專(zhuān)利名稱(chēng)：：具有改善并穩(wěn)定化的活性的固定化界面酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及固定化界面酶，特別是涉及具有改善的活性和穩(wěn)定性的脂肪酶和磷脂酶以及其它水解酶。本發(fā)明還涉及制備這類(lèi)酶的方法，以及它們的各種工業(yè)應(yīng)用和研究性應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：界面酶是一類(lèi)在它們的蛋白結(jié)構(gòu)中由兩個(gè)域組成的酶；第一個(gè)域是親水域，而第二個(gè)域是疏水域。這個(gè)獨(dú)特的特性使得這一酶類(lèi)一旦存在于兩相體系中時(shí)就會(huì)偏好界面區(qū)域。在這種情況下，形成了活性構(gòu)象，其中酶分子的親水域朝向水層而疏水域朝向疏水層。脂肪酶和磷脂酶是最常見(jiàn)的界面酶，其一旦存在于界面體系中就表達(dá)其催化活性。脂肪酶(甘油三酯水解酶E.C.3丄1.3)被定義為作用于水性體系中的甘油三酯的酯鍵以產(chǎn)生游離脂肪酸、偏甘油酯和甘油的水解酶。磷脂酶也屬于水解酶類(lèi)，然而它們有利地且特異性地切斷存在于水性體系中的磷脂的酯鍵，從而根據(jù)磷脂酶的類(lèi)型而產(chǎn)生游離脂肪酸、溶血磷脂、甘油磷酯、磷脂酸和游離醇。脂肪酶和磷脂酶廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物中。過(guò)去二十年間對(duì)脂肪酶和磷脂酶的工業(yè)應(yīng)用的興趣快速增長(zhǎng)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在低的水活性下這類(lèi)酶催化它們的逆水解反應(yīng)。脂肪酶和磷脂酶的逆催化活性已經(jīng)被廣泛用于含酯鍵和酰胺鍵的有價(jià)值的化合物或含有如羥基、羧基和氨基等官能團(tuán)的其它相關(guān)化學(xué)物質(zhì)的合成。具體而言，脂肪酶和磷脂酶已經(jīng)被用于重整脂肪、油、蠟、磷脂和鞘脂以獲得新的期望的功能性質(zhì)，還用于將光學(xué)活性的化合物從它們的外消旋混合物中分離。特別有意義的是，本文將公開(kāi)界面酶在獨(dú)特的蠟酯和短鏈烷基酯(生物柴油)的合成中的應(yīng)用。目前，超過(guò)40種的不同脂肪酶和磷脂酶可商購(gòu)獲得，然而其中僅有少數(shù)是以商業(yè)化量制備的。一些最有工業(yè)前景的界面酶源自南極假絲酵母(Qjf"^i"""tor"/c")、鈹褶假絲酵母(Ow^^zragos")、米黑根毛霉(i/zJzo附wcor假單胞菌(/^ewdowo"as雪白豐艮毒(^//zo/7Ws"/ww力、爪哇毛霉(Mwcorj'av畫(huà)'cws)、米根霉(朋izo/mso，ae)、黑曲霉(Js/ergi〃^"/ger)、卡門(mén)柏青霉(戶(hù)e"/c/〃/wwccr附ew6eW")、產(chǎn)堿桿菌平)、伯克霍爾德氏菌(BwA:/zoWeWa乎)、疏綿狀嗜熱絲孢菌(77ze/-wom_yc&s/朋喂'wosa)、茅占桐色桿菌(C7zrawo^2cfen'訓(xùn)Wscosw附)、木瓜籽和胰酶。酶的固定化已經(jīng)被大量技術(shù)所說(shuō)明，這些技術(shù)基本上針對(duì)降低在整個(gè)方法中酶所占的成本、幫助從產(chǎn)物中回收酶和使得方法能夠連續(xù)運(yùn)行。固定化技術(shù)通常根據(jù)如下條件劃分1.酶在如二氧化硅和不溶性聚合物等固體載體上的物理吸附。2.酶在離子交換樹(shù)脂上的吸附。3.酶與如環(huán)氧化無(wú)機(jī)載體或環(huán)氧化聚合物載體等固體載體材料的共價(jià)結(jié)合。4.酶在增長(zhǎng)中的聚合物內(nèi)的包埋。5.酶在膜反應(yīng)器或半滲透性凝膠中的封閉。6.交聯(lián)酶晶體(CLECS，s)或交聯(lián)酶聚集體(CLEAS，s)。所有上述的酶固定化程序都由下列步驟組成1.將酶溶解在對(duì)于pH、溫度、緩沖鹽類(lèi)型和離子強(qiáng)度而言適當(dāng)?shù)木彌_體系中。2.將固體載體加入到酶溶液中并混合一段時(shí)間，直至酶分子被固定在固體載體上。3.過(guò)濾出含有固定化酶的固體載體。4.以適當(dāng)緩沖液洗滌所述載體以除去松散結(jié)合的酶分子，然后干燥所述固體載體。界面酶，主要是脂肪酶，已經(jīng)按照上述技術(shù)而被固定化。這些技術(shù)提供了擁有較低的合成活性和/或較短的工作半衰期的固定化酶制品。為了試圖增加固定化的脂肪酶和其它界面酶的合成活性，已應(yīng)用了各種激活方法。這些方法包括1.將酶的表面官能團(tuán)與如脂肪酸或聚乙二醇等疏水殘基結(jié)合。2.用如多元醇脂肪酸酯等表面活性劑涂覆酶表面。3.將酶與疏水載體接觸，所述疏水載體通常為聚丙烯并且已經(jīng)用如乙醇或異丙醇等親水溶劑預(yù)處理過(guò)。4.在反應(yīng)體系中加入低濃度(通常低于1%)的如鹽溶液、甘油等酶激活劑。對(duì)于用于以工業(yè)量進(jìn)行酶促逆轉(zhuǎn)化的固定化界面酶的激活、穩(wěn)定化和成本效益而言，上述方法都沒(méi)有產(chǎn)生滿(mǎn)意的結(jié)果。此外，據(jù)報(bào)道在按照上述程序固定化時(shí)，由于受所述固定化程序強(qiáng)加的某些約束，大多數(shù)酶要么喪失了它們的極大部分合成活性，要么無(wú)法展現(xiàn)出它們完全的活性性能。例如，以多元醇脂肪酸酯涂覆脂肪酶和磷脂酶遭遇到了嚴(yán)重挑戰(zhàn)，此時(shí)脂肪酶分子不是完全涂覆有激活劑；因此沒(méi)有與激活劑接觸的那些酶分子仍然沒(méi)有活性。因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供一種獲得高度活性并穩(wěn)定的用于合成應(yīng)用的固定化界面酶、特別是脂肪酶和磷脂酶的新方法。特別有意義的是，這些酶可以用于蠟酯和生物柴油的合成。本發(fā)明的另外一個(gè)目標(biāo)是提供用于各種工業(yè)過(guò)程以及研究性過(guò)程中的高度活性的、穩(wěn)定的固定化界面酶。隨著說(shuō)明的展開(kāi)，本發(fā)明的這些目標(biāo)和其它目標(biāo)將變得顯而易見(jiàn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種制備固定于不溶性載體上的界面酶的方法，所述方法包括如下步驟(a)提供由水性緩沖溶液和至少一種第一有機(jī)溶劑組成的雙相體系；(b)將所述界面酶與步驟(a)所提供的雙相體系混合；(c)將所述載體加入到步驟(b)的混合物中并進(jìn)行混合；(d)從步驟(c)所獲得的混合物中分離出固定在所述載體上的界面酶。在與酶雙相溶液混合之前，必要時(shí)可將所述載體洗滌以除去鹽和有機(jī)物質(zhì)，然后用溶于第二有機(jī)溶劑中的表面活性劑處理。所述不溶性載體能夠通過(guò)吸附或通過(guò)與官能團(tuán)的共價(jià)結(jié)合來(lái)與界面酶結(jié)合。所述載體優(yōu)選為有機(jī)多孔載體或無(wú)機(jī)多孔載體，優(yōu)選地選自由多孔無(wú)機(jī)載體(如二氧化硅或氧化鋁類(lèi)載體)和有機(jī)載體(如聚合物類(lèi)載體)組成的組，其中所述載體可任選地含有如環(huán)氧基或醛基等活性官能團(tuán)或者離子基團(tuán)。在本發(fā)明的方法中，所述第一有機(jī)溶劑選自烷類(lèi)(如辛烷)、醇類(lèi)(如正辛醇)、醛類(lèi)(如癸醛)和酮類(lèi)(如2-辛酮)以及它們的任何混合物。所述表面活性劑優(yōu)選為但不限于糖脂肪酸酯、聚氧乙烯糖脂肪酸酯或聚氧乙烯糖醚、中鏈或長(zhǎng)鏈烷基糖苷、磷脂、聚乙二醇衍生物或季銨。所述第二有機(jī)溶劑可以為烷類(lèi)(優(yōu)選正己垸)、醚類(lèi)(優(yōu)選乙醚)、酮類(lèi)(優(yōu)選丙酮)和醇類(lèi)(優(yōu)選異丙醇)以及它們的任何混合物。要通過(guò)本發(fā)明的方法制備的界面酶優(yōu)選為脂肪酶或磷脂酶。具體的非限制性實(shí)例是源自南極假絲酵母(Ca"力W"""tor"/w)、皺褶假絲酵母(Caw&V/aragosa)、米黑豐艮毛霉(i/z/zomwcormz'e/ze()、假單胞菌(i^ew<iomo"as、雪白根霉(i/2/zo/ms"/vew力、爪哇毛霉(A/wcoryaram'c"力、米根霉(W/^o/m10^yzae)、黑曲霉(^4s/ergi〃R"/ger)、卡門(mén)柏青霉(尸em-c""i/mcamem6eW")、產(chǎn)堿桿菌04/<^//《6恥>5伯克霍爾德氏菌(5w狄o/^r^/7.)、疏綿狀嗜熱絲孢菌(772mwo，e"a呵/顧a)、粘稠色桿菌(C/2ramokzcfen^mv^cosMm)、木瓜禾子和胰酶的酶。在另一方面，本發(fā)明涉及固定于固體多孔載體上并且鎖定在其活性構(gòu)象的界面酶。在本發(fā)明的固定化酶的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述載體均勻地覆蓋有表面活性劑，優(yōu)選為單層的所述表面活性劑。所述載體能夠通過(guò)吸附或通過(guò)與官能團(tuán)的共價(jià)結(jié)合來(lái)與所述酶結(jié)合，并且可以為有機(jī)載體或無(wú)機(jī)載體，優(yōu)選地選自如二氧化硅或氧化鋁類(lèi)載體等無(wú)機(jī)載體和如聚合物類(lèi)載體等有機(jī)載體，并且所述載體可以含有如環(huán)氧基或醛基等活性官能團(tuán)和離子基團(tuán)，或者所述載體是離子交換樹(shù)脂。在本發(fā)明的酶制品中，所述表面活性劑優(yōu)選為但不限于糖脂肪酸酯、聚氧乙烯糖脂肪酸酯或聚氧乙烯糖醚、中鏈或長(zhǎng)鏈烷基糖苷、磷脂、聚乙二醇衍生物或季銨鹽。本發(fā)明的固定化界面酶優(yōu)選為脂肪酶或磷脂酶。具體實(shí)例是源自南極假絲酵母(CamZ/abawfar"/ca)、鈹褶假絲酵母(Carafe/aragoa)、米黑根毛霉(//z/zomwcwm/e/ze/)、假單胞菌(Rsei^omowassp.)、雪白根霉(//n'zojms1w/ve附)、爪哇毛霉(Mwcorj'avo"/c—、米根霉(//zizo;ms1o，—、黑曲霧(^j/erg/〃w51w/ge尸)、卡門(mén)柏青霉(戶(hù)e"/c/〃/wwcamem6eW/)、產(chǎn)堿桿菌(j/ca"ge"ay^.)、伯克霍爾德氏菌(Sw^/^We〃'"jp.)、疏綿狀嗜熱絲孢菌(T7zemzomyc&s/awwg/"osa)、禾占稠色桿菌(C7zramo6acten'wmv&caswm)、木瓜籽和胰酶的酶。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種用于制備結(jié)構(gòu)化蠟酯的酶促方法，所述結(jié)構(gòu)化蠟酯含有起始原材料所固有的表面活性成分，所述方法包括將原始蠟原料與醇在本發(fā)明的固定化脂肪酶或通過(guò)本發(fā)明的方法制備的固定化脂肪酶的存在下反應(yīng)的步驟。在該方法中，所得的結(jié)構(gòu)化蠟酯含有起始原材料所固有的表面活性成分，從而所述蠟酯擁有改善的水分散性。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種制備脂肪酸短鏈烷基酯、優(yōu)選為脂肪酸甲酯(生物柴油)的方法，所述方法包括逐步將甲醇加入到含有本發(fā)明的脂肪酶或通過(guò)本發(fā)明的方法制備的脂肪酶的植物油、動(dòng)物油、海藻油或魚(yú)油或者至少兩種上述油的混合物中，并使反應(yīng)在適當(dāng)條件下進(jìn)行，直到所述油類(lèi)甘油三酯被轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯。在該方法中，所述植物油可以為但不限于大豆油、芥花籽油、油菜籽油、橄欖油、棕櫚油、葵花籽油、花生油、棉花籽油、廢烹調(diào)油或源自可食用植物原料的任何油類(lèi)甘油三酯。圖1:界面區(qū)域內(nèi)酶的激活過(guò)程及隨后在載體上的酶固定化過(guò)程的示意性說(shuō)明。圖2:固定于單層表面活性劑覆蓋的多孔載體上的被"鎖定"在其活性構(gòu)象的界面酶。具體實(shí)施例方式為了搜尋一種用于制備高度活性并且穩(wěn)定的固定化界面酶的新方法，本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了一種兩步技術(shù)，基本如下步驟1:通過(guò)將界面酶分子混合到由水相和疏水有機(jī)相組成的雙相體系中來(lái)強(qiáng)迫所有界面酶分子采用其活性構(gòu)象(參見(jiàn)圖l(A和B))。步驟2:將合適的載體加入到已經(jīng)含有所述酶的雙相體系中(參見(jiàn)圖l(B和C》。所述載體的主要特點(diǎn)是其將自己定位到所述雙相體系的界面中的能力。在這種情況下，可以通過(guò)簡(jiǎn)單吸附、與含有官能團(tuán)(如環(huán)氧基或醛基等)的活化樹(shù)脂共價(jià)結(jié)合或通過(guò)在離子交換樹(shù)脂上的吸附來(lái)輕易地將位于雙相界面處的活性酶分子固定到所述載體上。在本發(fā)明的活性固定化界面酶的制備中采用了該兩步技術(shù)。因此，在第一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種用于制備穩(wěn)定、高度活性的固定化界面酶、特別是脂肪酶和磷脂酶的方法，其中，提供由水性緩沖溶液和至少一種第一有機(jī)溶劑組成的雙相體系；將所述界面酶與所述雙相體系混合；將固體載體加入到所述混合物中；并且分離出固定在所述載體上的界面酶。使用特征為偏好雙相體系的界面區(qū)域的特定載體，它"釣"出了界面處存在的酶分子，從而所述酶被鎖定在其活性構(gòu)象。所述載體的親和力將取決于其孔隙度、溶脹性質(zhì)以及分散性，而這取決于該載體的極性和溶劑的極性。在雙相體系中，親水載體偏好水而疏水載體偏好非極性有機(jī)溶劑。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，為了改善載體對(duì)界面區(qū)域的親和力，可以以單層的表面活性劑覆蓋載體(可以是親水或疏水的)的表面區(qū)域。這導(dǎo)致載體在存在于雙相體系中時(shí)偏好界面區(qū)域。因此，該特點(diǎn)改善了載體捕獲"鎖定"在其活性構(gòu)象的界面酶的能力。因此，本發(fā)明提供了用于釣取酶并將其穩(wěn)定在其活性構(gòu)象的有效工具，而不是如本領(lǐng)域已知的擴(kuò)散到載體內(nèi)的酶。因此，為了增強(qiáng)固體基質(zhì)在雙相界面中的定位，可以將固體基質(zhì)、優(yōu)選為多孔基質(zhì)(也可以使用非多孔基質(zhì))如下文詳細(xì)說(shuō)明的那樣進(jìn)行修飾，從而使所述基質(zhì)均勻覆蓋有表面活性劑。經(jīng)修飾的載體的主要特點(diǎn)是它傾向于定位在疏水-親水雙相體系中產(chǎn)生的界面中。因此，在該優(yōu)選實(shí)施方式中，在與酶雙相溶液混合之前，將所述固體載體以溶于第二有機(jī)溶劑中的表面活性劑預(yù)處理。通常，首先將所述載體(優(yōu)選為多孔載體，但也可以為非多孔載體)清潔除去任何吸附的鹽和有機(jī)殘留物，然后將其干燥以除去任何殘留水分，然后與含有表面活性劑的低蒸發(fā)有機(jī)溶劑(例如，正己烷、異丙醇、乙醇、甲苯、乙腈和類(lèi)似溶劑)混合。然后除去有機(jī)溶劑，從而產(chǎn)生了均勻地覆蓋有表面活性劑的干燥的多孔固體載體。然而，本發(fā)明的方法也可以用未經(jīng)修飾的(未處理過(guò)的)載體來(lái)進(jìn)行。表面活性劑可以為非離子型或離子型(陰離子型或陽(yáng)離子型)，例如但不限于糖脂肪酸酯、聚氧乙烯糖脂肪酸酯或聚氧乙烯糖醚、中鏈或長(zhǎng)鏈垸基糖苷、磷脂、聚乙二醇衍生物或季銨鹽。具體的表面活性劑列于下文實(shí)施例中。固體載體優(yōu)選為多孔載體(可以為有機(jī)多孔載體或無(wú)機(jī)多孔載體)，所述多孔載體具體選自由如多孔無(wú)機(jī)載體(如二氧化硅或氧化鋁類(lèi)載體)和有機(jī)載體(如聚合物類(lèi)載體)組成的組，其中所述載體可任選地含有如環(huán)氧基或醛基等活性官能團(tuán)或者離子基團(tuán)。某些特定載體在下文實(shí)施例中給出，特別是在表l中給出。雙相體系由適當(dāng)?shù)乃跃彌_液和有機(jī)溶劑制備。該有機(jī)溶劑可以為但不限于垸(如辛烷)、醇(如正辛醇)、醛(如癸醛)、酮(如2-辛酮)和它們的任何混合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及固定于經(jīng)預(yù)處理的(經(jīng)修飾的)固體載體上的界面酶，所述經(jīng)預(yù)處理的固體載體均勻地覆蓋有表面活性劑、優(yōu)選為單層該表面活性劑。該獨(dú)特結(jié)構(gòu)使得所述酶能有效地用于在有機(jī)溶劑中進(jìn)行的反應(yīng)。在所述載體的表面區(qū)域上產(chǎn)生的表面活性劑單層具有由頭對(duì)頭的頭基和尾對(duì)尾的尾基所表示的獨(dú)特結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)的示意性說(shuō)明如圖2所示。在不受理論約束的情況下，該結(jié)構(gòu)似乎對(duì)于固定化酶采用其活性且有利的構(gòu)象具有主要作用。此外，表面活性劑僅附著于基質(zhì)，從而防止所述酶失活。所述酶制品可以含有來(lái)自本文所述的酶組中的一種或多種脂肪酶。要使用的基質(zhì)、表面活性劑和酶詳細(xì)說(shuō)明如上。本發(fā)明的固定化酶或通過(guò)本發(fā)明的方法制備的固定化酶非常有活性且特別穩(wěn)定。如下文表2中可見(jiàn)，即使在10次反應(yīng)循環(huán)后仍有約90%的活性被保留。該穩(wěn)定性具有重大的經(jīng)濟(jì)意義。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種用于制備結(jié)構(gòu)化蠟酯的方法，所述方法通過(guò)將蠟原料與醇在本發(fā)明的固定化脂肪酶或通過(guò)本發(fā)明的方法制備的固定化脂肪酶的存在下反應(yīng)而進(jìn)行。通過(guò)該方法獲得的蠟酯含有起始原材料所固有的表面活性成分。如下文實(shí)施例中所示，反應(yīng)體系中油類(lèi)甘油三酯與醇的摩爾比分別是1:2。因此，反應(yīng)產(chǎn)物(蠟酯)與所述油固有的甘油單酯之間的摩爾比分別是2:1。所述醇可以為任何合適的C222垸醇，優(yōu)選為十六烷醇。在過(guò)濾出固定化酶后，剩余產(chǎn)物含有比例分別為2:1的蠟酯和甘油單酯的混合物。由于甘油單酯的乳化性質(zhì)，所述混合物可以用于水分散性蠟的制備，所述蠟可用作乳霜，特別是化妝品乳霜和醫(yī)用乳霜，所述乳霜具有改善的透皮效果和保濕效果。該表面活性劑的存在賦予了所述蠟酯改善的水分散性。因此，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的蠟酯特別適合用作各種化妝和美容用產(chǎn)品(如霜?jiǎng)┖拖磩?的成分，并且能夠在不需要添加乳化劑或分散劑的情況下來(lái)使用。所形成的混合物的改善的乳化性質(zhì)是由在過(guò)程中生成的甘油單酯的存在所帶來(lái)的。甘油單酯是公知的良好乳化劑，因?yàn)樵摲肿油瑫r(shí)具有疏水域和親水域，這種結(jié)構(gòu)賦予了甘油單酯改善蠟酯在水中的分散性的能力。與在相同體系中不使用甘油單酯而制備的蠟酯相比，如此生成的蠟酯具有改善的水分散性。在一個(gè)重要實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及一種制備脂肪酸甲酯(生物柴油)的方法。通常，在該方法中，首先將甲醇逐步加入到植物油、動(dòng)物油、海藻油、魚(yú)油或源自真菌且含n-3或n-6脂肪酸的油或者至少兩種這些油的混合物中。將固定于固體載體(覆蓋有表面活性劑，優(yōu)選為單層的表面活性劑)上的脂肪酶或通過(guò)本發(fā)明的方法制備的固定化脂肪酶加入甲醇/油混合物中，并使反應(yīng)進(jìn)行直至油類(lèi)甘油三酯被轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯。應(yīng)該注意到，在本文的說(shuō)明中術(shù)語(yǔ)載體和基質(zhì)是互換使用的。如本文所公開(kāi)和說(shuō)明，應(yīng)該理解本發(fā)明不限于本文公幵的特定的實(shí)例、方法步驟和材料，因?yàn)檫@些方法步驟和材料在某種程度上可以變化。還應(yīng)該理解本文所用的術(shù)語(yǔ)僅僅是用于說(shuō)明具體實(shí)施方式的目的而不是意在限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅受所附權(quán)利要求及其等同物的限制。必須注意的是，如本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求所用，單數(shù)形式"a"、"an"和"the"包括了復(fù)數(shù)的指代物，除非內(nèi)容中明確指出相反的情況。在整個(gè)本說(shuō)明書(shū)和后附權(quán)利要求書(shū)中，除非上下文有相反要求，否則詞語(yǔ)"comprise"和如"comprises，，和"comprising"等變化形式將被理解為意味著包含所說(shuō)明的整體或步驟或者多個(gè)整體或多個(gè)步驟的組，但不排除任何其它的整體或步驟或者多個(gè)整體或多個(gè)步驟的組。下列實(shí)施例是本發(fā)明人在實(shí)施本發(fā)明的各方面時(shí)采用的技術(shù)的代表。應(yīng)該理解的是，盡管這些技術(shù)是用于本發(fā)明的實(shí)施的優(yōu)選實(shí)施方式的示例，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開(kāi)將會(huì)意識(shí)到可以在不背離本發(fā)明的預(yù)期范圍的情況下進(jìn)行各種修改。實(shí)施例實(shí)施例1——固定化脂肪酶(LipozymeTL)的制備首先用水洗滌酶載體(lg)以除去任何吸附的鹽和有機(jī)殘留物。濾出所述載體然后在真空下干燥以除去殘留水分。將干燥載體(lg)與含有非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或陽(yáng)離子表面活性劑(100mg)的如正己烷或異丙醇等有機(jī)溶劑混合。在真空下蒸發(fā)有機(jī)溶劑以產(chǎn)生均勻地覆蓋有表面活性劑(可以為但不限于磷脂酰膽堿、AOT(琥珀酸二(2-乙基己基)酯磺酸鈉)、聚乙二醇、Tween20、Tween40、Tween60、Tween65、Tween80、Tween85、Span20、Span40、Span60、Span65、Span80、Span85和糖脂肪酸酯(如脫水山梨糖醇單油酸酯、二油酸酯和三油酸酯或其它脫水山梨糖醇脂肪酸酯))的干燥載體。將源自疏綿狀嗜熱絲孢菌(77^mom^cM/"m^"wa)的脂肪酶(1ml的LipozymeTLIOOL，Novozymes，丹麥)混合到由10ml磷酸鹽緩沖液(0.05M,pH6.5)和10ml正己烷組成的雙相體系中。將混合物劇烈攪拌10分鐘，接著加入經(jīng)表面活性劑處理過(guò)的多孔載體。將混合物再攪拌4小時(shí)。濾出含有固定化酶的載體并在干燥器中干燥過(guò)夜從而得到高度活性的固定化脂肪酶。所述固定化過(guò)程也可以使用未修飾的載體進(jìn)行。表1顯示了固定于不同載體上的LipozymeTL100L的相對(duì)酯交換活性。反應(yīng)通過(guò)將固定化脂肪酶(0.5g)加入到橄欖油(lOg)和十六垸醇(5.5g)(油類(lèi)甘油三酯:十六烷醇的摩爾比是2:1)中來(lái)進(jìn)行。將反應(yīng)體系在6(TC磁力攪拌或通過(guò)振搖而混合。在反應(yīng)3小時(shí)后通過(guò)計(jì)算反應(yīng)3小時(shí)后的橄欖油甘油三酯的峰面積總和與時(shí)間零點(diǎn)時(shí)的橄欖油甘油三酯的峰面積總和之比來(lái)確定橄欖油甘油三酯向蠟酯的轉(zhuǎn)化率。表1:反應(yīng)3小時(shí)后橄欖油甘油三酯向蠟酯的轉(zhuǎn)化率(％)。反應(yīng)條件橄欖油(IOg)和十六垸醇(5.5g)與固定于不同載體上的脂肪酶TL100L(0.55g)混合3小時(shí)。將反應(yīng)混合物以300rpm在6(TC振搖。_載體類(lèi)型轉(zhuǎn)化率(％)轉(zhuǎn)化率(％)(未修飾載體)(經(jīng)修飾載體)AmberliteXAD4(Rohm&Hass，美國(guó))3867AmberliteXAD16(Rohm&Hass)2377AmberliteXAD7HP(Rohm&Hass)2466AmberliteXAD16HP(Rohm&Hass)3055DuoliteXAD761(Rohm&Hass)4155AmberliteXAD1180(Rohm&Hass)2561AmberliteXAD1600(Rohm&Hass)2366DuoliteXADA7(Rohm&Hass)1952DuoliteXADA561(Rohm&Hass)1858<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>當(dāng)反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)狀況時(shí)，過(guò)濾出固定化酶以獲得所需產(chǎn)物。該產(chǎn)物由摩爾比分別為2:1的蠟酯和橄欖油固有的甘油單酯組成。該獨(dú)特比例賦予了所述產(chǎn)物改善的水分散性，因而所述產(chǎn)物能用于乳霜?jiǎng)┨貏e是化妝或醫(yī)用乳霜的制備而無(wú)須使用外部乳化劑。實(shí)施例2——固定化脂肪酶用于制備脂肪酸甲酯(生物柴油)根據(jù)上述程序使用各種載體將各種的脂肪酶或脂肪酶混合物固定化。產(chǎn)生較高的甲醇和植物油甘油三酯形成脂肪酸甲酯的酯交換活性的主要脂肪酶包括南極假絲酵母(C朋c//^朋torc"'cfl)脂肪酶B(CALB-L，Novozymes，丹麥)、月旨肪酶QLM(產(chǎn)堿桿菌(J/ca/^e""MeitoSangyo，曰本)、疏綿狀嗜熱絲孢菌(LipozymeTL100L，Novozymes，丹麥)、假單胞菌CPsewcfomo"assp.，月旨肪酶PS，Amanoenzymes,曰本)。反應(yīng)條件如下大豆油(2.5g)和甲醇(在6小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間段內(nèi)將0.3ml以每步0.1ml分步加入)。通過(guò)加入固定化脂肪酶(IOOmg)啟動(dòng)反應(yīng)并將反應(yīng)介質(zhì)在35"C振搖6小時(shí)。表2顯示了在10次連續(xù)循環(huán)中使用同一生物催化劑時(shí)在6小時(shí)反應(yīng)時(shí)間后大豆油甘油三酯向脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率。表2:在10次連續(xù)循環(huán)中使用同一生物催化劑時(shí)在6小時(shí)反應(yīng)時(shí)間后大豆油甘油三酯向脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>如表2中可見(jiàn)，所述酶的大部分活性即使在10次反應(yīng)循環(huán)后仍然得以保留。權(quán)利要求1.一種制備固定于不溶性載體上的界面酶的方法，所述方法包括下列步驟(a)提供由水性緩沖溶液和至少一種第一有機(jī)溶劑組成的雙相體系；(b)將所述界面酶與步驟(a)所提供的雙相體系混合；(c)將所述載體加入到步驟(b)的混合物中并進(jìn)行混合；(d)從步驟(c)所獲得的混合物中分離出固定在所述載體上的界面酶。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，在與步驟(b)中獲得的酶雙相溶液混合之前，必要時(shí)將所述載體洗滌以除去鹽和有機(jī)物質(zhì)，然后用溶于第二有機(jī)溶劑中的表面活性劑處理。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述不溶性載體能夠通過(guò)吸附或通過(guò)與官能團(tuán)的共價(jià)結(jié)合來(lái)與所述酶結(jié)合。4.如權(quán)利要求13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述載體是有機(jī)多孔載體或無(wú)機(jī)多孔載體，優(yōu)選地選自由如二氧化硅或氧化鋁類(lèi)載體等多孔無(wú)機(jī)載體和如聚合物類(lèi)載體等有機(jī)載體組成的組，其中，所述載體必要時(shí)含有如環(huán)氧基或醛基等活性官能團(tuán)、或者離子基團(tuán)。5.如權(quán)利要求14中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一有機(jī)溶劑選自垸類(lèi)(如辛垸)、醇類(lèi)(如正辛醇)、醛類(lèi)(如癸醛)和酮類(lèi)(如2-辛酮)以及它們的任何混合物。6.如權(quán)利要求25中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述表面活性劑選自糖脂肪酸酯、聚氧乙烯糖脂肪酸酯或醚、中鏈或長(zhǎng)鏈烷基糖苷、磷脂、聚乙二醇衍生物和季銨鹽。7.如權(quán)利要求26中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第二有機(jī)溶劑選自烷類(lèi)、醚類(lèi)、酮類(lèi)和醇類(lèi)以及它們的任何混合物，所述烷類(lèi)優(yōu)選如正己烷，所述醚類(lèi)優(yōu)選如乙醚，所述酮類(lèi)優(yōu)選如丙酮，所述醇類(lèi)優(yōu)選如異丙醇。8.如權(quán)利要求18中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述酶是脂肪酶或磷脂酶。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述酶選自由南極假絲酵母(Ca"^ia""torc"ca)、鈹褶假絲酵母(Ca"tfe/an/gow)、米黑根毛霉(W/2feowwcorW7z.e/7e/)、假單胞菌(i^ewfifcwowos)、雪白根霉(i/2/zopws"/vew力、爪哇毛霉(A/wcorJav""/cM力、米根霉(i/n'zc;pws07加e)、黑曲霉(Jsperg7,〃us、卡門(mén)柏青霉(Pew/c/〃/wwccw7ew6eW/)、產(chǎn)堿桿菌(力/c"/^e"a^.)、伯克霍爾德氏菌08w^:/wWen》w.)、疏綿狀嗜熱絲孢菌(772e/-wow_ycay/awwg/wosa)、茅占桐色桿菌(C7zromo6acferz'wmvhcosz/附)、木瓜籽和胰酶組成的組。10.—種固定于固體載體上的界面酶，其中，所述酶被鎖定在其催化活性構(gòu)象。11.一種固定于固體多孔載體上的界面酶，其中，所述載體均勻地覆蓋有表面活性劑，優(yōu)選為單層的所述表面活性劑。12.如權(quán)利要求10所述的酶，其中，所述載體能夠通過(guò)吸附或通過(guò)與官能團(tuán)的共價(jià)結(jié)合來(lái)與所述酶結(jié)合。13.如權(quán)利要求1012中任一項(xiàng)所述的酶，其中，所述載體為有機(jī)載體或無(wú)機(jī)載體，優(yōu)選地選自由如二氧化硅或氧化鋁類(lèi)載體等無(wú)機(jī)載體和如聚合物類(lèi)載體等有機(jī)載體組成的組，其中所述載體含有或不含如環(huán)氧基或醛基等活性官能團(tuán)和離子基團(tuán)，或者所述載體是離子交換樹(shù)脂。14.如權(quán)利要求1113中任一項(xiàng)所述的酶，其中，所述表面活性劑選自糖脂肪酸酯、聚氧乙烯糖脂肪酸酯或醚、中鏈或長(zhǎng)鏈垸基糖苷、磷脂、聚乙二醇衍生物和季銨鹽。15.如權(quán)利要求1014中任一項(xiàng)所述的酶，其中，所述酶是脂肪酶或磷脂酶。16.如權(quán)利要求15所述的酶，其中，所述酶選自由南極假絲酵母(Omo^a朋torc"ca)、芻皮褶假絲酵母(Ca"c^"ragosa)、米黑根毛霉(i/^zomwcorm/e/zez〕、假單胞菌(i^ei^/omowos>s_p.)、雪白根霉(i/2&0pusmVe—、爪哇毛霉(她corj'av畫(huà)'cw力、米根霉(朋/zo/uso，oe)、黑曲霉(^4^erg7,〃1^w/ger)、卡門(mén)柏青霉CPew'c,〃/wwcawem6eW")、產(chǎn)堿桿菌(J/cfl/Zgew^w.)、伯克霍爾德氏菌(Bw^:/2oWen'a^.)、疏綿狀嗜熱絲孢菌(77zermom_yces/a"wgiwosa)、茅占禾周色桿菌(C72ro附o6fl"erifw附v&cosw附)、木瓜籽和胰酶組成的組。17.—種用于制備結(jié)構(gòu)化蠟酯的酶促方法，所述方法包括將甘油三酯原料與醇在權(quán)利要求15或16所定義或者通過(guò)權(quán)利要求9的方法所制備的固定化脂肪酶的存在下反應(yīng)的步驟，其中，所述蠟酯含有起始原材料所固有的表面活性成分，從而所述蠟酯擁有改善的水分散性。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述醇為(32~22烷醇，優(yōu)選為十六烷醇。19.一種制備脂肪酸短鏈烷基酯的方法，所述脂肪酸短鏈垸基酯優(yōu)選為脂肪酸甲酯(生物柴油)，所述方法包括下列步驟逐步將甲醇加入到含有脂肪酶的植物油、動(dòng)物油、海藻油或魚(yú)油或者至少兩種上述油的混合物中，所述脂肪酶如權(quán)利要求1016中任一項(xiàng)所定義或通過(guò)權(quán)利要求19中任一項(xiàng)所述方法所制備；并使反應(yīng)在適當(dāng)條件下進(jìn)行，直到所述油類(lèi)甘油三酯被轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述植物油是大豆油、芥花籽油、油菜籽油、橄欖油、棕櫚油、葵花籽油、花生油、棉花籽油、廢烹調(diào)油或源自可食用植物原料的任何油類(lèi)甘油三酯。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)以下步驟制備固定于不溶性載體上的界面酶的方法提供由水性緩沖溶液和至少一種第一有機(jī)溶劑組成的雙相體系；將所述界面酶與所提供的雙相體系混合；將所述載體加入到所獲得的混合物中并進(jìn)行混合；從上一步所獲得的混合物中分離出固定在所述載體上的界面酶而進(jìn)行。所生成的酶被鎖定在其催化活性構(gòu)象，因而顯示出改善的活性和穩(wěn)定性。本發(fā)明還公開(kāi)了所生成酶的應(yīng)用，特別是在生物柴油的制備中的應(yīng)用。文檔編號(hào)C12N11/00GK101631857SQ200780050097公開(kāi)日2010年1月20日申請(qǐng)日期2007年12月31日優(yōu)先權(quán)日2007年1月8日發(fā)明者蘇卜希·巴舍爾申請(qǐng)人:轉(zhuǎn)換生物柴油有限公司