專利名稱：淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基 因及其克隆方法。
技術(shù)背景植物寄生線蟲是引起作物病害十分重要的病原物之一，對農(nóng)業(yè)造 成巨大的危害。目前主要采用殺線蟲劑防治植物寄生線蟲，但殺線蟲 劑通常毒性較高，污染環(huán)境。目前植物線蟲的生物防治越來越受到人 們的重視。目前已有包括線必克等商品化的線蟲生防制劑上市。真菌是植物線蟲生物防治中研究較多的天敵生物，也是最為重要的生防因子之一。淡紫擬青霉(尸aecWoiZ77ces"7acjV7ZA )是其中最 為著名、也是最重要的線蟲生防真菌之一。研究表明淡紫擬青霉可以 寄生線蟲的卵，抑制卵的孵化。線蟲的卵殼主要包含三層最外層的 卵黃磷層、中間的幾丁質(zhì)層和最里面的脂質(zhì)層，它們共同形成保護(hù)卵 的屏障。淡紫擬青霉在接觸線蟲卵后，菌絲會形成附著胞，然后附著 胞會分泌一些細(xì)胞溶解酶。這些酶在真菌的侵染過程中起了很重要的 作用，其中最重要的是幾丁質(zhì)酶和絲氨酸蛋白酶。研究認(rèn)為幾丁質(zhì)酶 可以降解卵的中間層一幾丁質(zhì)層，幾丁質(zhì)是N-乙酰1- P -D葡萄糖胺 以6-1， 4糖苷鍵連接起來的直鏈多聚物，其中幾丁質(zhì)酶中的內(nèi)切幾 丁質(zhì)酶可以隨機(jī)切斷幾丁質(zhì)鏈，生成殼二糖及少量殼三糖，外切幾丁 質(zhì)酶可以切斷殼二糖和N-乙酰1-P-D葡萄糖胺。Khan等(2004)用純化的幾丁質(zhì)酶處理爪哇根結(jié)線蟲的卵，通過透射電鏡的觀察，發(fā)現(xiàn) 用幾丁質(zhì)酶處理的線蟲卵殼的幾丁質(zhì)層產(chǎn)生大量的液泡并且卵黃磷層開裂；而用幾丁質(zhì)酶和絲氨酸蛋白酶共同處理卵時(shí)，卵結(jié)構(gòu)被損壞 的程度更明顯，脂質(zhì)層被破壞、幾丁質(zhì)層被水解、卵黃磷層則喪失了 完整性。因此，從淡紫擬青霉中獲取幾丁質(zhì)酶基因，利用生物基因工程技 術(shù)對現(xiàn)有的生防菌株基因組DNA進(jìn)行改造，增加幾丁質(zhì)酶基因的拷貝 數(shù)和表達(dá)水平，對提高生防菌的防效具有十分重要的意義。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的空白，提供線蟲生防菌淡 紫擬青霉一個(gè)新的幾丁質(zhì)酶基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述基因的克隆方法。 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來予以實(shí)現(xiàn)提供一種線蟲生防菌淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因，基因序列表如SEQ ID NO:2。本發(fā)明同時(shí)提供了所述淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因的克隆方法，包 括以下步驟(1) 利用幾丁質(zhì)誘導(dǎo)淡紫擬青霉的幾丁質(zhì)酶活性，收集酶活最 高的真菌菌絲和孢子，采用Trizol試劑法提取總RNA，并利用 GeneRacer kit和BD SMART RACE cDNA Amplication Kit反轉(zhuǎn)錄 成一鏈cDNA分別作為3' RACE和5' RACE的模板；(2) 選擇GenBank上昆蟲及真菌生防菌的幾丁質(zhì)酶基因序列，利用ClustalX軟件進(jìn)行同源性分析，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)一對簡并引 物擴(kuò)增獲得淡紫擬青霉的幾丁質(zhì)酶基因片段680bp;(3) 根據(jù)幾丁質(zhì)酶基因片段設(shè)計(jì)特異引物，運(yùn)用SMART RACE RT-PCR技術(shù)從淡紫擬青霉cDNA—鏈中獲得基因5'端和3'端序列， 將三段序列進(jìn)行拼接得到淡紫擬青霉cDNA全長序列；(4) 根據(jù)淡紫擬青霉cDNA全長序列設(shè)計(jì)一對覆蓋ORF的特異引 物，以淡紫擬青霉DNA為模板，擴(kuò)增獲得淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因的 基因組編碼區(qū)序列1436bp，編碼區(qū)包含3個(gè)內(nèi)含子，序列表如SEQ ID N0:1。步驟(1)所述幾丁質(zhì)誘導(dǎo)淡紫擬青霉的幾丁質(zhì)酶活性優(yōu)選菌株 第7天的淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶。步驟(2)所述GenBank上昆蟲及真菌生防菌的索引號為X64104、 AY147010、 AY1470U、 S78423、 AY758401、 AY758398、 AJ243014、 AY705926、 AY705927、 AF18892K U49455和AY292527。步驟(2)所述簡并引物為上游引物Chi2a: 5' -TTGGMHGAYGWYGGMAMYMYGC-3';下游引物Chi2d: 5' -CYYTRTARTCCCAKRYRCCRTHYTC-3';簡并堿基代碼H=A/C/T， Y=C/T， W=A/T， M=A/C， R=A/G， K二G/T。步驟(3)包括以下步驟 (a)根據(jù)淡紫擬青霉的幾丁質(zhì)酶基因片段680bP，設(shè)計(jì)一條特 異上游引物Chitl與GeneRacer kit中接頭引物GeneRacer 3' Primer配對，進(jìn)行3' RACE末端擴(kuò)增，獲得包含3'非編碼區(qū)在內(nèi)的1025bp基因片段，可與上述680bp片段連接；(b)根據(jù)上述3'端基因片段，設(shè)計(jì)特異下游引物Chitin3和 Chitinl分別與BD SMART RACE cDNA Amplication Kit中的UPM short 接頭引物和巢式錨定引物NUP配對，經(jīng)過兩輪擴(kuò)增獲得包含5'非編 碼區(qū)在內(nèi)的530bp基因片段，可與上述的3'端基因片段連接上；(c)利用SeqMan軟件將上述片段進(jìn)行拼接，得到cDNA全長片段 1465bp，命名為/^Ol 7，在NCBI的ORF finder進(jìn)行ORF識別，包 含一個(gè)1281bp的完整0RF，編碼427個(gè)氨基酸。 步驟(a)所述特異上游引物為Chitl: 5' -GTGACGATTATGMGGACTGGGGAT-3'。 步驟(b)所述特異下游引物為Chitin3: 5' -TTTGTCCGATGATGCTTCCCAGA-3'; Chitinl: 5' -TCCCCAGTCCTTCATAATCGTCAC-3'。 步驟(4)所述特異引物為上游引物Zkf: 5' -GCAGCATGAGGCGATATTTGGTG-3';下游引物Zkr: 5' -TTGACGGAGTATGTAAGGCGACG-3'。 所述淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因的克隆方法還包括利用DNASt ar軟 件對淡紫擬青霉的幾丁質(zhì)酶基因凡C全序列進(jìn)行核苷酸序列分析，對 該基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，確認(rèn)淡紫擬青霉的幾丁質(zhì) 酶基因。本申請人從象耳豆根結(jié)線蟲(ifeJoiob^j/3e e/7ter^o/u7)卵囊 上分離到一淡紫擬青霉新菌株，并進(jìn)行了該菌株對象耳豆根結(jié)線蟲的抑制作用研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株對象耳豆根結(jié)線蟲卵孵化的抑制率達(dá)到55.6%，盆栽生測效果達(dá)到55.5%。本發(fā)明利用幾丁質(zhì)誘導(dǎo)淡紫擬 青霉的幾丁質(zhì)酶活性，并以酶活力最高的淡紫擬青霉RNA為模板；根 據(jù)GenBank上一些昆蟲和真菌的生防菌幾丁質(zhì)酶基因序列，設(shè)計(jì)一對 簡并引物擴(kuò)增獲得淡紫擬青霉的幾丁質(zhì)酶基因片段；再運(yùn)用SMART RACE RT-PCR技術(shù)從淡紫擬青霉cDNA—鏈中獲得基因5'端和3'端 序列，將三段序列進(jìn)行拼接得到淡紫擬青霉一個(gè)新的幾丁質(zhì)酶基因 (凡0^'"的cDNA全長序列，該序列共1281bp，編碼427個(gè)氨基 酸殘基，序列表如SEQ IDN0:2;對該氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該 序列包含著第18家族幾丁質(zhì)酶基因的兩個(gè)高度保守區(qū)，即幾丁質(zhì)結(jié) 合域S-X-G-G和負(fù)責(zé)幾丁質(zhì)水解的催化域D-X-D-X-E，說明凡6M7 為第18家族幾丁質(zhì)酶基因；該序列同萊氏野村菌(iVcM"i^ear^e^) 的幾丁質(zhì)酶基因具最近的親源關(guān)系，同綠僵菌(J/e^r力j'w'順 朋^o/ 乃'se)和黃綠綠僵菌(#. j7araw>jVe)的幾丁質(zhì)酶基因也有 較近的親源關(guān)系，這3種真菌是重要的昆蟲寄生真菌，它們的內(nèi)切幾 丁質(zhì)酶通?？梢韵饫ハx體壁的幾丁質(zhì)層而讓菌絲侵入寄主，預(yù)示該 基因可能與它們的功能類似，是消解根結(jié)線蟲卵殼幾丁質(zhì)層的主要因 子之一。根據(jù)該cDNA全長序列設(shè)計(jì)一對覆蓋ORF的特異引物，以淡 紫擬青霉DNA為模板，擴(kuò)增獲得該基因的基因組編碼區(qū)序列1436bp， 編碼區(qū)包含3個(gè)內(nèi)含子，序列表如SEQ ID N0:1。 本發(fā)明的有益效果是經(jīng)文獻(xiàn)檢索，化Ch7是從淡紫擬青霉上分離到的一個(gè)新的幾丁質(zhì)酶基因，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明內(nèi)容相同文獻(xiàn)的公開報(bào)道。本發(fā)明通過對一株對根結(jié)線蟲有明顯防效，且?guī)锥≠|(zhì)酶活性可以被幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的淡紫擬青霉的研究，可以為利用生物工程技術(shù)將淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化其它的線蟲生防真菌，實(shí)現(xiàn)該基因的異源表達(dá)，提高線蟲生防真菌幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量和對植物寄生線蟲的生防能力提供重要的技術(shù)基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。 實(shí)施例11. 線蟲寄生真菌的分離采用卵囊與雌蟲培養(yǎng)分離法，先配制馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養(yǎng)基PDA。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊膠20 g，水IOOO mL，每IOOO mL PDA培養(yǎng)基中加入O. 2 g的氯霉素抑制細(xì)菌生長；然后選取有根結(jié)的病 根，用清水清洗掉病根上的土壤，挑取病根根結(jié)外的卵囊和根結(jié)內(nèi)的 雌蟲，每個(gè)樣挑選25個(gè)卵囊和15個(gè)雌蟲；用5y。NaCl消毒卵囊和雌蟲3 min;將卵囊和雌蟲迅速轉(zhuǎn)到滅菌水中漂洗，共漂、冼3次；最后將卵囊 和雌蟲移入PDA中，25t:培養(yǎng)；每皿接3個(gè)卵囊或雌蟲；待卵囊和雌蟲 周圍長出菌落后，挑取邊緣菌絲，純化，在PDA上培養(yǎng)，保存。2. 真菌的鑒定在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上結(jié)合分子生物學(xué)的手段，主 要是rDNA-ITS-PCR測序，進(jìn)行鑒定。實(shí)施例2淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因的克隆(1)利用幾丁質(zhì)誘導(dǎo)淡紫擬青霉的幾丁質(zhì)酶活性，收集酶活性最高的真菌菌絲和孢子，采用Trizol試劑法提取總RNA，并利用 GeneRacer kit和BD SMART RACE cDNA Amplication Kit反轉(zhuǎn)錄 成一鏈cDNA分別作為3' RACE和5' RACE的模板；1、 淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶活性的研究利用幾丁質(zhì)誘導(dǎo)淡紫擬青霉的幾丁質(zhì)酶活性，以未加幾丁質(zhì)誘導(dǎo) 的淡紫擬青霉為對照，采用DNS法測定有幾丁質(zhì)誘導(dǎo)和無幾丁質(zhì)誘導(dǎo) 的淡紫擬青霉分別在培養(yǎng)3d、 7d、 10d和15d的幾丁質(zhì)酶活性。結(jié)果表明加幾丁質(zhì)誘導(dǎo)第7d的淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶活最高，收集 酶活最高的真菌菌絲和孢子，采用Trizol試劑法提取總RNA，并利用 GeneRacerTM kit和BD SMART RACE cDNA Amplication Kit反轉(zhuǎn)錄成 一鏈cDNA分別作為3' RACE和5' RACE的模板。2、 淡紫擬青霉RNA的提取收集加幾丁質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)第7d的酶活最高的真菌菌絲和孢子，采 用Trizol試劑法提取總RNA，參照Invitrogen公司的TRIzol Reagent (Cat. No. 15596-018)說明書進(jìn)4亍操作。3、 cDNA—鏈的合成用GeneRacer kit和BD SMART RACE cDNA Amplication Kit 反轉(zhuǎn)錄成一鏈cDNA分別作為3' RACE和5' RACE的模板，按試劑盒 說明書操作。(2)選擇GenBank上昆蟲及真菌生防菌的幾丁質(zhì)酶基因序列， 利用ClustalX軟件進(jìn)行同源性分析，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)一對簡并引 物擴(kuò)增獲得淡紫擬青霉的幾丁質(zhì)酶基因片段680bp;根據(jù)GenBank上索引號為X64104、 AY147010、 AY1470U、 S7842S、 AY758401、 AY758398、 AJ"243014、 AY705926、 AY705927、 AF18892K 1)49455、 AY292527的不同真菌設(shè)計(jì)一對簡并引物擴(kuò)增獲得淡紫擬青霉的幾丁質(zhì)酶基因片段，簡并引物為上游引物Chi2a: 5' -TTGGAAHGAYGWYGGMAMYAAYGC-3' 下游引物Chi2d: 5' -CYYTRTARTCCCAKRYRCCRTHYTC-3' 簡并堿基代碼H二A/C/T, Y二C/T， W二A/T， M二A/C， R二A/G， K二G/T。PCR擴(kuò)增體系為(共25W):上游引物Chi2a (10 Mmol/L) 下游引物Chi2d (10 Mmol/L)10XBufferEx Taq (5 ,) dNTP (各2. 5 ,1/L) 滅菌ddH20 cDNA模板 PCR反應(yīng)程序 94°C94°C55 °C72°C72 °C4°C2 min 30 sec 30 sec 2 min 7 minGO0.5 Pi 0.5 )4 2,5 14 0. 125 Ml218.875 0.5 1435 Cycle(3)根據(jù)幾丁質(zhì)酶基因片段設(shè)計(jì)特異引物，運(yùn)用SMART RACERT-PCR技術(shù)從淡紫擬青霉cDNA—鏈中獲得基因5'端和3，端序列， 將三段序列進(jìn)行拼接得到淡紫擬青霉cDNA全長序列； 分為三步進(jìn)行(a) 根據(jù)淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因片段680bp，設(shè)計(jì)一條特異 上游引物Chitl與GeneRacer kit中的接頭引物GeneRacer 3' Primer配對，進(jìn)行3' RACE末端擴(kuò)增，獲得包含3'非編碼區(qū)在內(nèi)的 1025bp基因片段，可與上述680bp片段連接；(b) 根據(jù)上述3'端基因片段，設(shè)計(jì)特異下游引物Chitin3和 Chitinl分別與BD SMART RACE cDNA Amplication Kit中的UPM short 接頭引物和巢式錨定引物NUP配對，經(jīng)過兩輪擴(kuò)增獲得包含5'非編 碼區(qū)在內(nèi)的530bp基因片段，可與上述的3'端基因片段連接上；(c) 利用SeqMan軟件將上述片段進(jìn)行拼接，得到cDNA全長片段。U) 3' RACE根據(jù)淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因片段680bp,設(shè)計(jì)一條特異上游引 物Chitl與GeneRacer kit中的接頭引物GeneRacer 3' Primer 配對，進(jìn)行3' RACE末端擴(kuò)增。特異上游引物為 Chitl: 5' -GTGACGATTATGAAGGACTGGGGAT-3' PCR擴(kuò)增體系為(共25W):10 X Buffer for Blend Taq 2.5 MlBlend Taq (2.5 U/W) 0.25 W上游引物Chitl(lO Mmol/L) 1 W下游引物GeneRacer， 3' Primer (10 Wnol/L)1.5 MddNTP (各IO腸1/L)滅菌(1朋20cDNA模板PCR反應(yīng)程序94 °C2 min94 °C30 sec72 °C1 min94 °C30 sec70°C1 min94 °C30 sec65 °C30 sec72 °C1.5 min72 °C10 min4°C00(b) 5' RACE0,5 W 18.75 W 0.5 WCycleCycle25 Cycle根據(jù)上述3'端基因片段，設(shè)計(jì)一條特異下游引物Chitin3與BD SMART RACE cDNA Amplication Kit中的UPM short接頭引物配對，同 時(shí)設(shè)計(jì)一條特異下游引物Chitinl與BD SMART RACE cDNA Amplication Kit中的巢式錨定引物NUP配對，通過兩輪PCR進(jìn)行5' RACE末端擴(kuò)增。 特異下游引物為Chitin3: 5' -TTTGTCCGATGATGCTTCCCAGA-3'Chitinl: 5' —TCCCCAGTCCTTCATAATCGTCAC-3'第一輪PCR擴(kuò)增體系為(共25W):10XBufferEx Taq (5 UM)上游引物UPM下游引物Chitin3 (10 Pmol/L) dNTP (各2. 5畫1/L) 滅菌ddH20 cDNA模板 第一輪PCR反應(yīng)程序94 °C94 °C62 °C72 °C72 °C4。C1 min30 sec ~i30 secmm10 min00第二輪PCR擴(kuò)增體系為(共25W): 10X Buffer Ex Taq (5 UM) 上游引物NUP(IO Mmol/L) 下游引物Chitinl(各lO Mmol/L) dNTP (各2. 5畫1/L) 滅菌ddH202.5 Ml 0. 125 Pi 2.5 Ml12 Ml15.875 Pi 1 Ml35 Cycle2. 5 W 0. 125 W 2. 5 Pi1 Ml2 W15.875 14第一輪PCR產(chǎn)物第二輪PCR反應(yīng)程序:Ml94 。C3min94°C30 sec58°C30 sec72 °C2 min72 °C10 min4°Coo35 Cycle(c)序列分析利用SeqMan軟件、DNAStar和ClustalX軟件進(jìn)行序列拼接和分析。序列分析的結(jié)果通過國際互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)行序列同源性檢索，檢索主程序采 用BLASTN和BLASTX，即核酸序列對核酸序列數(shù)據(jù)庫的檢索和氨基酸序 列對氨基酸序列的檢索，序列分析在NCBI進(jìn)行。(4)根據(jù)淡紫擬青霉cDNA全長序列設(shè)計(jì)一對覆蓋ORF的特異引 物，以淡紫擬青霉DNA為模板，擴(kuò)增獲得淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因的 基因組編碼區(qū)序列1436bp，編碼區(qū)包含3個(gè)內(nèi)含子。根據(jù)cDNA全長序列設(shè)計(jì)一對覆蓋ORF的特異引物，以淡紫擬青 霉DNA為模板進(jìn)行該基因基因組編碼區(qū)的擴(kuò)增。特異引物為 上游引物Zkf: 5' -GCAGCATGAGGCGATATTTGGTG-3' 下游引物Zkr: 5' -TTGACGGAGTATGTMGGCGACG-3' PCR擴(kuò)增體系為(共25Pl):10X Buffer 2. 5 PiEx Taq (5 UM) 上游引物Zkf (10 |Jmol/L) 下游引物Zkr (10 Pmol/L) dNTP (各2. 5畫1/L) 滅菌(1朋20 DNA模板 PCR反應(yīng)程序94 °C 94 °C 58 °C 72 °C 72 °C 4°C3min30 sec 30 sec 2 min 10 min0. 125 Pi 1 141 W2 W 17.875 Ml 0. 5 Pi35 CycleSEQUENCE LISTING<110〉華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因及其克隆方法〈130><160〉 3<170〉 Patentln version 3.2〈210〉 1〈211> 1436<212> DNA<213> 人工序列<220〉<221〉 exon <222〉 (1)..(149)<220><221〉 Intron <222> (150).. (197)<220〉<221〉 6xon<222〉 (198).. (296)<220><221〉 Intron <222> (297) . (348)<220〉<221〉 sxon<222> (349).. (398)<220><221> Intron 〈222〉 (399).. (453)<220〉<221〉 exon<222〉 (454).. (1436)〈400〉 1t.ta etc cag 48 Leu Leu Gin 15gtg aaa tst 96 Val Lys Tyr 30tat ttt gtc 144 Tyr Phe Valgtaattag g 1983tg agg cga tat ttg gtg cgc tgt gtt 3ct get ctg ggg Met Arg Arg Tyr Leu Val Arg Cys Val Thr Ala Leu Gly 1 5 ■ 10get gcg tec att gca tec ggc act get tea ccg gga gat Ala Ala Ser lie Ala Ser Gly Thr Ala Ser Pro Gly Asp 20 25ata cgc tea aag tgg 3cc age ggc tea get aat ggc gtc lie Arg Ser Lys Trp Thr Ser Gly Ser Ala Asn Gly Val 35 40 45aac tg gtatgcgcag aacggtacag ccattggcaa gttggctaac Asn Trpggtat at3Ccgaaatncccagcagacetccctgtccga gacGlylieTyrGlyArgAsnPheGinProAlaAspLeuProValArg Asp556065ateagtg"Uttctacgettttetc犯cgtccgtactgacggg acclieSerHisValPheTyrAlaPheLeuValArgThrAspGly Thr707580246294at gtaagcttca 3aaagatgac gatg3gacct cgaccaacta atggttgcct ag c lie349ttc tec ggc gac agt tac gcc gat gtt gag aag cac tat tec aac gat398Phe Ser Gly Asp Ser Tyr Ala Asp Val Glu Lys 85 90gtatgccatt gcacacgcat tcccgtacgc acacacttgcHis Tyr Ser Asn Asp 95actgaccaac catag cc 455 Sertgg aat gac gtc ggc aac aat gcc tac ggg tgt gtt aaa caa atg tat 503 Trp Asn Asp Val Gly Asn Asn Ala Tyr Gly Cys Val Lys Gin Met Tyr105 110 115ttg eta aag aaa gcc aac cga aac etc aag att atg ctt tea att ggg 551Leu Leu Lys Lys Ala Asn Arg Asn Leu Lys lie Met Leu Ser lie Gly120 125 130ggt tgg acg tgg teg acc aac ttc cca acc get get ggt tct gac gcc 599 Gly Trp Thr Trp Ser Thr Asn Phe Pro Thr Ala Ala Gly Ser Asp Ala135 140 145aca cgc aag acg ttc gca aaa tct gca gtg acg att atg aag gac tgg 647"Thr Arg Lys Thr Phe Ala Lvs Ser Ala Val Thr lie Met Lys Asp Trp150lS5 160gga ttc gat ggc ate gat att gat tgg gag tat cca get gat ggt acg 695Gly Phe Asp Glv lie Asp lie Asp Trp Glu Tyr Pro Ala Asp Gly Thr170 175 180gaa gca gcc aac ttc gtg ctg ttg ttg caa gcg gtc cgc gac gaa ctt 743Glu Ala Ala Asn Phe Val Leu Leu Leu Oln Ala Val Arg Asp Glu Leu185 190 195gat. gcg tat gca gcc cag tac gcc aat gga cat cac ttc caa ctg tec 791Asp Ala Tyr Ala Ala Gin Tyr Ala Asn Gly His His Phe Gin Leu Ser200 205 210ate gcg gcg cca act ggg cca gat cac tac aag aag etc cac ctt gcg 839lie Ala Ala Pro Thr Gly Pro Asp His Tyr Lys Lys Leu His Leu Ala215 220 225gac atg ggc aag ctg gac tac gtc aac etc atg gcc tac gac ttc 887Asp Met Gly Lys Phe Leu Asp Tyr Val Asn Leu Met Ala Tvr Asp Phe230 235 240get ggc ggc tgg ggc aac tgt agt gga cat aac gcc aac ttg tat egg 935Ala Gly Gly Trp Gly Asn Cys Ser Gly His Asn Ala Asn Leu Tyr Arg245 250 255 260aat teg cag aat ccg aat gcc acg ccg ttc gat gcg gat teg gcc gta 983Asn Ser Gin Asn Pro Asn Ala Thr Pro Phe Asp Ala Asp Ser Ala Val265 270 275aag ttc tac atg aag gaa gga att cct gcg gag aag ctg gtt ctt ggc 1031Lys Phe Tyr Met Lys G丄u Gly lie Pro Ala Glu Lys Uu Val Leu G1y280 285 290atg cct ate tac ggc cgc teg ttc cag gga acc atg ggt att gga cag 1079Met Pro lie Tyr Gly Arg Ser Phe Gin Gly Thr Met Gly lie Gly Gin295 300 305ccc tac tct ggt gta gga age ggc tea agg gaa aac ggc ata tgg gac 1127Pro Tyr Ser Glv Val Gly Ser Gly Ser Arg Glu Asn Glv lie Trp Asp310 3丄5 320tac aaa gtt ttg cct aag gca ggg tec acc ctt atg tac gac gac ate 1175Tvr Lys Val Leu Pro Lys Ala Gly Ser Thr Leu Met Tyr Asp Asp lie325 330 335 340gcg aag gcc tat tat acc tac gac acg teg acg aaa gaa etc ate tec 1223Ala Lys Ala Tyr Tyr Thr Tyr Asp Thr Ser Thr Lys Glu Leu Tie Ser345 350 355tat gac ccc cct gac atg gtc aag agg aag gtt acg tac etc aag ggc 1271Tyr Asp Pro Pro Asp Met Val Lys Arg Lvs Val Thr Tvr Leu Lys ^lv360 365 ' '370 'etc gga ctt ggt ggc age atg ttc tgg gaa gca tea teg gac aag aag 1319Leu GlyI>eu 375GlyGlySerMetPhe 380TrpGluAlaSerSer 385AspLysggt get Gly Ala 390gat Asptct Seretc Leuatt lieGly 395ThrSerage Sertec Sertea Ser 400etc Leuggc Glyc犯 Gingta Val1367gat tct Asp Ser 405ThrGinAsntac Tyr 410etc LeuC3C Histat Tyrcca Proaac Asn 415tct SerGintac Tyrgac Aspaac 4201415att egg lie Arga幼 Lysggg Glyctg Leu 425cag Gintag1436〈210〉 2 <211〉 1281 〈212〉 腿 <213〉人工序列<220> <221〉 CDS <222> (l)..(1281)〈400〉 2 atg agg cga Met Arg Arg 1tat Tyrttg Leu 5gtg Valcgc Argtgt CysValact Thr 10get Alactg Leuggg GlyLeuetc Leu 15c解 Gin48get gcg Ala Alatec Seratt lie 20gca Alatec Serggc Glyact Thrget Ala 25tea Serccg Progga Glygat Aspgtg Val 30犯atat; Tyr96ata cgc lie Argtea Ser 35卿 Lystgg Trpacc Thrage Serggc Gly 40tea Sergct Alaaat Asnggc Glygtc Val 45tat Tyrttt Phegtc Val144肌c tgg Asn Trp 50ggt Glylietac TyrGlycga Arg 55aat Asnttc Phecag GinCC3 Progca Ala 60gac Aspetc Leucct Progtc Val192cga gac Arg iVsp 65lieagt Sercac Hisg"U Val 70ttc Phetac Tyrget Alattt Pheetc Leu 75犯c Asngtc Valcgt Argact Thrgac Asp 80240ggg acc Gly Thrate liettc Phetec Ser 85ggc Glygac Aspagt Sertac Tyrgcc Ala 90gat Aspgtt ValGlu犯g LysC3C His 95tat Tyr288tCC 33C Ser Asngat Asptec Ser 100tgg Trpaat Asng3C Aspgtx Valggc Gly 1053ac AsnAsngec Alatac Tyrggg Gly 110tgt CysgU Val336Lys GinMet 115tat TyrLeueta Leu犯g Lysa犯 匕ys 120gcc Ala犯c Asncga Argaac Asnetc Leu 125aag Lysatt lieMet384ctt tea Leu Ser 130att lieggg Glyggt Glytgg Trp3Cg Thr 135tgg Trpteg Ser3CC Thr犯c Asnttc Phe 140CC3 Pro3CC Thrget Alaget Ala432ggt tct Gly Ser 145gac Aspgcc AlaThrcgc Arg 150aag Lysacg Thrttc Phegca Alaaa.a Lys 155tct Sergca Alagtg Val￡lCg Thratt lie 160480atg aag Met Lysgac Asptgg Trpgga Gly 165ttc Phegat Aspggc Glyate liegat Asp 170att liegat Asptgg Trpg&g Glutat Tyr 175cca Pro528get gat Ala Aspggt Glyacg Thr 180gaa Glugca Alagcc Ala貼c Asnttc Phe 185gtg Valctg Leuttg Leuttg Leuc犯 Gin 190gcg Alagtc Val576cgc gacg33cttgcggC￡lgcccaggccggacat624Arg Asp Glu Leu Asp Ala Tyr Ala Ala Gin Tyr Ala Asn Gly His His 195 200 205ttc caa ctg tec ate gcg gcg cca act ggg cca gat cac tac aag aag Phe Gin Leu Ser lie Ala Ala Pro Thr Gly Pro Asp His Tyr Lys Lys 210 215 220672etc cac ctt gcg gac atg ggc aag ttt ctg gac tac gtc aac etc atg Leu His Leu Ala Asp Met Gly Lys Phe Leu Asp Tyr Val Asn Leu Met 225 230 235 ' 240720gcc tac geic ttc get ggc ggc tgg ggc aac tgt 3gt gga cat aac gcc Ma Tyr Asp Phe Ma Gly Gly Trp Gly Asn Cys Ser Gly His Asn Ala 245 250 255768aac ttg tat egg aat teg cag aat ccg aat gcc acg ccg ttc gat gcg Asn Leu Tyr Arg Asn Ser Gin Asn Pro Asn Ala Thr Pro Phe Asp Ala 260 265 270816gat teg gcc gta aag ttc tac atg aag gaa gga att cct gcg gag aag Asp Ser Ala Val Lys Phe Tyr Met Lys Glu Gly lie Pro Ala Glu Lys 275 280 285864ctg gtt ctt ggc atg cct at.c tac ggc cgc teg ttc cag gga acc atg Leu Val Leu Gly Met Pro lie Tyr Gly Arg Ser Phe Gin Gly Thr Met 290 295 300912ggt 3tt gg3 C3g ccc tac tct. ggt gta gga age ggc tea agg gaa aac Gly lie Gly Gin Pro Tyr Ser Gly Val Gly Ser Gly Ser Arg Glu Asn 305 310 315 320960ggc ata tgg gac tac aaa gtt ttg cct aag gca ggg tec acc ctt atg Giy lie Trp Asp Tyr Lvs Val Leu Pro Lvs Ala Gly Ser Thr Leu Met 3》5 350 3351008tac gac gac ate gcg aag gcc tat tat acc tac gac acg teg acg aaa Tyr Asp Asp lie Ala Lys Ala Tyr Tvr Thr Tyr Asp Thr Ser Thr Lys 340 3i5 3501056gaa etc ate tec tat gsc ccc cct gac atg gtc紛g agg aag gtt acg Glu Leu lie Ser Tyr Asp Pro Pro Asp Met々al Lvs Arg Lvs Val Thr 355 360 — 3651104tac etc aag ggc etc gga ctt ggt ggc age atg ttc tgg gaa gca tea Tyr Leu Lys Glv Leu Gly Leu Gly Glv Ser Met Phe Trp Glu Ala Ser 370 375 3801152teg gac aag aag ggt get gat tct etc att gga. acc age age tec tea Ser Asp Lys Lys Gly Ala Asp Ser Leu lie Gly Thr Ser Ser Ser Ser 385 390 395 4001200etc ggc caa gta gat tct aca caa aat tac etc cac tat cca aac tct Leu Gly Gin Val Asp Ser Thr Gin Asn Tyr Leu His Tyr Pro Asn Ser 405 410 4151248cag tac gac 33C att egg aaa ggg ctg cag tag Gin Tyr Asp Asn lie Arg Lys Gly Leu Gin 420 4251281<210> 3〈211> 426<212〉 PRT <213>人工序列<400> 3Met Arg Arg Tyr Leu Val Arg Cys Val Thr Ala Leu Glv Leu Leu Gin 15 10 15Ala Ala Ser lie Ala Ser Gly Thr Ala Ser Pro Gly Asp Val Lys Tyr 20 25 30lie Arg Ser Lys Trp Thr Ser Gly Ser Ala Asn Gly Val Tyr Phe Val354045Asn Trp Gly lie Tyr Gly Arg Asn Phe Gin Pro Ala Asp Leu Pro Val 50 55 60Arg Asp lie Ser His Val Phe Tyr Ala Phe Leu Asn Va! Arg Thr Asp 65 70 75 80G丄v Thr lie Phe Ser Gly Asp Ser Tyr Ala Asp Val Glu Lys His Tyr 85 恥 95Ser Asn Asp Ser Trp Asn Asp Val Gly Asn Asn Ala Tyr Gly Cys Val 100 105 110Lys G丄n Met Tyr Leu Leu Lys Lvs Ala Asn Arg Asn Leu Lvs lie Met 115 125Leu Ser lie Gly Gly Trp Thr Trp Ser Thr Asn Phe Pro Thr iUa Ala 130 135 140Gly Ser Asp Ala Thr Arg Lys Thr Phe Ala Lvs Ser Ala Val Thr lie 145 150 化5 160Met Lys Asp Trp Gly Phe Asp Gly lie Asp lie Asp Trp Glu Tyr Pro 165 170 175Ala Asp Gly Thr Glu Ala Ala Asn Phe Val Leu Leu Leu Gin Ala Val 180 185 190Arg Asp Glu Leu Asp Ala Tyr Ala Ala Gin Tyr Ala Asn Gly His His 195 200 205Phe Gin Leu Ser lie Ala Ala Pro Thr Gly Pro Asp His Tyr Lys Lvs 210 215 220Leu His Leu Ala Asp Met Gly Lys Phe Leu Asp Tyr Val Asn Leu Met 225 230 235 240Ala Tyr Asp Phe Ala Gly Gly Trp Gly Asn Cys Ser Gly His Asn Ala 245 250 255Asn Leu Tyr Arg Asn Ser Gin Asn Pro Asn Ala Thr Pto Phe Asp Ala 260 265 270Asp Ser Ala Val Lys Phe Tyr Met Lys Glu Gly lie Pro Ala Glu Lvs 275 280 285Leu Val Leu Glv Met Pro lie Tyr Gly Arg Ser Phe Gin Gly Thr Met 290 295 300Gly lie Gly Gin Pro Tyr Ser Gly Val Gly Ser G1y Ser Arg Glu Asn 305 310 315 320Glv lie Trp Asy Tyr Lys Val Leu Pro Lys Ala Gly Ser Thr Leu Met 3& 330 335Tyr Asp Asp lie Ala Lys Ala Tyr Tyr Thr Tyr Asp Thr Ser Thr Lys340345350Glu Leu lie Ser Tvt Asp Pro Pro Asp Met Val Lys Arg Lys Val Thr 355 . 360 365Tyr Leu Lys Gly Leu Glv Leu Gly. Gly Ser Met Phe Trp Glu Ala Ser 370 375 380Ser Asp Lys Lvs Gly Ma Asp Ser Leu lie Gly Thr Ser Ser Ser Ser 385 390 395 400Leu Gly Gin Val Asp Ser Thr Gin Asn Tyr 405 410His Tyr Pro Asn Ser 415Gin Tyr Asp Asn lie Arg Lys Gly Leu Gin 420 42權(quán)利要求
1、一種淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因，其特征在于所述幾丁質(zhì)酶基因的序列表如SEQ ID NO2。
2、 一種權(quán)利要求1所述淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因的克隆方法， 其特征在于包括以下步驟(1) 利用幾丁質(zhì)誘導(dǎo)淡紫擬青霉的幾丁質(zhì)酶活性，收集酶活性 最高的真菌菌絲和孢子，采用Trizol試劑法提取總RNA，并利用 GeneRacer kit和BD SMART RACE cDNA Amplication Kit反轉(zhuǎn)錄 成一鏈cDNA分別作為3' RACE禾卩5' RACE的模板；(2) 選擇GenBank上昆蟲及真菌生防菌的幾丁質(zhì)酶基因序列， 利用ClustalX軟件進(jìn)行同源性分析，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)一對簡并引 物擴(kuò)增獲得淡紫擬青霉的幾丁質(zhì)酶基因片段680bp;(3) 根據(jù)幾丁質(zhì)酶基因片段設(shè)計(jì)特異引物，運(yùn)用SMART RACE RT-PCR技術(shù)從淡紫擬青霉cDNA—鏈中獲得基因5'端和3'端序列， 將三段序列進(jìn)行拼接得到淡紫擬青霉cDNA全長序列；(4) 根據(jù)淡紫擬青霉cDNA全長序列設(shè)計(jì)一對覆蓋0RF的特異引 物，以淡紫擬青霉DNA為模板，擴(kuò)增獲得淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因的 基因組編碼區(qū)序列1436bp，編碼區(qū)包含3個(gè)內(nèi)含子，序列表如SEQ ID NO:l。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因的克隆方法， 其特征在于步驟(1)所述幾丁質(zhì)誘導(dǎo)淡紫擬青霉優(yōu)選菌株誘導(dǎo)第7 天的淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因的克隆方法， 其特征在于步驟(2)所述GenBank上昆蟲及真菌生防菌的索引號為 X64104、AY147010、AY147011、S78423、AY758401、AY758398、AJ243014、 AY705926、 AY705927、 AF188921、 U49455和AY292527。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因的克隆方法， 其特征在于步驟(2)所述簡并引物為上游引物Chi2a: 5' -TTGGMHGAYGWYGGMAMYAAYGC-3'; 下游引物Chi2d: 5' -CYYTRTARTCCCAKRYRCCRTHYTC-3'; 簡并堿基代碼H=A/C/T， Y=C/T， W=A/T， M=A/C， R=A/G， K二G/T。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因的克隆方法， 其特征在于步驟(3)包括以下步驟(a) 根據(jù)淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因片段680bp，設(shè)計(jì)一條特異 上游引物Chitl與GeneRacer kit中的接頭引物GeneRacer 3' Primer配對，進(jìn)行3' RACE末端擴(kuò)增，獲得包含3'非編碼區(qū)在內(nèi)的 1025bp基因片段，可與上述680bp片段連接；(b) 根據(jù)上述3'端基因片段，設(shè)計(jì)特異下游引物Chitin3和 Chitinl分別與BD SMART RACE cDNA Amplication Kit中的UPM short 接頭引物和巢式錨定引物NUP配對，經(jīng)過兩輪擴(kuò)增獲得包含5'非編 碼區(qū)在內(nèi)的530bp基因片段，可與上述的3'端基因片段連接上；(c) 利用SeqMan軟件將上述片段進(jìn)行拼接，得到cDNA全長片段。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因的克隆方法，其特征在于步驟(a)所述特異上游引物為Chitl: 5' -GTGACGATTATGAAGGACTGGGGAT-3'。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因的克隆方法， 其特征在于步驟(b)所述特異下游引物為Chitin3: 5' -TTTGTCCGATGATGCTTCCCAGA—3'; Chitinl: 5' -TCCCCAGTCCTTCATMTCGTCAC-3'。
9、 根據(jù)權(quán)利要求2所述淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因的克隆方法，其 特征在于步驟(4)所述特異引物為上游引物Zkf: 5' -GCAGCATGAGGCGATATTTGGTG-3'; 下游引物Zkr: 5' -TTGACGGAGTA丁GTMGGCGACG-3'。
10、 根據(jù)權(quán)利要求2所述淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因的克隆方法， 其特征在于還包括利用DNAStar軟件對淡紫擬青霉的幾丁質(zhì)酶基因 尸ZC全序列進(jìn)行核苷酸序列分析，對該基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同 源性分析，確認(rèn)淡紫擬青霉的幾丁質(zhì)酶基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種線蟲生防菌淡紫擬青霉新的幾丁質(zhì)酶基因，基因的序列表如SEQ ID NO1，同時(shí)公開了所述淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因的克隆方法。本發(fā)明以酶活性最高的淡紫擬青霉RNA為模板，設(shè)計(jì)一對簡并引物擴(kuò)增獲得淡紫擬青霉的幾丁質(zhì)酶基因片段；再運(yùn)用SMART RACE RT-PCR技術(shù)從淡紫擬青霉cDNA一鏈中獲得基因5’端和3’端序列，將三段序列進(jìn)行拼接得到淡紫擬青霉一個(gè)新的幾丁質(zhì)酶基因(PLChil)的cDNA全長序列。本發(fā)明為利用生物工程技術(shù)將淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化其它的線蟲生防真菌，實(shí)現(xiàn)該基因的異源表達(dá)，提高線蟲生防真菌幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量和對植物寄生線蟲的生防能力提供重要的技術(shù)基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/10GK101265476SQ20081002662
公開日2008年9月17日 申請日期2008年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月5日
發(fā)明者侃 卓, 廖金鈴 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)