230
Phe Phe Glu Ala
Gly 220
Leu Ala Lys
Glu 245
Gly Val Asp lie
Asp 260
Gly Ser Val Glu
Leu 250 Trp
Asn 235
Val Thr Phe Met
Glu
Gly 275
Lys Arg Leu Arg Ala Arg Leu 290 295 Ser lie Thr Leu Pro Ala Ser
Asp 265
Phe Asp Asn
Asp 280 : Asn Ser lie Gly
Tyr Tyr
Pro
Val 285 Pro
Asp Glu 240 Met Ala 255
Ala Asp
Val 270
Asn Leu Leu
Lys
Val 300
Tyr Trp Tyr Leu Lys Gly Phe
Gly Leu Asp lie
305
Val Asn Leu Glu
310
Tyr Val Asp Phe
Pro 325
Trp Asp Ser Thr
315
Asn Val Met Thr
lie His Gly Val 340
Thr Asn Leu Thr
Phe 330
Gin Ser Leu Gly
His Ala His 355
Asn Asn lie Asn
Trp
Arg 370
Gly Arg Ser Phe
Tyr 385
Cys Glu Phe Ser
Gly Val Leu Ser 420 Thr
Thr 390 Gly
Pro 375 Met
Glu 360 Glu
Val 345
lie Glu Glu Ala
Pro 350 Lys
Tyr 335 Tyr
320 Asp
Ala
Leu Leu
Ser 405
Ala His Glu lie
Arg Val Asn Lys Asp Pro Gly Asn Gly
Thr Val
Thr 435 Gin
Trp
Asp Val
Val 425 Ala
Gly 410 Gin
Thr Asn 450
Asn Tyr Ala Asn
Val 465
lie Asp Leu Asp
Arg Pro Thr Tyr 500
Ser
Glu 470 Gly
Trp 455 Arg
Thr
Asp 485
Asn Tyr Leu Thr
Cys Leu Gly Leu
lie
Asp 505
Leu 365
Gly Leu Gly Phe
Ser 395 Ser
Leu 380
Cys Met Ala Ala
Glu Val Ala 440
Asp Ser Thr Lys
Cys Thr Gly lie lie Asn Val Glu lie
Val 445 Leu
Asn 430 Thr
Thr 415 Gly
Trp
Gly 400 Pro
Ala
Asp
Ala Met Lys
Thr 460
Val Met Val Trp
Gly 475
Ser Leu Ala Asp
Lys 490
Leu Pro Trp
Met Thr 510
Thr 495 Gly
Ala 480 Gly
Cys
he Gly Ser Ala Phe Asp Asp Trp Ser Arg Leu Asn Asp Ser Asp lie
515 520 525
Asp Ser Gly Ser Ser 530
〈210〉 4 〈211〉 1602 <212> DNA
〈213〉毛殼菌屬(Chaetomium)<220〉 〈221〉 CDS <222> (1).
(1602)
〈400〉 4 atg aag Met Lys 1
gcc gcg Ala Ala
3Cg agg Thr Arg
aag gat Lys Asp
50 act ggt Thr Gly 65
tgc acc Cys Thr
atg cag Met Gin
gac ttt Asp Phe
gtg tcg Val Ser 130 acc gtc Thr Val 145
acg tct Thr Ser
tec Ser
caB
Gin
35
att
lie
gtc Val
tcg Ser
tgg Trp
ggt Gly 115 gtc Val
3gC
Ser 20
卿 Lys
ccg Pro
ggc Gly
tcg Ser
tec Ser 訓(xùn) ttc Phe
ccg Pro
ctg Leu 5
tat Tyr
age Ser
gag Glu
etc tgg Leu Trp
tgc犯g Cys Lys'
ate lie
tgc
Cys
85
aac
Asn
tgc
Cys
70
gac
Asp
gca Ala
tgc ggc Cys Gly
ggc tac Gly Tyr
cag Gin
tat Tyr
tgc Cys
gag Glu 150
tgc Cys
tct Ser
acg Thr
ate
lie
55
ggc
Gly
tac Tyr
tcg Ser
acg Thr
gac Asp 135 ggc Gly
gtc Val
agt Ser
Arg 40
ggg Gly
ttg Leu
卿 Lys
acg Thr
Thr 120 ccg Pro
tgg Trp
ttg Leu
ttc
Phe
25
gac
Asp
etc
Leu
10
etc
Leu
gac Asp
tgc tgt Cys Cys
gga cca Gly Pro
3gC g￡lg
Ser Glu 90
tgc Cys 105
gat gag Asp Glu
ccc Pro
gcc Ala
a8c Asn
tgg Trp
gtc Val
get Ala
Gin
tea gac Ser Asp
ggg Gly
3CC
Thr 75 tgc Cys
cca
Pro
60
Uc
Phe
gac Asp
gcc Ala
tgg Trp
Asn
cag Gin 155
age Ser 140 cgc Arg
ggg Gly
gcc Ala
ccg
Pro
45
tta
Leu
ctg Leu
cgc
Arg
30
卿
Lys
gac Asp
tgc ggc Cys Gly
ccg ggc Pro Gly
etc aac Leu Asn
ttc tgc Phe Cys
gtg Val
犯g Lys 125 tcg Ser
ccc Pro
tgc Cys 110 ggc Gly
cac His
tgc Cys
gcc
Ala
15
cag
Gin
tgc Cys
aaa Lys
gac Asp
tgg
Trp
95
tgc
Cys
gtg 48 Val
age 96 Ser
acc 144 Thr
gac 192 Asp
ggg 240
Gly
80
ggc 288 Gly
agt 336 Ser
aag gag 384 Lys Glu
gcg cgc 432 Ala Arg
ggc Gly
acc 480
Thr
160atg aag ccg tcg Met Lys Pro Ser
gcc ttc Ala Phe
acc gag Thr Glu
cag ccg Gin Pro 210 g3C ccc Asp Pro 225
gcg gcg Ala Ala
朋c gac Asn Asp
gat 3g3 Asp Arg
aag cgc Lys Arg 290 tct ate Ser lie 305
gtc aac Val Asn
tcg Ser
Thr 195 ggc Gly
ttg Leu 180 ggt Gly
gtg Val
tac Tyr.
ggt Gly 275 eta Leu
C3g
Gin 165 etc Leu
ate lie
Asp
ccg etc ggt Pro Leu Gly
acc ctg Thr Leu
caa gtc Gin Val
ggt ccg Gly Pro
cag gac Gin Asp
gac Asp 260 ggc Gly
cgc Arg
act Thr
gag Glu 245 ggt Gly
egg Arg 230 ttc Phe
gtc Val
age gtc Ser Val
gcg cgc Als Arg
acg ctg Thr Leu
etc gag Leu Glu
att cac ggt gtc lie His Gly Val
ccc Pro
Pro 325 tgg Trp
ccc Pro
tac Tyr
tgg Trp 215 ccg Pro
3CC
Thr
ggt Gly 200 ate lie
acg Thr
3CC
Thr 185 gac Asp
gcc Ala
ttt Phe
gcg Ala 310 tat Tyr
gat Asp
gat Asp
gsg Glu
etc Leu 295 tcg Ser
ate lie
gac Asp 280
Asn
tac Tyr
tat Tyr 170 ttc Phe
tac Tyr
egg Arg
gtc tcg Val Ser
ate ggc lie Gly
ttc gag gcc Phe Glu Ala
gate Asp 265 ttt Phe
age Ser
tgg Trp
tea Ser
ctg Leu 250 tgg Trp
朋c Asn 235 gtc Val
g朋 Glu
gtg gac Ut Val Asp Phe
tcg acg gtc Ser Thr Val
tat Tyr
ttc Phe 330 caa Gin
ctg Leu 315 aat Asn
age Ser
agt Ser
ctg Leu
get Ala
ggc Gly 220 ctg Leu
cac His
tcg Ser
ate lie 205 tgg Trp
gcc Ala
gat aac Asp Asn
ate ggc lie Gly
tac Tyr
gtg Val 300 aaa Lys
gtc Val 285 ccg Pro
ggg Gly
att lie
ccc Pro 190
Lys
Uc Phe 175 stg Met
aac Asn
ttc 528 Phe
gat 576 Asp
cgc 624 Arg
gcg atg aat 672 Ala Met Asn
act ttc Thr Phe
tat ccc Tyr Pro
aag Lys
atg Met
gtc Val 270
Asn
gac Asp
stg Met 255 gcc Ala
ctg Leu
gag 720
Glu
240
gcc 768 Ala
gac 816 Asp
etc 864 Leu
aag ggc ctg 912 Lys Gly Leu
gtc atg Val Met
ctg ggg Leu Gly
ttt Phe
acg Thr
ccc Pro
gac Asp
tat Tyr 335 tat Tyr
att 960
lie
320
gat 1008 Asp
gcc 1056 Ala C3C gcc His Als
tgg cgc Trp Arg 370 tac ggt Tyr Gly 385
tgt gag Cys Glu
gga gtc Gly Val
acg gtg Thr Val
acc aac Thr Asn 450 gtc aac Val Asn 465
ate gac lie Asp
egg ccc Arg Pro
cac His 355 aac Asn
340 acc Thr
Asn
aac Asn
ate lie
etc acc Leu Thr
cgt age ttc Arg Ser Phe
ttc Phe
etc Leu
3CC
Thr 435 cag Gin
age Ser
tea Ser 420 acg Thr
tgg Trp
tct Ser 405 gcc Ala
gac Asp
gtc Val
etc Leu
6LCC
Thr
ttc gga Phe Gly
gac Asp
tac Tyr 500 gcg Ala
Asn
3CC
Thr 390 ggc Gly
ccc Pro 375
atg Met
ggt Gly
cac gag His Glu
g肪gtg Glu Val
tac gcc aac Tyr Ala Asn
gac Asp 485
Asn
tea Ser
gag Glu 470 ggc Gly
tac Tyr
tgg Trp 455 cgc Arg
8CC
Thr
ttg Leu
g鄧 Glu 360
gag Glu
aaa lys
aac Asn
ate lie
gcc Ala 440 gac Asp
tgc Cys
eta Leu
Thr
tec gcg ttt gac gac tgg
Ser Ala Phe Asp Asp Trp 515 520
gat tea gga age agt taa 1602
345 ate lie
cgc Arg
gac Asp
ggt Gly
gtc Val 425 gcc Ala
age Ser
ctg Leu
ate lie
g￡tc Asp 505 teg Ser
gag gag Glu Glu
gtc aac Val Asn
ccc Pro
ggc Gly 410
Gin
tct Ser 395 age Ser
atc' lie
gtg g3g Val Glu
axx aag Thr Lys
ggc Gly
肪g Lys 490 etc Leu
ggt Gly 475 tea Ser
ccc Pro
gca Ala
ctg Leu 380
tgc Cys
tgc Cys
a_tc lie
att lie
acg Thr 460 gtc Val
ctg Leu 365 ggc Gly
atg Met
acg Thr
犯t Asn
gtc Val 445 ctg Leu
Eltg
Met
350 犯g Lys
卿ctg Arg Leu
tgg Trp
Asn
ctg Leu
cU Leu
1104
ctg ggt ttc Leu Gly Phe
1152
gcc Ala
ggt Gly
犯c Asn 430 acc Thr
gcc Ala
EICC
Thr 415 ggc Gly
tgg Trp
ggc Gly 400 ccg Pro
gcg Ala
gac Asp
1200
1248
1296
1344
gcc atg aag Ala Met Lys
1392
ctt gcc Leu Ala
atg Met
gac Asp 525
gtc Val
gac Asp
acg Thr 510 tec Ser
tgg Trp
acg Thr 495 ggt Gly
gac Asp
gcc Ala 480 gga Gly
tgt Cys
■ate lie
1440
1488
1536
1584
Asp Ser Gly Ser Ser 530
〈210> 5 〈211〉 30 〈212> DNA 〈213〉人工序列
〈220>
<223〉用于制備角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因的引物Pnl。 <400〉 5
gaccggaatt cagcacgagg caaaagctct 30
<210〉 6 〈211> 36 〈212〉腿 〈213〉人工序列
〈220〉
<223>用于制備角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因的引物Pn2。 〈400> 6
ttgagtctcg ctcttagtct cttgagcagg ttgacg 36
〈210〉 7
〈211〉 34
〈212〉 DNA 〈213>人工序列
<220>
〈223>用于制備角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因的引物Pn3。 <400> 7
gctcaagaga ctaagagcga gactcaacag catc 34
〈210> 8 <211> 36 〈212〉 ■ <213>人工序列
〈220〉
〈223〉用于制備角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因的引物Pn4。 〈400〉 8
actctctcgg ggttgatgtt gtttctccaa agcagc 36
<210> 9 〈211〉 33 <212>纖 〈213>人工序列
〈220〉
<223〉用于制備角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因的引物Pn5。 〈400〉 9
ggagaaac犯catcaacccc gagagagtca acc 33
<210〉 10 <211> 34 〈212〉腿 〈213〉人工序列
〈220〉
〈223〉用于制備角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因的引物Pn6。 〈400〉 10
ccagcggccg cttaactgct tcctgaatcg atgt 3權(quán)利要求
1、角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因，其特征在于角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性改造突變體基因序列如下所示ATGAAGACGTCTCTGAGCTGCGTCTTGCTCTGGGCTGGGCTGGCCGTGGCCGCGTCCAGCTATGAGTCTAGTTTCCTCGTCCAAGCCCGCCAGAGCACGAGGCAAAAGCTCTGGACGCGAGACGACTCAGACCCGAAGTGCACCAAGGATATTCCGTGCAAGATCGGGTGCTGTGGGCCATTAGACAAAGACACTGGTGTCGGCATCTGCGGCTTGGGACCAACCTTCTGCGGCGACGGGTGCACCTCGTCGTGCGACTACAAGAGCGAGTGCGACCCGGGCTGGGGCATGCAGTGGTCCAACGCATCGACGTGCCCCCTCAACGTGTGCTGCAGTGACTTTGGTTTCTGCGGCACGACCGATGAGTTCTGCAAGGGCAAGGAGGTGTCGGTCCCGCAGTGCGACCCGGCCGCCAACAGCTCGCACGCGCGCACCGTCGGCTACTATGAGGGCTGGAACTGGCAGCGCCCCTGCGGCACCATGAAGCCGTCGCAGATCCCGCTCGGTTATTACAGTCACATTTTCTTCGCCTTCTCGTTGCTCGACCCCACCACCTTCCGGCTGTCGCCCATGGATACCGAGACAGGTACCCTGTACGGTGACGTCTCGGCTATCAAGAACCGCCAGCCGGGCGTGCAAGTCTGGATCGCCATCGGCGGCTGGGCGATGAATGACCCCGGTCCGACTCGGCCGACGTTTTCAAACCTGGCCAAGGACGAGGCGGCGCAGGACGAGTTCTTCGAGGCCCTGGTCACTTTCATGATGGCCAACGACTACGACGGTGTCGATATCGACTGGGAATATCCCGTCGCCGACGATAGAGGTGGCAGCGTCGAGGACTTTGATAACTACGTCAACCTGCTCAAGAGACTAAGAGCGAGACTCAACAGCATCGGCGTGCCGAAGGGCCTGTCTATCACGCTGCCCGCGTCGTACTGGTATCTGAAAGGGTTTGACATTGTCAACCTCGAGCCATATGTGGACTTTTTCAATGTCATGACGTATGATATTCACGGTGTCTGGGATTCGACGGTCCAAAGCCTGGGGCCCTATGCCCACGCCCACACCAACCTCACCGAGATCGAGGAGGCACTGAAGCTGCTTTGGAGAAACAACATCAACCCCGAGAGAGTCAACCTGGGCCTGGGTTTCTACGGTCGTAGCTTCACCATGAAAGACCCCTCTTGCATGGCCGCCGGCTGTGAGTTCAGCTCTGGCGGTAACGGTGGCAGCTGCACGGGTACCCCGGGAGTCCTCTCAGCCCACGAGATCGTCCAAATCATCAATAACGGCGCGACGGTGACCACGGACGAAGTGGCCGCCGTGGAGATTGTCACCTGGGACACCAACCAGTGGGTCTCATGGGACAGCACCAAGACGCTGGCCATGAAGGTCAACTACGCCAACGAGCGCTGCCTGGGCGGTGTCATGGTCTGGGCCATCGACCTCGACGACGGCACCCTAATCAAGTCACTTGCCGACACGGGACGGCCCACCTACAATTACTTGACGGACCTCCCCTGGATGACGGGTTGTTTCGGATCCGCGTTTGACGACTGGTCGAGACTGAATGACTCCGACATCGATTCAGGAAGCAGTTAA。
2、角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性改造突變體基因的制備方法，其 特征在于角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性改造突變體基因按以下步驟制 備一、 提取角毛殼菌總RNA:二、 分離角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因采用RT-PCR法分離角毛殼菌幾丁質(zhì)酶 基因，再以角毛殼菌幾丁質(zhì)酶cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增；三、 克隆步驟二 PCR擴增產(chǎn)物回收PCR擴增產(chǎn)物，然后與pMD-18T 克隆載體連接，再轉(zhuǎn)化五.Cb/z'JM109感受態(tài)細胞，并進行藍白斑篩選；四、 挑取陽性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47進行PCR, PCR反 應(yīng)條件為95"C預(yù)變性10min， 94"變性30s、 5(TC退火30s、 72。C延伸90s、共 35個循環(huán)，72。C延伸10min;五、 以步驟四PCR擴增產(chǎn)物pMD18-T-c/z/5S為模板突變擴增待融合片段 A: PCR反應(yīng)體系為50nL，由5pL lOxpyrobest buffer、 4jxL dNTP、 lpL濃度 為20pmol/L引物Pnl、 lpL濃度為20p"nol/L引物Pn2、 0.25卩iL高信度擴增酶 /Vo6e"DNApolymerase、 lpL突變擴增模板和余量的ddH20組成；PCR反應(yīng) 條件為94。C變性30s、 56.8。C退火30s、 72'C延伸lmin，共25個循環(huán)；其中上 游 引 物 Pnl 的 基 因 序 列 為 5，-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT國3，； 下游弓l物Pn2的基因 序歹lj為5,誦TTGAGTCTCGCTCTTAGTCTCTTGAGCAGGTTGACG-3，；六、 以步驟四PCR擴增產(chǎn)物pMD18-T-c/n'5S為模板突變擴增待融合片段 B: PCR反應(yīng)體系為50pL，由5jxL lOxpyrobest buffer、 4fiL dNTP、 lpL濃度 為20pmol/L引物Pn3、 l|iL濃度為20^mol/L引物Pn4、 0.25高信度擴增酶尸少ra&WDNA polymerase、 lpL突變擴增模板和余量的ddH20組成；PCR反應(yīng) 條件為94。C變性30s、 57.2。C退火30s、 72。C延伸lmin，共25個循環(huán)；其中上 游 引 物 Pn3 的 基 因 序 列 為5，-GCTCAAG^04CTA^a4GCGJ04CTCAACAGCATC-3，； 下游引物Pn4的 基因序歹ij為5 ，-ACTCTCTCGGGGTTGATGTTGTTTCTCCAAAGCAGC-3 ，；七、 以步驟四PCR擴增產(chǎn)物pMD18-T-c/z/5S為模板突變擴增待融合片段 C: PCR反應(yīng)體系為50jiL，由5pL 10xpyrobest buffer、 4pL dNTP、 lpL濃度 為20pmol/L引物Pn5、 1jiL濃度為20pmol/L引物Pn6、 0.25pL高信度擴增酶 尸,o&WDNApolymerase、 l)iL突變擴增模板和余量的ddH20組成；PCR反應(yīng) 條件為94i:變性30s、 58.5。C退火30s、 72。C延伸lmin，共25個循環(huán)；其中上 游 引 物 Pn5 的 基 因 序 列 為 5，-GG^04AACAACATCAACCCCGAGJ04GTCAACC畫3，； 下游引物Pn6的 基因序歹U為5'-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3，；八、 用瓊脂糖凝膠電泳純化回收突變擴增待融合片段A、 B和C，然后進 行融合PCR:由5|止10xpyrobest buffer、 4pL dNTP、 (X25(iL高信度擴增酶 尸,o6e^DNApolymerase、 lpL濃度為10ng/pL的突變擴增待融合片段A、 lpL 濃度為10ng/|iL的突變擴增待融合片段B、 lpL濃度為10ng/^iL的突變擴增待 融合片段C和余量的ddH20組成的體積為50pL的融合PCR反應(yīng)體系先進行 94'C變性30s、 6(TC退火2min、 72"C延伸3min， 8個循環(huán)；然后加入l^L濃 度為20(imol/L引物Pnl和l(iL濃度為20nmol/L引物Pn6，再進行94。C變性 30s、 6(TC退火30s、 72。C延伸5min， 20個循環(huán)；純化、回收，即得到角毛殼 菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基 因的制備方法，其特征在于步驟二按以下步驟實施a、 將5pL角毛殼菌總RNA、 8|iL RNase-free H20和2|iL引物01igod18T 混勻后置于7(TC的環(huán)境中5min，然后放于冰上；b、 將5|jL 5xMLV Buffer、 1.25&L dNTPmix、 0.6fxL鐵調(diào)節(jié)蛋白、lpL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和2.5pL ddH20混合；c、 將a步驟和b步驟得到反應(yīng)體系混合，再置于42'C環(huán)境中反轉(zhuǎn)錄lh;d、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA PCR擴增PCR反應(yīng)體系為25pL，由2|iiL 10mM dNTP、 2jiL 25mM MgCl2、 5U ￡x Taq DNA聚合酶、10pM上游引物Pnl 、 10pM 下游引物Pn6、 2pL步驟c反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和余量的ddH20組成，PCR反應(yīng)條件為 94°C預(yù)變性5min， 94。C變性20s、 57。C退火30s、 72。C延伸30s、 35個循環(huán)， 72。C延伸10min;其中步驟 d 中上游引物 Pnl 的基因序列為 5'-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3，； 下游引物Pn6的基因 序歹U為5,-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3,。
4、用于制備角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因的引物，其 特征在于引物的基因序列為Pn 1: 5 ，-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3'， Pn2: 5 ，-TTGAGTCTCGCTCTTAGTCTCTTGAGCAGGTTGACG畫3'， Pn3: 5，國GCTCAAGJG^CTA^04GCGJ04CTCAACAGCATC-3，， Pn4: 5 ，-ACTCTCTCGGGGTTGATGTTGTTTCTCCAAAGCAGC-3 ，， Pn5: 5，-GGJ04AACAACATCAACCCCGAG^04GTCAACC-3 ，， Pn6: 5 ,-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3'。
全文摘要
角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因及其制備方法和所用引物，它涉及一種幾丁質(zhì)酶基因密碼子偏愛性突變體基因及其制備方法和所用引物。本發(fā)明解決了chi58在巴斯德畢赤酵母中不能高效表達的問題。本發(fā)明密碼子偏愛性突變體基因序列如SEQ ID NO2所示。本發(fā)明引物Pn1～Pn6的基因序列分別如SEQ ID NO5、6、7、8、9和10所示。本發(fā)明通過融合PCR法獲得密碼子偏愛性突變體基因。本發(fā)明基因與真核表達載體pPIC9K連接構(gòu)建重組表達載體，再經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后表達的蛋白質(zhì)分子量為58kD，等電點pI為4.47，經(jīng)測序檢測氨基酸序列如SEQ ID NO3所示，證實為角毛殼菌幾丁質(zhì)酶，且?guī)锥≠|(zhì)酶的酶活性提高了約3倍。
文檔編號C12N15/11GK101348796SQ20081013711
公開日2009年1月21日 申請日期2008年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月12日
發(fā)明者謙 楊, 王艷君 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)