專利名稱：生物分子表面展示及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及生物分子表面展示系統(tǒng)，以及展示作為疫苗的膜糖蛋 白的特定應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防禽流感的方法、疫苗、 免疫組合物和試劑盒，以及涉及調(diào)節(jié)對(duì)禽流感病毒的免疫應(yīng)答的相關(guān)方
法。更具體而言，本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防毒株H5Nl禽流感病毒的 方法、疫苗、免疫組合物和試劑盒，以及涉及用于調(diào)節(jié)對(duì)毒抹H5N1禽流 感病毒的免疫應(yīng)答的方法。
背景技術(shù)：
禽流感病毒是重大的世界性的烏類傳染病，其是由流感病毒的A型毒 林引起的。所有鳥類被認(rèn)為容易感染該疾病，這可產(chǎn)生從輕微發(fā)病到高度 接觸傳染范圍內(nèi)的癥狀以及迅速致命的發(fā)病機(jī)理，導(dǎo)致嚴(yán)重的流行病。
已知15種流感病毒亞型傳染鳥類，因此在鳥群內(nèi)提供了廣泛的流感病 毒貯存宿主。具體而言，因?yàn)楹蝤B對(duì)傳染具有天生抵抗力，因此它們對(duì)傳 染其他鳥群，諸如特別容易感染迅速致命流感流行病的家禽，提供了有力 的載體。高致病形式的所有爆發(fā)都是由亞型H5和H7的流感A病毒引起。
受染地區(qū)的檢疫以及受染或暴露群體的毀滅是針對(duì)防止禽流感病毒傳 播的標(biāo)準(zhǔn)程序。然而，此類措施不僅受阻于高接觸傳染性、易于傳播性以 及病毒在其天然宿主體外的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，而且就實(shí)施此類措施以及對(duì)鳥類 的毀滅而言，它們還導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)代價(jià)。
1997年在香港，禽流感病毒的H5N1毒林從鳥類直接轉(zhuǎn)移到人，在18 個(gè)人身上引發(fā)嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病，其中6人死亡。此次傳染與由相同毒 株引起的禽流感病毒的香港家禽種群流行病同時(shí)爆發(fā)。2003年的另一次爆 發(fā)引發(fā)2例并且1人死亡。人類感染禽流感病毒的進(jìn)一步病例已經(jīng)在幾個(gè)國(guó)家觀察到，包括荷蘭、越南和中國(guó)。另外，鳥類感染H5N1毒林的最近 爆發(fā)已經(jīng)在東歐特別是土耳其進(jìn)行了報(bào)道。
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的病毒捕獲基因。另外，來自H5N1的分離林具有高致病性并且能夠在人 身上引發(fā)嚴(yán)重的疾病。從感染中幸存的鳥類經(jīng)口以及通過糞便排泄病毒至 少10天，從而促進(jìn)了活家禽市場(chǎng)上以及通過候鳥的進(jìn)一步傳播。
有關(guān)人感染H5N1禽流感病毒的臨床進(jìn)展的數(shù)據(jù)非常有限，并且抗病毒 藥——其中僅有一些可以被用于治療和預(yù)防——也具有局限性。
本發(fā)明基于生物分子表面展示系統(tǒng)的開發(fā)，以及此類系統(tǒng)展示作為疫 苗的膜糖蛋白的特定應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防禽流感的 方法、疫苗、免疫組合物和試劑盒，以及涉及用于調(diào)節(jié)對(duì)禽流感病毒的免 疫應(yīng)答的相關(guān)方法。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供用于呈遞或展示多肽的方法，其中所述 方法包4舌
(a) 將編碼所述多肽的核酸插入桿狀病毒表達(dá)載體中，其中所述桿狀病 毒表達(dá)載體包括來自白斑綜合癥病毒的iel啟動(dòng)子；
(b) 用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至少一種宿主細(xì)胞；和
(c) 從所述表達(dá)載體中表達(dá)所述多肽，其中所述多肽被呈遞或展示在桿 狀病毒的表面膜上。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供用于呈遞或展示多肽的系統(tǒng)，其中所述 系統(tǒng)包括
(a) 編碼所述多肽的核酸，其被插入桿狀病毒表達(dá)載體中，其中所述桿 狀病毒表達(dá)載體包括來自白斑綜合癥病毒的iel啟動(dòng)子；
(b) 用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至少一種宿主細(xì)胞的方法；和
(c) 用于從所述表達(dá)載體表達(dá)所述多肽的方法，其中所述多肽被呈遞或展示在桿狀病毒的表面膜上。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供用于治療或預(yù)防受治療者疾病的疫苗， 其中所述疾病與禽流感病毒有關(guān)，并且其中所述疫苗包括含有編碼血凝素 肽的核酸的表達(dá)載體，使得在使用時(shí)所述血凝素肽通過所述表達(dá)載體在所 述受治療者中表達(dá)。
受治療者可以是人、禽或豬。
禽流感病毒可以是禽流感病毒的H5N1亞型。
表達(dá)載體可以包括桿狀病毒表達(dá)載體。所述桿狀病毒表達(dá)載體可以是 含有水泡性口膜炎病毒糖蛋白的假性病毒載體。
表達(dá)載體可以進(jìn)一步包括啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可以包括來自白斑綜合
癥病毒的iel啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子可以可操作連接至編碼抗原肽的核酸。 血凝素肽可以包括來源于禽流感病毒的H5N1亞型的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供用于治療或預(yù)防受治療者疾病的疫苗， 其中所述疾病與禽流感病毒相關(guān)，并且其中所述疫苗包括表達(dá)載體，其包 含
(a) 編碼血凝素肽的核酸；和
(b) 來自白斑綜合癥病毒的iel啟動(dòng)子，其與編碼血凝素肽的所述核酸可 操作連接，使得在使用時(shí)，所述血凝素肽通過所述受治療者中的所述表達(dá) 載體表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體包括
(a) 編碼抗原肽的核酸；和
(b) 與編碼抗原肽可操作連接的、來自白斑綜合癥病毒的iel啟動(dòng)子， 其中所述抗原肽包括血凝素肽，其包含來源于禽流感病毒的H5N1亞型
的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供第五方面所述的用于治療或預(yù)防受治療 者疾病中的表達(dá)載體，其中所述疾病與禽流感病毒相關(guān)，使得在應(yīng)用時(shí)， 所述抗原肽通過所述受治療者中的所述表達(dá)載體表達(dá)。
7根據(jù)本發(fā)明的第七方面，提供宿主細(xì)胞，其包含第五或第六方面所述 的表達(dá)載體。
根據(jù)本發(fā)明的第八方面，提供組合物，其包括選自第三或第四方面所 述的疫苗、第五或第六方面所述的表達(dá)載體或者第七方面所述的宿主細(xì)胞 的免疫增強(qiáng)劑，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
所述組合物可以任選包括佐劑。
根據(jù)本發(fā)明的第九方面，提供用于治療或預(yù)防受治療者疾病的疫苗， 其包括第五或第六方面所述的表達(dá)載體、第七方面所述的宿主細(xì)胞或者第 八方面所述的組合物，其中所述疾病與禽流感病毒有關(guān)。
根據(jù)本發(fā)明的第十方面，提供用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法，其中所述方 法包括向受治療者施用有效量的免疫增強(qiáng)劑，所述免疫增強(qiáng)劑選自第三、 第四或第九方面所述的疫苗、第五或第六方面所述的表達(dá)載體、第七方面 所述的宿主細(xì)胞或者第八方面所述的組合物。
根據(jù)本發(fā)明的第十 一方面，提供用于治療或預(yù)防與禽流感病毒有關(guān)的 疾病的方法，其中所迷方法包括向受治療者施用有效量的免疫增強(qiáng)劑，所 述免疫增強(qiáng)劑選自第三、第四或第九方面所述的疫苗、第五或第六方面所 述的表達(dá)載體、第七方面所迷的宿主細(xì)胞或者第八方面所述的組合物。
根據(jù)本發(fā)明的第十二方面，提供第三、第四或第九方面所述的疫苗、 第五或第六方面所述的表達(dá)載體、第七方面所述的宿主細(xì)胞或者第八方面 所述的組合物在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答方面的用途。
根據(jù)本發(fā)明的第十三方面，提供第三、第四或第九方面所述的疫苗、 第五或第六方面所述的表達(dá)載體、第七方面所述的宿主細(xì)胞或者第八方面 所述的組合物，在制造用于治療與禽流感病毒有關(guān)的疾病的藥物方面的用 途。
根據(jù)本發(fā)明的第十四方面，提供用于治療或預(yù)防受治療者疾病的試劑 盒，其中所述疾病與禽流感病毒有關(guān)，其中所述試劑盒包括第三、第四或 第九方面所述的疫苗、第五或第六方面所述的表達(dá)載體、第七方面所述的 宿主細(xì)胞或者第八方面所述的組合物。


現(xiàn)在將參考下列附圖描述本發(fā)明，其僅為實(shí)例的方式。
圖1.重組桿狀病毒的構(gòu)建和產(chǎn)生。(A) vAc-桿粒、vAc-HA和vAc-G-HA 的基因組的示意表示。利用Bac-to-Bac系統(tǒng)，期望的VSVG或HA表達(dá)盒 經(jīng)過位點(diǎn)專一轉(zhuǎn)座^^皮插入多角體蛋白基因座中。(B)在感染vAc-G-HA的 Sf9細(xì)胞中形成合胞體，如通過白色箭頭所示。圖像在轉(zhuǎn)導(dǎo)后72小時(shí)時(shí)捕 獲。(C)一步生長(zhǎng)曲線。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示三個(gè)單獨(dú)的感染的平均值。Sf9細(xì) 胞通過單個(gè)病毒來感染，其中MOI為0.5。
圖2.展示在桿狀病毒載體表面上的HA的表征。(A)在純化vAc-HA和 vAc-G-HA顆粒中的HA的膜締合。純化H5N1毒粒用作陽性對(duì)照。泳道 1，純化vAc-桿粒毒粒作為陰性對(duì)照；泳道2，純化核衣殼，來自用Triton X-100處理的vAc-G-HA毒粒；泳道3，完整的vAc-G-HA毒粒；泳道4， 來自用vAc-G-HA感染的Sf9細(xì)胞的總細(xì)胞提取物；泳道5，來自用 vAc-G-HA感染的Sf9細(xì)胞的總細(xì)胞提取物；泳道6,完整的vAc -HA毒 粒；泳道7，純化核衣殼，來自用TritonX-100處理的vAc-HA毒粒。(B) 在純化vAc-G-HA顆粒中VSV G的膜締合。泳道1-4是與(A)相同的樣品。 (C)展示HA的桿狀病毒的血凝活性。利用連續(xù)兩倍稀釋的純化vAc-G-HA 顆粒和每測(cè)試孔0.5%雞紅細(xì)胞懸浮液確定血凝滴度，起始稀釋為1:2。
圖3. (A)和(B) HA基因通過vAc-G-HA的轉(zhuǎn)導(dǎo)。MDCK或Df-l細(xì)胞用 MOI為100的vAc-G-HA轉(zhuǎn)導(dǎo)。16 h后，固定細(xì)胞進(jìn)行IFA試驗(yàn)，或者收 獲細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。(A)在用HA1特異性單克隆抗體的IFA試驗(yàn) 中，轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的熒光顯微照片。箭頭指向陽性熒光細(xì)胞。利用倒 置熒光顯微鏡術(shù)檢測(cè)熒光信號(hào)，并通過數(shù)字圖像系統(tǒng)捕獲圖像。(B)利用抗 HA1血清，通過蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)兩種轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的HA。泳道1,MDCK 細(xì)胞提取物；泳道2， Df-I細(xì)胞提取物；泳道3，純化的H5N1毒粒，作為 陽性對(duì)照。(C)通過抗原捕獲ELISA，量化展示在vAc-G-HA毒粒上的HA 分子。在試驗(yàn)中，來自豚鼠的純化IgG和單克隆抗體分別被用作檢測(cè)物和 捕捉抗體。10倍連續(xù)稀釋的HA1蛋白質(zhì)被用于建立如所示的標(biāo)準(zhǔn)定量曲 線。
9圖4. (A) vAc-G-HA的抗原分析。 一組5只小鼠(Ml- M5)被月幾內(nèi)注射 vAc-G-HA顆粒。兩只對(duì)照小鼠(C1和C2)被注射等量的純化vAc-桿粒毒 粒。通過ELISA監(jiān)測(cè)誘導(dǎo)抗體，其中HA1蛋白質(zhì)被包被作為捕捉抗原。 結(jié)果以1:10稀釋血清的平均吸光度表達(dá)。(B)用vAc-G-HA免疫處理的小 鼠的血清HI滴度。ffl滴度纟皮表達(dá)為兩倍血清稀釋的終點(diǎn)。
圖5. (A)展示HA的桿狀病毒的抗原分析。三組5只小鼠各自被肌內(nèi)注 射vAc-G-HA、 vAc-HA、滅活H5N1/PR8和vAc-桿粒。通過ELISA用包 被的純HAI蛋白作為捕捉抗原來測(cè)試來自各組的收集血清樣品。結(jié)果表示 為1:10稀釋血清的平均吸光度。(B)對(duì)來自免疫小鼠的收集血清的HI試 驗(yàn)和中和試驗(yàn)。HI滴度被表達(dá)為兩倍血清稀釋中的終點(diǎn)。在中和試驗(yàn)中， 從10至640的2倍系列稀釋液與含有2 x 103 TCID5Q/ml的流感病毒的等 體積病毒稀釋液混合。通過IFA試驗(yàn)利用多克隆抗HA1抗體監(jiān)測(cè)病毒蛋白 質(zhì)的存在。中和滴度以系列稀釋中的終點(diǎn)表達(dá)。
定義
如本文所用，術(shù)語"包括(comprising)"是指"主要但未必僅僅包括。" 此外，詞語"包括，，的變體，諸如"包括(comprise)"和"包括(comprises)" 具有相應(yīng)變化的含義。
如本文所用，術(shù)語"治療(treating)"和"治療(treatment)"是指任何和 所有用途，其治療病癥或癥狀，預(yù)防病癥或癥狀的產(chǎn)生，或者另外以其他 任何方式預(yù)防、阻礙、延遲、改善或逆轉(zhuǎn)病癥或疾病或其他不良的癥狀。
如本文所用，術(shù)語"有效量(effective amount)"在其含義內(nèi)包括無毒但 是可提供期望效果的足夠量的藥物或化合物。所需的確切數(shù)量將在受治療 者間有所變化，這i[又決于諸如被治療的物種、受治療者的年齡和綜合狀態(tài)、 被治療的病癥的嚴(yán)重度、被施用的特定藥物以及施用方式之類的因素。因 此，規(guī)定確切的"有效量"是不可能的。然而，對(duì)于任何給定的情況，適當(dāng) 的"有效量，，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員僅僅利用常規(guī)試驗(yàn)則可以確定。
如本文所用，術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"可互換使用來指氨基酸殘基的聚合物以及指它們的片段、變體、類似物、直向同源物(orthologues)
或同源物。因此，這些術(shù)語適用氨基酸聚合物——其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸 殘基是合成的、非天然的氨基酸，諸如相應(yīng)的天然氨基酸的化學(xué)類似物， 以及適用天然的氨基酸聚合物。
如本文所用，術(shù)語"多核脊酸"或"核酸"可被互換施用并且表示包含一個(gè)
或多個(gè)核苷酸或寡核苷酸或其片段的分子，包括但不限于RNA或DNA核 香酸或其組合。
在術(shù)語的范圍內(nèi)，如本文所用的"蛋白質(zhì)"、"多肽"、"肽"、"多核苷酸" 和"核酸"是它們的片段和變體，包括但不限于多核苷酸和核酸的反向互補(bǔ) (reverse compliment)和反義形式。
術(shù)語"片段"是指編碼全長(zhǎng)蛋白質(zhì)或基因或者是全長(zhǎng)蛋白質(zhì)或基因的組 成部分的多核苷酸或多肽序列。就多肽而言，片段可以具有與全長(zhǎng)蛋白質(zhì) 相同的定性生物活性。
如本文所用術(shù)語"變體"是指基本類似的序列。通常地，核酸序列變體可 以編碼具有相同的定性生物活性的多肽。通常地，多肽序列變體也可以具 有相同的定性生物活性。此外，這些多肽序列變體可以共享至少50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97°/。、 98%或99% 的序列同同一性。
此外，變體多肽可以包括類似物，其中術(shù)語"類似物，，是指為所公開多肽 的4汙生物的多肽，該衍生物包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的添加、缺失或取代， 使得多肽基本保留與其所衍生的天然多肽相同的功能。
如本文所用，術(shù)語"表達(dá)載體"是指核酸，其具有提供其可操作連接的核 酸片段在細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)的能力。在本發(fā)明的上下文 中，應(yīng)當(dāng)理解，包括如本文所定義的啟動(dòng)子的表達(dá)載體可以是質(zhì)粒、噬菌 體、噬菌粒、粘粒、病毒亞基因組或基因組片段，或者其他能夠保持和/ 或復(fù)制可表達(dá)形式的異源DNA的核酸，如果其被引入細(xì)胞中的話。
如本文所用，術(shù)語"可操作連接"是指轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)的多核苦酸，其相 對(duì)于編碼多肽的多核香酸以使得多核苷酸被轉(zhuǎn)錄以及多肽被翻譯的方式
ii進(jìn)行定位。
如本文所用，術(shù)語"啟動(dòng)子"包括基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，其包括
TATA框或起始子元件，其可以是精確轉(zhuǎn)錄起始必需的，具有或不具有另
外的調(diào)控元件，所述調(diào)控元件響應(yīng)發(fā)育和/或外刺激或者以組織特異性方式 改變基因表達(dá)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"啟動(dòng)子"也被用于描述重組、 合成或融合分子，或者衍生物，其賦予、激活或增強(qiáng)其可操作連接的核酸 以及編碼肽的核酸的表達(dá)。
如本文所用，短語"禽流感病毒"包括引發(fā)或懷疑引發(fā)受治療者疾病的任 何病毒，其包括但不限于禽、豬或人類受治療者。具體而言，"禽流感病毒"
包括所有類型的禽流感病毒，包括4旦不限于A型，以及禽流感病毒的所有 亞型，包括但不限于亞型H5 (特別是H5N1和H5N2)和H7 (特別是H N1)。
如本文所用，短語"與禽流感病毒有關(guān)的疾病"是指由禽流感病毒引起或 與其有關(guān)的任何疾病、疾病狀態(tài)或病癥。
如本文所用，術(shù)語"調(diào)節(jié)(modulating)"當(dāng)涉及免疫應(yīng)答使用時(shí)，是指 直接或間接增加或減小對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了生物分子表面展示系統(tǒng)，以及其展示作為疫苗的 膜糖蛋白的特定應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明人已經(jīng)通過協(xié)同表面展示以及病 毒血凝集素(HA)蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)展示了桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為對(duì)抗流 感病毒的免疫試劑的應(yīng)用。免疫顯性病毒膜HA蛋白質(zhì)以及VSV G蛋白在 重組桿狀病毒表面上的有效展示在對(duì)抗流感病毒的接種疫苗策略上提供 很大的優(yōu)勢(shì)。除這種桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為接種疫苗載體的應(yīng)用之外，病 毒膜展示系統(tǒng)也可以被用于表征很多種病毒膜糖蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。
在來自白斑綜合癥病毒的iel啟動(dòng)子的控制下，利用桿狀病毒載體， H5N1流感病毒的HA基因被有效表達(dá)在昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。HA與水 泡性口膜炎病毒糖蛋白的同時(shí)展示不會(huì)降低在桿狀病毒表面上HA展示的 效力。部分裂解的HA蛋白質(zhì)一皮展示在桿狀病毒表面上，從而賦予病毒顆粒血凝活性。將展示HA的純化桿狀病毒肌內(nèi)注射進(jìn)入小鼠中刺激了具有 血凝抑制活性的抗體的產(chǎn)生。這種桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)因此包含抗原HA肽 作為結(jié)構(gòu)蛋白并且維持通過體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)肽的能力。
呈遞或展示生物分子的方法、試劑盒和系統(tǒng)
本發(fā)明公開了生物分子表面展示系統(tǒng)，以及此類系統(tǒng)展示作為疫苗的 膜糖蛋白的特定應(yīng)用。如對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，這些生物分 子表面展示系統(tǒng)不限于在此所公開的特定應(yīng)用，而是在期望呈遞生物分子 特別是膜糖蛋白的任何情況下找到廣泛應(yīng)用。
因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明公開了涉及膜糖蛋白表面展示的疫 苗生產(chǎn)的方法、試劑盒和系統(tǒng)。這些方法、試劑盒和系統(tǒng)可以利用在此所
示例的基于桿狀病毒的表面展示系統(tǒng)，其與抗毒抹H5N1禽流感病毒的疫 苗生產(chǎn)相關(guān)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到并且理解，涉及膜糖蛋白表 面展示的疫苗生產(chǎn)的方法、試劑盒和系統(tǒng)并不限于本文所公開的疫苗的生產(chǎn)。
因此，本發(fā)明提供用于呈遞或展示多肽的方法，其中所述方法包括
(a) 將編碼所述多肽的核酸插入桿狀病毒表達(dá)載體中，其中所述桿狀病 毒表達(dá)載體包括來自白斑綜合癥病毒的iel啟動(dòng)子；
(b) 用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至少一種宿主細(xì)胞；和
(c) 從所述表達(dá)載體中表達(dá)所述多肽，其中所述多肽被呈遞或展示在桿 狀病毒的表面膜上。
本發(fā)明進(jìn)一步提供用于呈遞或展示多肽的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)包括
(a) 編碼所述多肽的核酸，其被插入桿狀病毒表達(dá)載體中，其中所述桿 狀病毒表達(dá)載體包括來自白斑綜合癥病毒的iel啟動(dòng)子；
(b) 用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至少一種宿主細(xì)胞的方法；和
(c) 用于從所述表達(dá)載體表達(dá)所述多肽的方法， 其中所述多肽被呈遞或展示在桿狀病毒的表面膜上。疫苗
本發(fā)明也提供用于治療或預(yù)防受治療者疾病的疫苗，其中所述疾病與 禽流感病毒有關(guān)，并且其中所述疫苗包括含有編碼血凝素肽的核酸的表達(dá) 載體，使得在使用時(shí)所述血凝素肽通過所述表達(dá)載體在所述受治療者中表 達(dá)。
受治療者可以是人、禽或豬。
禽流感病毒可以是禽流感病毒的H5N1亞型。
表達(dá)載體可以包括桿狀病毒表達(dá)載體。所述桿狀病毒表達(dá)載體可以是 具有水泡性口膜炎病毒糖蛋白的假性病毒載體。
表達(dá)載體可以包括啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可以包括來自白斑綜合癥病毒 的iel啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子可以可操作連接至編碼抗原肽的核酸。
血凝素肽可以包括來源于禽流感病毒的H5N1亞型的氨基酸序列。
本發(fā)明也包括用于治療或預(yù)防受治療者疾病的疫苗，所述疫苗包括如 本文所述的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞或組合物，其中所述疾病與禽流感病毒有 關(guān)。
表達(dá)載體和宿主細(xì)胞
本發(fā)明也提供包含編碼抗原肽的核酸的表達(dá)載體，其中所迷抗原肽包 括血凝素肽，該血凝素肽包括來源于禽流感病毒的H5N1亞型的氨基酸序 列。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包含編碼抗原肽的核酸的表達(dá)載體，用于治療或預(yù) 防受治療者疾病，其中所述疾病與禽流感病毒相關(guān)，使得在應(yīng)用時(shí)，所述 抗原肽通過所述受治療者中的所述表達(dá)載體表達(dá)。
本發(fā)明也提供包含如本文所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
組合物和免疫增強(qiáng)劑
本發(fā)明包括組合物，所述組合物包括免疫增強(qiáng)劑以及藥學(xué)上可接受的 載體、稀釋劑或賦形劑，所述免疫增強(qiáng)劑選自如本文所述的疫苗、表達(dá)載 體或宿主細(xì)月包。
14免疫增強(qiáng)劑可以被配制成作為中性或鹽形式的組合物。藥學(xué)上可接受 的鹽包括酸加成鹽(利用肽的自由氨基基團(tuán)形成)，并且其利用無機(jī)酸形成， 例如，諸如鹽酸或磷酸，或利用此類有機(jī)酸形成，諸如乙酸、草酸、酒石 酸、馬來酸等。利用自由羧基形成的鹽也可以衍生自無機(jī)堿，例如，諸如 氫氧化鈉、氫氧化鐘、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及衍生自此類 有機(jī)堿，諸如異丙胺、三曱胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。
一般而言，合適的組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備， 并且可以包括藥學(xué)上可接受的稀釋劑、佐劑和/或賦形劑。就與該組合物的 其他成分相容而言，稀釋劑、佐劑和賦形劑必須是"可接受的，，并且對(duì)其受 體無毒。
藥學(xué)上可接受的稀釋劑的實(shí)例是去礦質(zhì)水或蒸餾水；鹽水溶液；植物 基油，諸如花生油、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、芝麻油，諸如花 生油、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油；硅 油，包括聚硅氧烷，諸如曱基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧 烷(polysolpoxane);揮發(fā)性硅酮；礦物油，諸如液體石蠟、軟石蠟或角鯊 烷；纖維素衍生物，諸如曱基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲 基纖維素鈉或鞋丙基甲基纖維素鈉；低碳烷醇，例如乙醇或異丙醇；低碳 芳烷醇(aralkanols );低碳聚烷撐二醇或低碳烷撐二醇，例如聚乙二醇、 聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，諸如棕櫚酸 異丙酯、肉豆蔻酸異丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；瓊脂；角叉菜聚 糖；黃蓍膠或阿拉伯膠和石油凝膠。通常，載體或多種載體將是組合物重 量的1%至99.9%。最優(yōu)選地，稀釋劑是鹽水。
對(duì)于作為可注射溶液或懸浮液的施用，無毒的腸胃外接受的稀釋劑或 載體可以包括林格氏溶液、中鏈甘油三酯(MCT)、等滲鹽水、磷酸鹽緩沖 鹽水、乙醇和1,2丙二醇。
用于經(jīng)口應(yīng)用的一些合適載體、稀釋劑、賦形劑和佐劑的實(shí)例包括花 生油、液體石蠟、羧甲基纖維素鈉、曱基纖維素、藻酸鈉、阿拉伯膠、黃 蓍膠、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、明膠和卵磷脂。另外，這些口服 制劑可以含有合適的增香劑和著色劑。當(dāng)以月交嚢形式使用時(shí)，膠嚢用化合物包衣，諸如延遲崩解的單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
佐劑通常包括軟化劑、乳化劑、增稠劑、防腐劑、殺菌劑和緩沖劑。
口服給藥的固體形式可以含有在人和獸醫(yī)制藥實(shí)踐中可接受的粘合 劑、增甜劑、崩解劑、稀釋劑、調(diào)味料、包衣劑、防腐劑、潤(rùn)滑劑和/或 時(shí)間延遲劑。合適的粘合劑包括阿拉伯膠、明膠、玉米淀粉、黃蓍膠、藻 酸鈉、羧曱基纖維素或聚乙二醇。合適的增甜劑包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、 阿司帕坦或糖精。合適的崩解劑包括玉米淀粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯 烷酮、瓜爾膠、黃原膠、膨潤(rùn)土、藻酸或瓊脂。合適的稀釋劑包括乳糖、 山梨醇、甘露醇、葡萄糖、高嶺土、纖維素、碳酸鈣、硅酸鈣或磷酸二鈣。 合適的增香劑包括薄荷油、冬青油、櫻桃、橙子或樹莓調(diào)味料。合適的包 衣劑包括丙烯酸和/或曱基丙烯酸和/或它們的酯的聚合物或共聚物、蠟、 脂肪醇、玉米醇溶蛋白、蟲膠或谷蛋白。
合適的防腐劑包括苯曱酸鈉、維生素E、 (X-生育酚、抗壞血酸、羥苯甲 酸甲酯、羥苯甲酸丙酯或亞硫酸氫鈉。合適的潤(rùn)滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂 酸、油酸鈉、氯化鈉或滑石。
除上迷物質(zhì)之外，口服給藥的液體形式可以含有液體載體。合適的液
體載體包括水；油，諸如橄欖油、花生油、芝麻油、葵花籽油、紅花油、
花生油、椰子油、液體石蠟、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、 異丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或它們的混合物。
用于口服給藥的懸浮液可以進(jìn)一步包含分散劑和/或懸浮劑。合適的懸 浮劑包括羧曱基纖維素鈉、曱基纖維素、羥丙基曱基纖維素、聚乙烯吡咯
烷酮、藻酸鈉或乙酰醇(acetyl alcohol )。合適的分散劑包括卵磷脂、脂肪 酸如硬脂酸的聚氧乙烯酯、聚氧乙烯山梨糖醇的單油酸酯或二油酸酯或硬 脂酸酯或月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐的單油酸酯或二油酸酯或硬脂酸 酯或月桂酸酯等。
用于口服給藥的乳劑可以進(jìn)一步包含一種或多種乳化劑。合適的乳化 劑包括上面所示例的分散劑或天然膠，諸如瓜爾膠、阿拉伯膠、或黃蓍膠。
16制備可腸胃外施用的組合物的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見
的，并且更詳纟田i也4葛述在例"V Remington的Pharmaceutical Science, 15th ed" Mack Publishing Company, Easton, Pa.中，其因此通過參考并入本文。
所述組合物可以引入任何合適的表面活性劑，諸如陰離子、陽離子或 非離子表面活性劑，如脫水山梨醇酯或它們的聚氧乙烯衍生物。也可以包 括懸浮劑諸如天然膠、纖維素衍生物或無機(jī)材料諸如硅酸鹽質(zhì)二氧化硅 (silicaceous silicas )， 以及其j也成分^口羊毛月旨。
一種或多種免疫增強(qiáng)劑可以被用作免疫增強(qiáng)組合物制備中的活性物。 此類制備利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法。典型地，此類組合物被制 備作為以液體溶液或懸浮液的注射劑，；也可以制備固體形式，其適合在 注射之前溶解或懸浮在液體中。制劑也可以是乳化的?；钚悦庖咴鰪?qiáng)成分 經(jīng)常與賦形劑混合，該賦形劑是藥學(xué)上可接受的并且與活性成分相容。
給藥途徑
根據(jù)本發(fā)明的方法，疫苗和組合物可以通過任何合適的途徑施用，或 者全身、區(qū)域性或局部施用。在任何給定環(huán)境中所使用的任何特定給藥途 徑將取決于多種因素，其包括被治療的疾病的性質(zhì)、疾病的嚴(yán)重度和程度、 被輸送的具體化合物所需的劑量以及期望疫苗或組合物的潛在副作用。
例如，在要求適當(dāng)濃度的期望疫苗或組合物被直接輸送至被治療部位 的情況下，給藥可以是局部的而非全身性的。局部給藥提供向所需部位輸 送非常高濃度的期望疫苗或組合物的能力，并因此適合實(shí)現(xiàn)期望的治療或 預(yù)防效果，同時(shí)避免身體的其他器官暴露于疫苗或組合物并因此潛在降低 副作用。
舉例來說，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的給藥可以通過任何標(biāo)準(zhǔn)途徑來實(shí)現(xiàn)， 其包括腔內(nèi)、膀胱內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、局部或經(jīng)口。腔內(nèi) 給藥可以是腹膜內(nèi)的或胸膜內(nèi)的。
如果期望，含有免疫增強(qiáng)劑的適于持續(xù)釋放或間歇釋放的器件或組合 物實(shí)際上可以被植入體內(nèi)或者被局部施用于身體，以將此類物質(zhì)緩慢釋放 到身體中。表達(dá)載體或宿主細(xì)胞的施用可以包括通過直接口服、全身注射的輸送，或者輸送至選擇的組織(一種或多種)或細(xì)胞，或者間接通過輸送至從受治療者或相容供體分離的細(xì)胞而進(jìn)行的輸送。
關(guān)于基于核酸的組合物，此類組合物所有的輸送方式被本發(fā)明考慮在內(nèi)。這些組合物向動(dòng)物細(xì)胞或組織的輸送可以通過例如微粒轟擊、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(例如，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑或脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺)、電穿孔術(shù)、磷酸鈣或DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染來促進(jìn)。在可選的實(shí)施方式中，合成構(gòu)建物可以
以"棵露DNA"組合物的形式^1用作治療或預(yù)防組合物，這在本領(lǐng)域是已知的。合適的輸送方法的討論可以發(fā)現(xiàn)于CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY (Eds. Ausubel等；John Wiley & Sons Inc., 1997版本)的第9章以及國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)站點(diǎn)DNAvaccine.com上。組合物可以通過皮內(nèi)(例如，使用panjetTM輸送)或肌內(nèi)途徑施用。
將合成多核苷酸引入靶細(xì)胞的步驟取決于意圖應(yīng)用和物種將是不同的，并且可以包括一種或多種非病毒和病毒載體、陽離子脂質(zhì)體、逆轉(zhuǎn)錄病毒和桿狀病毒，諸如，如在Mulligan, R.C.， (1993 Science 260 926-932)中所述，其因此通過參考并入。這些方法可以包括例如
A. 通過注射(Wolff等，1990, Science 247 1465-1468，其因此通過參考并入)、外科植入、滴注法或任何其他方法，局部施用合成多核苷酸。該方法也可以與通過注射、外科植入、滴注法或任何其他方法來局部施用應(yīng)答合成多核普酸編碼的蛋白質(zhì)的細(xì)胞結(jié)合使用，以便增加該治療的效力。該方法也可以與通過注射、外科植入、滴注法或任何其他方法來局部施用所述蛋白質(zhì)活性所需的另一因子或多個(gè)因子結(jié)合使用。
B. —般的全身輸送，其通過DNA (Calabretta等，1993, Cancer Treat. Rev.19 169-179，其因此通過參考并入)或RNA的單獨(dú)注射，或與脂質(zhì)體(Zhu等，1993, Science 261 209-212,其因此通過參考并入)、病毒衣殼或納米顆粒(Bertling等，1991, Biotech. Appl. Biochem. 13 390-405 ，其因此通過參考并入)或其他任何輸送介質(zhì)一起注射進(jìn)行。改善的靶向作用可以通過下迷方式實(shí)現(xiàn)通過連接合成的多核苦酸與靶向分子(所謂的"魔彈(magic bullet)"方法，其利用例如抗體)，或者通過注射、外科植入、或任何其他方法來局部施用所述合成多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)的活性所需的另一種因子或多種因子或應(yīng)答所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
C.通過任何方法注射或植入或輸送細(xì)胞，所述細(xì)胞已經(jīng)通過轉(zhuǎn)染(例
如，在磷酸4丐存在下Chen等，1987, Mole. Cell Biochem. 7 2745-2752，或者在陽離子脂質(zhì)和多胺存在下Rose等，1991, BioTech. 10 520-525,該文章通過參考并入本文)、感染、注射、電穿孔(Shigekawa等，1988, BioTech.6 742-751，其通過參考并入本文)或任何其他方式進(jìn)行體外修飾，以便增強(qiáng)所述合成多核苷酸在這些細(xì)胞中的表達(dá)。該修飾可以通過下述各項(xiàng)介導(dǎo)質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、病毒(諸如腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒；Mulligan, 1993,Science 260 926-932; Miller, 1992, Nature 357 455-460; Salmons等，1993,Hum. Gen. Ther. 4 129-141，該文章通過參考并入本文)或其他載體，或者其他修飾劑，諸如脂質(zhì)體(Zhu等，1993, Science 261 209-212，其通過參考并入本文)，病毒核殼或納米粒子(Bertling等，1991, Biotech. Appl. Biochem.13 390-405，其通過參考并入本文)，或者任何其他修飾介體。細(xì)胞作為基因或基因產(chǎn)物的輸送載體的應(yīng)用已經(jīng)由Barr等，1991, Science 2541507-1512和Dhawan等，1991, Science 254 1509-1512予以描述，這些文章通過參考并入本文。所處理的細(xì)胞可以與任何養(yǎng)分、生長(zhǎng)因子、基質(zhì)或者將會(huì)促進(jìn)它們?cè)谥委熓苤委熣咧写婊畹钠渌镔|(zhì)結(jié)合輸送。
組合物也可以以脂質(zhì)體的形式輸送。脂質(zhì)體通常來源于磷脂類或其他脂質(zhì)物質(zhì)，并且通過分散在水介質(zhì)中的單層或多層水合液晶形成?？梢允褂萌魏螣o毒的、生理學(xué)上可接受以及可代謝的、能夠形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)。脂質(zhì)體形式的組合物可以含有穩(wěn)定劑、防腐劑、賦形劑等。優(yōu)選的脂質(zhì)是天然及合成的磷脂類以及磷脂酰膽堿(卵磷脂)。形成脂質(zhì)體的方法在本領(lǐng)域是已知的，關(guān)于這方面，具體參考Prescott, Ed., Methods in Cell Biology,Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33 ，其內(nèi)容通過參考并入本文。
劑量
對(duì)于任何具體受治療者，所施用化合物的有效劑量水平將取決于很多因素，包括被治療疾病的類型以及疾病的階段；所使用的化合物的活性；所使用的組合物；受治療者的年齡、體重、 一般健康、性別和飲食；給藥時(shí)間；給藥途徑；化合物的螯合速率；治療的持續(xù)時(shí)間；與治療結(jié)合或同時(shí)使用的藥物，以及本領(lǐng)域已知的其他相關(guān)因素。
的劑量。這些最通常將在個(gè)案基礎(chǔ)上確定。
就重量而言，對(duì)患者施用的治療有效的組合物劑量預(yù)期在大約0.01mg至約150mg/kg體重/24小時(shí)的范圍內(nèi)；典型為大約O.lmg至約150mg/kg體重/24小時(shí)的范圍內(nèi)；大約0.lmg至約100mg/kg體重/24小時(shí)的范圍內(nèi)；大約0.5mg至約100mg/kg體重/24小時(shí)的范圍內(nèi)；或者大約l.Omg至約100mg/kg體重/24小時(shí)的范圍內(nèi)；更典型地，有效劑量預(yù)期在大約5mg至約50mg/kg體重/24小時(shí)的范圍內(nèi)。
可選地，有效劑量可以達(dá)到大約5000mg/m2。 一般而言，有效劑量預(yù)期在大約IO至約5000mg/n^的范圍內(nèi)，典型在大約10至約2500mg/m2、大約25至約2000mg/m2、大約50至約1500mg/m2、大約50至約1000mg/m2、或大約75至約600mg/m2的范圍內(nèi)。
此外，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見的是，最佳的單劑量的數(shù)量以及間隔將由被治療的病癥的性質(zhì)和程度、給藥的形式、途徑和位點(diǎn)以及被治療的具體個(gè)體的性質(zhì)確定。此外，這些最佳條件可以通過常規(guī)技術(shù)來確定。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員同樣顯而易見的是，最佳療程，諸如每單位時(shí)間所
過程來確定。治療方法
同樣被本發(fā)明考慮在內(nèi)的是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法，其中所述方法包括向受治療者施用有效量的免疫增強(qiáng)劑，所述免疫增強(qiáng)劑選自如在本文所述的疫苗、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。
另外，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防與禽流感病毒有關(guān)的疾病的方法，其中所述方法包括向受治療者施用有效量的免疫增強(qiáng)劑，所述免疫增強(qiáng)劑
20選自如在本文所述的疫苗、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。免疫接種功效評(píng)估
可以利用任何合適的技術(shù)來評(píng)估按照本發(fā)明方法進(jìn)行的免疫接種的效
力。例如，可以利用受激脾細(xì)胞或外周血單核細(xì)胞(PBMC)對(duì)肽包被的或重組病毒感染的細(xì)胞用51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞進(jìn)行CTL裂解試驗(yàn)。此類試驗(yàn)可以利用例如靈長(zhǎng)類動(dòng)物、小鼠或人細(xì)胞來進(jìn)行(Allen等，2000, J. Immunol.164(9): 4968-4978以及下文的Woodberry等)。可選地，免疫接種的功效可以利用一種或多種技術(shù)來監(jiān)測(cè)，所述技術(shù)包括但不限于新鮮和受激PBMCs的HLA I類四聚體染色(例如參見前述Allen等)、增殖試驗(yàn)(前述Allen等)、ElispotTM試驗(yàn)以及胞內(nèi)INF-y染色(前述Allen等)、線性B細(xì)胞應(yīng)答的ELISA試驗(yàn)，以及表達(dá)如本文所述的抗原肽的細(xì)胞樣品的蛋白質(zhì)印跡。
試劑盒
本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防受治療者疾病的試劑盒，其中所述疾病與禽流感病毒有關(guān)，并且其中所述試劑盒包括如本文所述的疫苗、表達(dá)載體、宿主細(xì)力包或組合物。
典型地，用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒含有實(shí)施該方法的所有必需試劑。典型地，本發(fā)明的試劑盒將包含一種或多種容器，其含有例如洗滌試劑和/或能夠?qū)⒔Y(jié)合組分從多肽或其片段中釋放的其他試劑。
在本發(fā)明的上下文中，具有隔室的試劑盒包括試劑被包含在單獨(dú)容器中的任何試劑盒，并且可以包括小的玻璃容器、塑料容器或者塑料條或紙條。此類容器可以允許試劑從一個(gè)隔室有效轉(zhuǎn)移至另一隔室，同時(shí)避免樣品和試劑的交叉感染，以及允許每個(gè)容器的物質(zhì)或溶液從一個(gè)隔室以定量的方式加至另一隔室。此類試劑盒也可以包括容納測(cè)試樣品的容器、含有試驗(yàn)中所用的聚合物的容器以及含有洗滌試劑的容器(諸如磷酸鹽緩沖鹽水、三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液等)。
典型地，本發(fā)明的試劑盒也將包括使用該試劑盒組分以實(shí)施適當(dāng)方法的說明書。
本發(fā)明現(xiàn)在將通過參考下面的實(shí)施例進(jìn)行描述，所述實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)以任何方式解釋為限定本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例
實(shí)施例1:重組桿狀病毒HA-表達(dá)盒的構(gòu)建
H5N1流感病毒的血凝素(HA)是負(fù)責(zé)產(chǎn)生中和抗體的兩種主要膜病毒 糖蛋白之一 (Bosch等，1979, Kawaoka and Webster 1988)。為確定產(chǎn)生對(duì)抗 H5N1 (A/Goose/Guangdong/3/97/H5Nl)病毒的桿狀病毒基疫苗的潛力，本 發(fā)明人構(gòu)建了兩種重組桿狀病毒表達(dá)載體，每種含有HA-表達(dá)盒。第一種 桿狀病毒表達(dá)載體用在白斑綜合癥病毒(WSSV) iel啟動(dòng)子的控制下與HA-表達(dá)盒一起產(chǎn)生，被稱為vAc-HA(圖1A)。第二種桿狀病毒表達(dá)載體用在 桿狀病毒多角體蛋白啟動(dòng)子的控制下與HA-表達(dá)盒和附加的水泡性口膜炎 病毒糖蛋白(VSVG)-表達(dá)盒一起產(chǎn)生，被稱為vAc-G-HA(圖1A)。
為了產(chǎn)生重組桿狀病毒載體，根據(jù)Bac-To-Bac系統(tǒng)的方案(Invitrogen)， AcMNPV多角體蛋白啟動(dòng)子控制的VSV G表達(dá)盒或WSSV iel啟動(dòng)子控制 的HA表達(dá)盒被插入穿梭載體pFastBacl中，并被整合到DH IOB ACtm內(nèi) 的桿狀病毒基因組中。對(duì)照病毒vAc-桿粒也通過將空pFastBacl載體整合 到桿粒基因組中而被構(gòu)建(圖1A)。
期望的VSVG或HA表達(dá)盒利用Bac-To-Bac系統(tǒng)通過位點(diǎn)專一轉(zhuǎn)座被 插入多角體蛋白基因座中。帶有(3-球蛋白終止子的VSV G cDNA然后利用 引物5'- CGCGGATCCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAG-3' (SEQ ID NO: 1) 和5'- CCCAAGCTTCCAACACACTATTGCAATGAA-B' (SEQ ID NO: 2)從 pVSV-G進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。VSV G cDNA被放置在多角 體蛋白啟動(dòng)子的下游，多角體蛋白啟動(dòng)子利用引物 5'國(guó)TCCCCCGGGGGATGGTTGGCTACGTATACTCCG-3' (SEQ ID NO: 3)和 5'誦CGCGGATCCGGTTTCGGACCGAGATCCGC-3' (SEQ ID NO: 4)從桿粒 基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。HA cDNA利用引物組
5'誦ATAAGAATGCGGCCGCTATGGAGAAAACAGTGCTTCTTCTTG-3' (SEQ ID NO: 5)和
225'-CCGCTCGAGCGGTTAAATGCAAATTCTGCATTGTAACGATC-3 ' (SEQ ID NO: 6)通過RT-PCR從H5N1病毒的基因組擴(kuò)增。HA cDNA然后被放置 在pFastBacl載體中的SV40終止子的上游以及iel啟動(dòng)子的下游，iel啟 動(dòng)子利用引物組5'- TCCCTACGTATCAATTTTATGTGGCTAATGGAGA-3' (SEQIDNO: 7)和5'-
ACGCGTCGACCTTGAGTGGAGAGAGAGCTAGTTATAA-3' (SEQ ID NO: 8)從WSSV基因組(Lu等，2005)擴(kuò)增。
利用vAc-G-HA感染昆蟲Sf9細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞-細(xì)胞融合(圖1B)。 表型是通過多角體蛋白啟動(dòng)子引起的具有膜融合活性的VSV G蛋白質(zhì)的 非常高的表達(dá)水平導(dǎo)致的。
通過產(chǎn)生感染病毒生產(chǎn)的一步生長(zhǎng)曲線也檢驗(yàn)了 Sf9細(xì)胞中的毒粒生 產(chǎn)的動(dòng)力學(xué)(圖1C)。這些病毒生長(zhǎng)曲線的時(shí)間動(dòng)力學(xué)(Lu等，2003)是類似 的，盡管vAc-G-HA的峰值毒粒生產(chǎn)落在vAc-HA和對(duì)照vAc-桿粒之后。 vAc-G-HA的滴度在120 h p丄增加至109 PFU (噬斑形成單位)/ml，而 vAc-HA和vAc-桿粒在96 h p.i.產(chǎn)生同樣的滴度(圖1C)。傳染vAc-G-HA 的Sf9細(xì)胞中大量合胞體形成可能會(huì)延遲后期感染中毒粒的釋放。
實(shí)施例2:血凝素的膜展示
本發(fā)明人通過超離心從受染昆蟲細(xì)胞的上清液中純化了 vAc-HA、 vAc-G-HA和vAc-桿粒。為研究HA是否纟支展示在vAc-HA和vAc-G-HA 的膜上，將純化的毒粒用1% Triton X-100處理15分鐘，以破裂病毒膜結(jié) 構(gòu)，然后通過超離心收集病毒核衣殼。為產(chǎn)生抗HA蛋白質(zhì)的抗體，從桿 狀病毒感染的SF9細(xì)胞中表達(dá)并純化His6-標(biāo)記Hal,其中在利用His6-標(biāo)記Hal作為抗原的豚鼠中出現(xiàn)抗HA蛋白質(zhì)的多克隆抗體。蛋白質(zhì)印跡 分析顯示，在用Triton X-100處理之前在純化的毒粒中檢測(cè)到HA，在已收 集的僅由病毒核衣殼組成的沉淀中未^r測(cè)到(圖2 A)。
發(fā)現(xiàn)，在受染SF9細(xì)胞以及在純化的vAc-G-HA顆粒中，HA^^皮部分切 割為Hal和HA2，其類似于純化H5N1毒粒的情況(圖2A)。這些數(shù)據(jù)表明， 桿狀病毒載體可以展示類似HA的病毒糖蛋白，并對(duì)其天然產(chǎn)物具有類似 的翻譯后修飾。利用抗-VSVG單克隆抗體的蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)也顯示，VSVG在純化的vAc-G-HA毒粒中是膜締合的結(jié)構(gòu)成分(圖2B)。
為確定桿狀病毒表面展示的HA蛋白質(zhì)是否維持真正的生物性質(zhì)，測(cè)試 vAc-HA和vAc-G-HA的純化毒粒的血凝活性(圖2C)。利用標(biāo)準(zhǔn)血凝試驗(yàn) (Wood等，1985)，各25 pl的101Q PFU/ml滴度的vAc-HA或vAc-G-HA產(chǎn) 生大約28的血凝滴度。結(jié)果表明，VSVG與HA的聯(lián)合展示將不會(huì)顯著降 低HA在桿狀病毒膜上的展示效率。
實(shí)施例3: vAc-G-HA轉(zhuǎn)導(dǎo)能力
因?yàn)閂S V G提供優(yōu)于vAc-HA的vAc-G-HA轉(zhuǎn)導(dǎo)優(yōu)勢(shì)，因此實(shí)施體內(nèi) 接種試驗(yàn)，以評(píng)估vAc-G-HA的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。在細(xì)胞系(1)犬MDCK和(2)雞 Df-I細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗(yàn)(Hsu等，2004)。圖3A顯示，vAc-G-HA有效地 轉(zhuǎn)導(dǎo)這些細(xì)胞系，如通過陽性焚光細(xì)胞所示。該表達(dá)進(jìn)一步通過用豚鼠中 出現(xiàn)的抗HA1血清的蛋白質(zhì)印跡分析總細(xì)胞提取物證實(shí)，如在圖3B中所 示。
為進(jìn)一步監(jiān)測(cè)在vAc-G-HA表面上展示的HA分子的數(shù)量，基于豚鼠抗 -HA1多克隆抗血清和HA1單克隆抗體，開發(fā)了抗原捕獲ELISA，如先前 所報(bào)告(He等，2005)。
從桿狀病毒感染的SF9細(xì)胞表達(dá)和純化His6-標(biāo)記的HA1。為了利用 Bac-To-Bac系統(tǒng)的pFast Hta載體構(gòu)建表達(dá)HA1的桿狀病毒，HA1編碼 序列利用引物組
5'-CGCGGATCCGATGGAGAAAACAGTGCTTCTTCTTTG-3' (SEQ ID NO: 9)和5'-CGGGGTACCCTCTCTTTGAGGGGTATTTCT-3' (SEQ ID NO: 10) 從上述HAcDNA擴(kuò)增。對(duì)于蛋白質(zhì)表達(dá)，Sf9細(xì)胞用MOI為5的重組病 毒感染并在72 h p.i.收獲。His6-標(biāo)記HA1蛋白質(zhì)從總細(xì)胞提取物的純化利 用載有N產(chǎn)的樹脂漿(resin slurry )進(jìn)行。
通過用來自豚鼠的純化IgG涂敷微量滴定板來設(shè)計(jì)抗原捕獲ELISA。 結(jié)合抗原然后用含有HAl-特異性單克隆抗體的雜交瘤上清液來檢測(cè)。使 用10-倍連續(xù)稀釋的HA1蛋白質(zhì)來建立標(biāo)準(zhǔn)量化曲線。vAc-G-HA樣品中 的HA1的量以標(biāo)準(zhǔn)曲線中的點(diǎn)值來確定，其表示在490 nm下具有相同的吸光度(圖3Q。根據(jù)該曲線，發(fā)現(xiàn)101QPFU/ml滴度下各25 pl vAc-G-HA含 有大約50ngHAl。這些發(fā)現(xiàn)表明，HA蛋白質(zhì)維持真正的血凝活性并且被 有效地展示在桿狀病毒的表面上。
實(shí)施例4: vAc-G-HA的免疫原性
然后通過用純化的vAc-G-HA毒粒肌內(nèi)免疫接種6-8周BALB/c小鼠， 研究vAc-G-HA的免疫原性。在用5xl(^PFU的vAc-G-HA顆粒接種之后 4周時(shí)，用相同數(shù)量的毒粒加強(qiáng)免疫小鼠。 一周后，經(jīng)眼后血管叢 (retroorbital plexus )對(duì)小鼠釆血，并通過ELISA和血凝抑制反應(yīng)(HI)試驗(yàn) (Wood等，1985)單獨(dú)測(cè)試來自各動(dòng)物的血清中抗HA的抗體。
通過用每孔60 ng純化的His6-標(biāo)記HA1蛋白質(zhì)涂敷96孔微量培養(yǎng)板建 立ELISA測(cè)試，以監(jiān)測(cè)HA-特異性抗體水平。如在圖4A中所示，所有5 個(gè)免疫處理的小鼠產(chǎn)生了顯著的抗體應(yīng)答，如通過ELISA所檢測(cè)到的， 在ELISA中，純化HA1蛋白質(zhì)被涂敷作為抗原。用vAc-桿粒免疫處理的 兩個(gè)對(duì)照小鼠僅展示背景血清滴度。
vAc-G-HA在所有5只免疫處理小鼠中誘導(dǎo)了血清HI抗體應(yīng)答，其滴 度在23至25范圍內(nèi)(圖4B)。 HI抗體應(yīng)答與用活H5流感病毒鼻內(nèi)接種的 那些小鼠相當(dāng)，其顯示24至27范圍內(nèi)的滴度，如由Takada等(1999)所報(bào) 告。來自接種vAc-G-HA的小鼠的專一的及顯著的抗體應(yīng)答表明，展示在 病毒表面上或者通過病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)的HA分子維持其抗原性。
為進(jìn)一步表征vAc-G-HA和vAc-HA的免疫原性，7周BALB/c小鼠(每 組5只小鼠)利用純化毒粒進(jìn)行肌內(nèi)免疫處理。使用從MDCK細(xì)胞擴(kuò)增的 滅活H5N1/PR8疫苗抹作為陽性對(duì)照，vAc-桿粒接種的小鼠作為陰性對(duì) 照。在用256 HA單位的純化桿狀病毒顆?；驕缁頗5N1/PR8病毒肌內(nèi)接 種之后4周時(shí)，用相同數(shù)量的毒粒對(duì)小鼠加強(qiáng)免疫。 一周后，經(jīng)眼后血管 叢(retro-orbital plexus )對(duì)小鼠采血，并通過He等，2005所述的ELISA以 及通過Wood等，1985所述的血凝抑制反應(yīng)(HI)試驗(yàn)，單獨(dú)測(cè)試來自每組5 只小鼠的混合血清中的抗HA抗體。通過用每孔60 ng純化His6-標(biāo)記HA1 蛋白質(zhì)涂敷96孔微量培養(yǎng)板建立ELISA測(cè)試，以監(jiān)測(cè)HA-特異性抗體水 平。
25如在圖5A中所示，用vAc-HA或vAc-G-HA免疫處理的小鼠發(fā)展了顯 著的抗體應(yīng)答，其通過ELISA檢測(cè)，在ELISA中，純化的HA1蛋白質(zhì)被 涂敷作為抗原。用vAc-桿粒免疫處理的小鼠僅展示背景血清滴度。 vAc-G-HA和vAc-HA在免疫處理小鼠中都誘導(dǎo)了血清HI抗體應(yīng)答，其滴 度為26 (圖5B)。桿狀病毒載體的HI滴度與用疫苗林H5N1/PR8接種的那 些小鼠具有的28的平均滴度相當(dāng)(圖5B)。
在ELISA試驗(yàn)中，由vAc-G-HA誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答比vAc-HA誘導(dǎo)的抗 體應(yīng)答高大約18%。令人驚訝的是，H5N1/PR8疫苗才朱誘導(dǎo)更高水平的抗 體應(yīng)答，如通過ELISA所示。因此，謙導(dǎo)的抗血清顯示比展示HA的桿狀 病毒高四倍的HI活性(圖5A和5B)。來自桿狀病毒接種小鼠的專一性及顯 著的抗體應(yīng)答表明，展示在病毒表面上或者通過病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)的HA分子 維持其真正的抗原性。
然后通過展示HA的桿狀病毒測(cè)試誘導(dǎo)抗體的體外中和能力。如先前由 Rowe等，1999所才艮告的，進(jìn)行基于H5N1/PR8和MDCK細(xì)胞系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn) 微量中和試驗(yàn)。由兩種展示HA的桿狀病毒誘導(dǎo)的血清顯示80的重大中和 滴度，而H5N1/PR8誘導(dǎo)血清給出160的更高滴度(圖5B)。
參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1. 用于治療或預(yù)防受治療者疾病的疫苗，其中所述疾病與禽流感病毒有關(guān)，并且其中所述疫苗包括含有編碼血凝素肽的核酸的表達(dá)載體，使得在使用時(shí)所述血凝素肽通過所述表達(dá)載體在所述受治療者中表達(dá)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述表達(dá)載體包括桿狀病毒表達(dá) 載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的疫苗，其中所述表達(dá)載體進(jìn)一 步包括與編碼抗原肽的核酸可操作連接的、來自白斑綜合癥病毒的啟 動(dòng)子。
4. 用于治療或預(yù)防受治療者疾病的疫苗，其中所述疾病與禽流感病毒 相關(guān)，并且其中所述疫苗包括表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含(a) 編碼血凝素肽的核酸；和(b) 來自白斑綜合癥病毒的ze/啟動(dòng)子，其與編碼血凝素肽的所述核酸可 操作連接，使得在使用時(shí)，所述血凝素肽通過所述受治療者中的所述表達(dá)載體表達(dá)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的疫苗，其中所述受治療者選自人、 禽或豬。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的疫苗，其中所述禽流感病毒是禽 流感病毒的H5N1亞型。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的疫苗，其中所述血凝素肽包括來 源于禽流感病毒的H5N1亞型的氣基酸序列。
8. 表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體包括(a) 編碼抗原肽的核酸；和(b) 與編碼抗原肽的核酸可操作連接的、來自白斑綜合癥病毒的啟動(dòng)子，其中所述抗原肽包括血凝素肽，所述血凝素肽包含來源于禽流感病毒的H5N1亞型的氨基酸序列。
9. 權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體在治療或預(yù)防受治療者疾病中的用途， 其中所述疾病與禽流感病毒相關(guān)，使得在應(yīng)用時(shí)，所迷抗原肽通過所述受 治療者中的所述表達(dá)載體表達(dá)。
10. 包括權(quán)利要求8或權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
11. 組合物，其包括選自由根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的疫苗、根 據(jù)權(quán)利要求8或權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體或者根據(jù)權(quán)利要求10所述的 宿主細(xì)胞組成的組的免疫增強(qiáng)劑，以及藥學(xué)上可接受的栽體、稀釋劑或賦 形劑。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其進(jìn)一步包括佐劑。
13. 用于治療或預(yù)防受治療者疾病的疫苗，其包括根據(jù)權(quán)利要求8或權(quán) 利要求9所述的表達(dá)載體、根據(jù)權(quán)利要求10所述的宿主細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利 要求ll所述的組合物，其中所述疾病與禽流感病毒有關(guān)。
14. 用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法，其中所述方法包括向受治療者施用有效 量的免疫增強(qiáng)劑，所述免疫增強(qiáng)劑選自根據(jù)權(quán)利要求1至7或13任一項(xiàng) 所述的疫苗、根據(jù)權(quán)利要求8或權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體、根據(jù)權(quán)利要 求10所述的宿主細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物組成的組。
15. 治療或預(yù)防與禽流感病毒有關(guān)的疾病的方法，其中所述方法包括向 受治療者施用有效量的免疫增強(qiáng)劑，所述免疫增強(qiáng)劑選自根據(jù)權(quán)利要求1 至7或13任一項(xiàng)所迷的疫苗、根據(jù)權(quán)利要求8或權(quán)利要求9所述的表達(dá) 載體、根據(jù)權(quán)利要求10所述的宿主細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物 組成的組。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1至7或13任一項(xiàng)所述的疫苗、根據(jù)權(quán)利要求8或 權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體、根據(jù)權(quán)利要求10所述的宿主細(xì)胞或根據(jù)權(quán) 利要求12所迷的組合物，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的用途。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1至7或13任一項(xiàng)所述的疫苗、根據(jù)權(quán)利要求8或 權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體、根據(jù)權(quán)利要求10所述的宿主細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，在制造用于治療與禽流感病毒有關(guān)的疾病的藥物的用途。
18. 用于治療或預(yù)防受治療者疾病的試劑盒，其中所述疾病與禽流感病毒有關(guān)，并且其中所述試劑盒包括根據(jù)權(quán)利要求1至7或13任一項(xiàng)所述的疫苗、根據(jù)權(quán)利要求8或權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體、根據(jù)權(quán)利要求10所述的宿主細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物。
19. 用于呈遞或展示多肽的方法，其中所述方法包括(a) 將編碼所述多肽的核酸插入桿狀病毒表達(dá)載體中，其中所述桿狀病毒表達(dá)載體包括來自白斑綜合癥病毒的？e/啟動(dòng)子；(b) 用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至少一種宿主細(xì)胞；和(c) 從所述表達(dá)載體中表達(dá)所述多肽，其中所述多肽被呈遞或展示在桿狀病毒的表面膜上。
20. 用于呈遞或展示多肽的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)包括(a) 編碼所述多肽的核酸，其被插入桿狀病毒表達(dá)載體中，其中所述桿狀病毒表達(dá)載體包括來自白斑綜合癥病毒的ze/啟動(dòng)子；(b) 用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至少一種宿主細(xì)胞的方法；和(c) 用于從所述表達(dá)載體表達(dá)所述多肽的方法，其中所述多肽被呈遞或展示在桿狀病毒的表面膜上。
全文摘要
用于治療或預(yù)防受治療者疾病的疫苗，其中所述疾病與禽流感病毒有關(guān)，并且其中所述疫苗包括含有編碼血凝素肽的核酸的表達(dá)載體，使得在使用時(shí)所述血凝素肽通過所述表達(dá)載體在所述受治療者中表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/866GK101460628SQ200680054933
公開日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2006年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月5日
發(fā)明者吉米·光, 魯麗群 申請(qǐng)人:淡馬錫生命科學(xué)研究院有限公司