專利名稱：靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)的制作方法
關(guān)于聯(lián)邦政府資助研究的聲明待定。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及培養(yǎng)靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物的方法以及與其一起使用的培養(yǎng)基。
已經(jīng)從著床前胚胎獲得了靈長(zhǎng)類(例如，猴和人)多能胚胎干細(xì)胞。參見，例如，美國(guó)專利5,843,780和J.Thomson等，282 Science 1145-1147(1998)。這些公開的內(nèi)容以及這里提及的所有其它公開通過引入納入本文，這就如同已經(jīng)在文中全文列出。盡管延長(zhǎng)了培養(yǎng)時(shí)間，但這些細(xì)胞穩(wěn)定保持形成所有三個(gè)胚層的高級(jí)衍生物的發(fā)育潛能。
靈長(zhǎng)類(尤其是人類)ES細(xì)胞系被廣泛用于人類發(fā)育生物學(xué)、藥物發(fā)現(xiàn)、藥物測(cè)試和移植藥物。例如，目前對(duì)著床后人胚胎的了解主要是基于數(shù)量有限的靜態(tài)組織切片。由于倫理原因，實(shí)質(zhì)上還未研究控制早期人胚胎發(fā)育決定的根本機(jī)制。
盡管實(shí)驗(yàn)哺乳動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)主要依賴于小鼠，且盡管有許多控制發(fā)育的基本機(jī)制在小鼠和人之間是保守的，但小鼠和人的早期發(fā)育之間有顯著區(qū)別。因此需要靈長(zhǎng)類/人ES細(xì)胞以深入了解它們的分化和功能。
靈長(zhǎng)類ES細(xì)胞的分化衍生物可用來鑒定新藥的基因靶點(diǎn)、用來測(cè)試新化合物的毒性或致畸性、以及用于移植以替代疾病部位的細(xì)胞群。通過移植ES細(xì)胞衍生細(xì)胞有可能治療的疾病包括帕金森病、心臟梗塞、青少年糖尿病和白血病。參見，例如，J.Rossant等，17 Nature Biotechnology 23-4(1999)和J.Gearhart，282 Science 1061-2(1998)。
長(zhǎng)期增殖能力、長(zhǎng)期培養(yǎng)后的發(fā)育潛能以及核型穩(wěn)定性是利用靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物的關(guān)鍵特征。這種細(xì)胞的培養(yǎng)物(尤其是在成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上的)通常補(bǔ)充有動(dòng)物血清(尤其是胎牛血清)以在這種培養(yǎng)期間進(jìn)行所需的增殖。
例如，在美國(guó)專利5,453,357、5,670,372和5,690,296中公開了各種培養(yǎng)條件，其中包括使用一類堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和動(dòng)物血清的一些條件。不幸的是，各批次血清的特性都有所不同，因此會(huì)影響培養(yǎng)物的特征。
WO 98/30679討論了用無血清補(bǔ)充物來代替動(dòng)物血清支持培養(yǎng)物中的某些胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)。該血清替代品中含有白蛋白或白蛋白替代物、一種或多種氨基酸、一種或多種維生素、一種或多種運(yùn)鐵蛋白或運(yùn)鐵蛋白替代物、一種或多種抗氧化劑、一種或多種胰島素或胰島素替代物、一種或多種膠原前體以及一種或多種痕量元素。注意，這種替代品中還可補(bǔ)充白血病抑制因子、青灰因子或睫狀節(jié)神經(jīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子。不幸的是，對(duì)于靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物(尤其是生長(zhǎng)在成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上的那些細(xì)胞)，這些培養(yǎng)基不令人滿意。
對(duì)于營(yíng)養(yǎng)血清培養(yǎng)基(例如，胎牛血清)，WO 99/20741討論了在培養(yǎng)靈長(zhǎng)類干細(xì)胞時(shí)使用各種生長(zhǎng)因子(如bFGF)的益處。然而其中未描述不含營(yíng)養(yǎng)血清的培養(yǎng)基。
美國(guó)專利5,405,772描述了造血細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。其中提到，在缺乏血清的培養(yǎng)基中使用成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子以用于該目的。然而其中未描述靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)條件。
首先用成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞層培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物，這種飼養(yǎng)細(xì)胞層能夠使人胚胎干細(xì)胞增殖同時(shí)保持未分化狀態(tài)。然后發(fā)現(xiàn)，使培養(yǎng)基接觸飼養(yǎng)細(xì)胞足以形成所謂的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基(conditioned medium)，這種培養(yǎng)基具有與直接使用飼養(yǎng)細(xì)胞相同的特性。不使用飼養(yǎng)細(xì)胞或調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞就不能保持未分化狀態(tài)。由于使用了飼養(yǎng)細(xì)胞，或者即便是使培養(yǎng)基接觸飼養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)物都有被不需要的物質(zhì)污染的風(fēng)險(xiǎn)，因此最好避免使用飼養(yǎng)細(xì)胞和調(diào)節(jié)培養(yǎng)基。未曾接觸過飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基在這里被稱為非調(diào)節(jié)培養(yǎng)基(unconditioned medium)。
因此可以看出，仍舊需要在不使用動(dòng)物血清時(shí)穩(wěn)定培養(yǎng)靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞的技術(shù)。
發(fā)明概述在本發(fā)明的一個(gè)方面提供了培養(yǎng)靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞的方法。一種方法是在基本不含哺乳動(dòng)物胎兒血清(也優(yōu)選基本不含任何動(dòng)物血清)并在含有不止是成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層來源的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)物中培養(yǎng)干細(xì)胞。在優(yōu)選的形式中，通過加入足量成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子就不再需要之前維持干細(xì)胞培養(yǎng)物所必需的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層。
成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子是哺乳動(dòng)物發(fā)育所必需的分子。目前有20多種已知的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子配體和5種上述配體的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體(以及它們的剪接變體)。通?？蓞⒁奃.Ornitz等，25 J.Biol.Chem.15292-7(1996)；美國(guó)專利5,453,357。預(yù)計(jì)這些因子在物種之間有微小變化，因此術(shù)語成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子不受物種限制。然而，我們優(yōu)選使用人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，更優(yōu)選由重組基因產(chǎn)生的人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。這種化合物不難從Gibco BRL-Life Technologies以及其它公司大量購得。
注意，出于本發(fā)明的目的，盡管已經(jīng)從血清分離出單獨(dú)的組分(例如，牛血清白蛋白)且隨后外源性提供這些組分，所述培養(yǎng)物仍可基本不含特定的血清。關(guān)鍵是，加入血清本身就增加了變數(shù)。然而，當(dāng)加入這種血清中的一種或多種良好定義的純化組分時(shí)則不會(huì)這樣。
優(yōu)選的，用這種方法培養(yǎng)的靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞是真ES細(xì)胞系的人胚胎干細(xì)胞，它們(i)能夠在體外以未分化狀態(tài)無限增殖；(ii)即便在長(zhǎng)期培養(yǎng)后也能夠分化成所有三個(gè)胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的衍生物；和(iii)在長(zhǎng)期培養(yǎng)中維持正常核型(整倍體)。因此這些細(xì)胞被稱為多能細(xì)胞。
這種培養(yǎng)能夠使胚胎干細(xì)胞在培養(yǎng)物中穩(wěn)定增殖1個(gè)月以上(優(yōu)選6個(gè)月以上；更優(yōu)選12個(gè)月以上)同時(shí)維持干細(xì)胞分化成內(nèi)胚層、中胚層和外胚層組織衍生物的潛能，同時(shí)維持干細(xì)胞的核型。
在本發(fā)明的另一方面，提供了另一種培養(yǎng)靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞的方法。一種方法是在基本不含哺乳動(dòng)物胎兒血清(也優(yōu)選基本不含任何動(dòng)物血清)并在含有能夠激活成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體的生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)物中培養(yǎng)干細(xì)胞，其中所述生長(zhǎng)因子的來源不止是成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層。雖然生長(zhǎng)因子優(yōu)選是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，但也可以是其它物質(zhì)，如設(shè)計(jì)用來激活成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的某些合成的小肽(例如，由重組DNA變體或突變體產(chǎn)生的)。通常可參見T.Yamaguchi等，152 Dev.Biol.75-88(1992)(信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體)。
在本發(fā)明的又一方面，提供了培養(yǎng)靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)。其中具有不止是成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層來源的人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。該培養(yǎng)系統(tǒng)基本不含動(dòng)物血清。
本發(fā)明的再一方面提供了用上述方法衍生的細(xì)胞系(優(yōu)選克隆細(xì)胞系)?！把苌摹币云鋸V義含義使用，包括直接和間接衍生的細(xì)胞系。
因此可以避免由于各批次動(dòng)物血清之間的差異而導(dǎo)致的變化。此外，還發(fā)現(xiàn)，在使用成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子時(shí)避免使用動(dòng)物血清能夠提高克隆率。
因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是提供靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞系的培養(yǎng)條件，該條件的可變性較低并能夠更加有效地克隆。通過研究說明書和權(quán)利要求書將了解本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述在以下一些實(shí)驗(yàn)中，發(fā)明人之一在這里使用本發(fā)明的方法和培養(yǎng)系統(tǒng)來培養(yǎng)人ES細(xì)胞系，而未在培養(yǎng)基中加入血清。在不含血清成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，兩個(gè)克隆衍生的人ES細(xì)胞系在克隆衍生后增殖8個(gè)月以上，并且維持了分化成所有三個(gè)胚層的高級(jí)衍生物的能力。
在下述另一實(shí)驗(yàn)中，現(xiàn)在已經(jīng)證實(shí)，即便在不含血清和飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，加入相對(duì)大量的人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)也有助于人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)和生長(zhǎng)。這使得可以培養(yǎng)從未接觸過動(dòng)物細(xì)胞或接觸過已經(jīng)培養(yǎng)過動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基的干細(xì)胞。這些干細(xì)胞培養(yǎng)條件(即，無飼養(yǎng)細(xì)胞、無調(diào)節(jié)培養(yǎng)基)在這里被稱為不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞的。已經(jīng)描述過的基于使用經(jīng)飼養(yǎng)細(xì)胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的現(xiàn)有培養(yǎng)條件被稱為不含飼養(yǎng)細(xì)胞的。然而，使用調(diào)節(jié)培養(yǎng)基未解決對(duì)使用飼養(yǎng)細(xì)胞的依賴性，仍舊必需用飼養(yǎng)細(xì)胞來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基。這里描述的技術(shù)能夠無限地且不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞地培養(yǎng)具有正常核型并維持未分化的人胚胎干細(xì)胞。
最初的衍生、培養(yǎng)和表征人ES細(xì)胞系H9的技術(shù)描述于J.Thomson等，282 Science1145-1147(1998)?？捎眠@種和其它細(xì)胞系進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)，但實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果與特定ES細(xì)胞系無關(guān)。
這里描述到加入成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)有助于培養(yǎng)和克隆人ES細(xì)胞。加入FGF在兩個(gè)方面具有重要意義。首先，加入中等水平(例如，4ng/ml)的FGF能夠在不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)未分化的人ES細(xì)胞。與較低水平的FGF相比，在該水平上干細(xì)胞的分化速率降低，但細(xì)胞最終將分化。其次，加入較高水平的FGF使得培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件變得不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞，因?yàn)闊o限維持培養(yǎng)物中的整倍體未分化人ES細(xì)胞的多能性根本不需要飼養(yǎng)細(xì)胞。
第一個(gè)現(xiàn)象被認(rèn)為是FGF與人ES細(xì)胞的FGF受體相互作用造成的。為避免使用血清，在培養(yǎng)時(shí)使用何種已知FGF變體并不非常重要。通常使用堿性FGF(或稱bFGF，也叫做FGF2)，但這只是因?yàn)閎FGF是FGF因子家族中容易購得的成員之一。已經(jīng)鑒定了20多種不同的FGF家族成員，它們被稱為FGF-1到FGF-27。雖然在這里用bFGF的量表示FGF濃度，但應(yīng)該理解這旨在量化FGF受體的刺激量，且對(duì)于FGF家族的其它成員可上調(diào)或下調(diào)FGF濃度。對(duì)bFGF而言，ES細(xì)胞培養(yǎng)基中的優(yōu)選FGF濃度約為0.1-1000ng/ml，超過約4ng/ml的濃度可有效避免在培養(yǎng)基中使用血清。
令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)對(duì)于FGF在人ES細(xì)胞培養(yǎng)基中的第二個(gè)作用，對(duì)FGF變體的選擇很關(guān)鍵。出于該目的，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)bFGF的濃度約為100ng/ml時(shí)，該條件足以避免對(duì)血清和飼養(yǎng)細(xì)胞的需要，使得培養(yǎng)不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞。出于該目的，發(fā)現(xiàn)FGF家族成員FGF2(bFGF)、FGF4、FGF9、FGF17和FGF18在每毫升培養(yǎng)物100納克時(shí)都足以使得人ES細(xì)胞的培養(yǎng)不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞。相反，發(fā)現(xiàn)FGF家族成員FGF1(酸性FGF)、FGF1β、FGF3、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF10、FGF16、FGF19和FGF20在100ng/ml時(shí)不足以支持不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)。我們認(rèn)為，使用這些形式的FGF得到的結(jié)果不是濃度造成的，且更高濃度的特定FGF也不能成功支持不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)，但目前還沒有數(shù)據(jù)證明。對(duì)FGF9而言，我們的數(shù)據(jù)說明，在該水平(100ng/ml)上FGF9支持人ES細(xì)胞的培養(yǎng)，但該數(shù)據(jù)略微可疑。
此時(shí)不能準(zhǔn)確知道足以支持人ES細(xì)胞不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞的FGF有效變體的準(zhǔn)確最小量，但可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)試驗(yàn)測(cè)得。已知對(duì)于FGF2，單獨(dú)在培養(yǎng)基中加入4ng/ml不足以無限維持整倍體未分化人ES細(xì)胞的培養(yǎng)，而單獨(dú)在培養(yǎng)基中加入100ng/mlFGF2就足夠了。盡管使ES細(xì)胞在含有少至4ng/ml的非調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)將在一段時(shí)間內(nèi)維持未分化，并可能傳代一次或兩次，但細(xì)胞最終將分化。在我們看來，當(dāng)細(xì)胞被培養(yǎng)至少6代并維持增殖、未分化、整倍體且同時(shí)維持人ES細(xì)胞特征性形態(tài)時(shí)，便可證明該培養(yǎng)基能夠以無限維持未分化和整倍體的狀態(tài)培養(yǎng)ES細(xì)胞。文中，F(xiàn)GF的維持濃度(maintenance concentration)是支持維持人ES細(xì)胞未分化、整倍體和增殖狀態(tài)至少6代所必需的FGF濃度。對(duì)FGF2而言，最低維持濃度在4ng/ml和100ng/ml之間，可采用以下方法內(nèi)插那些量來確定精確的最低維持濃度。對(duì)于其它各有效FGF，如FGF4、FGF9、FGF17和FGF18，可用類似的測(cè)試確定各FGF相應(yīng)的最低維持濃度。
培養(yǎng)在下面實(shí)施例中所述確定的人ES細(xì)胞培養(yǎng)基中的人ES細(xì)胞可在完全不含成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞且沒有調(diào)節(jié)培養(yǎng)基時(shí)無限培養(yǎng)并維持整倍體。因此該ES細(xì)胞的確是不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞的。該人ES細(xì)胞保留了人ES細(xì)胞的所有特征，包括特征形態(tài)(小且致密，細(xì)胞膜不清晰)、增殖以及分化成人體內(nèi)的許多(如果不是全部)細(xì)胞類型的能力。該人ES細(xì)胞還將保留當(dāng)注射入免疫削弱小鼠時(shí)能夠形成所有三個(gè)原生細(xì)胞層的特征。具體地說，該ES細(xì)胞保留了分化成外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的能力。該ES細(xì)胞仍顯示出指示ES細(xì)胞狀態(tài)的標(biāo)記，如表達(dá)與多能性相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子Oct4。該人ES細(xì)胞在此過程中及結(jié)束時(shí)保持正常核型。
實(shí)施例在這里描述的第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將人ES細(xì)胞接種到經(jīng)過照射(35戈瑞γ射線照射)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上。該實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基由80％“KnockOut”Dulbeco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(Gibco BRX，Rockville，MD)、1mM L-谷氨酰胺、0.1mM β-巰基乙醇和1％非必需氨基酸原液(Gibco BRL，Rockville，MD)構(gòu)成，補(bǔ)充有20％胎牛血清(HyClone，Logan，UT)或20％KnockOut SR(一種最初為小鼠ES細(xì)胞優(yōu)化的無血清替代品)(Gibco BRL，Rockville，MD)。KnockOut SR的組成見WO 98/30679中對(duì)血清替代品的描述。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在培養(yǎng)基中補(bǔ)充血清或上述血清替代品KnockOut SR，并補(bǔ)充或不補(bǔ)充人重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF，4ng/ml)。培養(yǎng)物中bFGF的優(yōu)選濃度范圍在1ng/ml至500ng/ml之間。
為確定不同培養(yǎng)條件下的克隆率，用0.05％胰蛋白酶/0.25％EDTA處理H-9培養(yǎng)物7分鐘以使其分散成單細(xì)胞，離心洗滌，并接種到有絲分裂失活(mitoticallyinactivated)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上(6孔板的每個(gè)孔中105個(gè)ES細(xì)胞)。為證實(shí)單細(xì)胞生長(zhǎng)形成了克隆ES細(xì)胞系，在立體顯微鏡下直接觀察以選擇各個(gè)細(xì)胞，并用微量移液器轉(zhuǎn)移到96孔板的各孔中，各孔中含有小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞和含有20％血清替代品和4ng/ml bFGF的培養(yǎng)基。
每5-7天用1mg/ml IV型膠原酶(Gibco BRL，Rockville，MD)通過常規(guī)傳代擴(kuò)展克隆。衍生6個(gè)月后，通過標(biāo)準(zhǔn)G顯帶技術(shù)證實(shí)H9細(xì)胞具有正常XX核型(分析20條染色體展開物(chromosomal spread))。然而，衍生7個(gè)月后，在單核型制品中，16/20的染色體展開物顯示出正常的XX核型，但4/20的展開物顯示出隨機(jī)異常(randomabnormality)，其中包括一個(gè)13號(hào)染色體短臂易位、一個(gè)20號(hào)染色體反向、一個(gè)4號(hào)染色體短臂易位、還有一個(gè)為多片段化。隨后，在衍生8、10和12.75個(gè)月后，在檢測(cè)的所有20個(gè)染色體展開物中H9細(xì)胞顯示出正常核型。
我們觀察到，在上述含有動(dòng)物血清的培養(yǎng)條件下人ES細(xì)胞的克隆率低下(無論存在或不存在bFGF)。我們還觀察到，在不存在動(dòng)物血清時(shí)克隆率升高，且在含有bFGF時(shí)進(jìn)一步升高。現(xiàn)在已證實(shí)，加入FGF通常有助于培養(yǎng)人ES細(xì)胞且特別有助于克隆人ES培養(yǎng)物。
下面的數(shù)據(jù)表示為接種105各種ES細(xì)胞后得到的集落總數(shù)+/-平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(集落克隆率百分比)。20％胎兒血清和無bFGF的結(jié)果為240+/-28。20％血清和bFGF(4ng/ml)的結(jié)果大致相同，為260+/-12。無血清(含有20％血清替代品)且無bFGF的結(jié)果為633+/-43，而無血清、有bFGF的結(jié)果為826+/-61。因此，血清對(duì)克隆率有不利影響，而在不含血清時(shí)存在bFGF對(duì)克隆率有協(xié)同作用。
在存在血清時(shí)長(zhǎng)期培養(yǎng)人ES細(xì)胞不需要添加外源提供的bFGF，并且(如上所述)，在含有血清的培養(yǎng)基中加入bFGF不會(huì)顯著提高人ES細(xì)胞的克隆率。然而，在無血清培養(yǎng)基中，bFGF提高了人ES細(xì)胞的初始克隆率。
此外還發(fā)現(xiàn)，添加外源bFGF對(duì)于在不含動(dòng)物血清時(shí)靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞的持續(xù)未分化增殖非常重要。在缺乏外源bFGF的無血清培養(yǎng)基中，人ES細(xì)胞通常在培養(yǎng)兩周后一致地分化。加入其它因子如LIF(不含bFGF)不能防止這種分化。
所得結(jié)果特別適用于克隆系。在這個(gè)方面，通過直接顯微鏡觀察將單個(gè)細(xì)胞置入96孔板的孔中，從而選擇要擴(kuò)展的克隆。在接種到96孔板孔中的192個(gè)H-9細(xì)胞中，成功擴(kuò)展了2個(gè)克隆(H-9.1和H-9.2)。然后在補(bǔ)充有血清替代品和bFGF的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)這兩個(gè)克隆。
克隆后，H9.1和H9.2細(xì)胞即便在連續(xù)培養(yǎng)8個(gè)多月之后都維持正常的XX核型。H-9.1和H-9.2克隆即便在無血清培養(yǎng)基中長(zhǎng)期培養(yǎng)之后還維持形成所有三個(gè)胚層衍生物的潛能。培養(yǎng)6個(gè)月之后，H9.1和H9.2克隆被證實(shí)具有正常核型，然后被注射入SCID-beige小鼠。
H9.1和H9.2細(xì)胞都形成含有所有三個(gè)胚層衍生物的畸胎瘤，這些衍生物包括腸道上皮(內(nèi)胚層)；胚腎、橫紋肌、平滑肌、骨骼、軟骨(中胚層)以及神經(jīng)組織(外胚層)。將多次傳代H9.1和H9.2細(xì)胞的畸胎瘤內(nèi)觀察到的分化程度與低傳代親本H9細(xì)胞形成的畸胎瘤中觀察到的分化程度相當(dāng)。
從上面的描述可知，盡管動(dòng)物血清可支持生長(zhǎng)，但它是一種復(fù)雜的混合物，其中可含有對(duì)于人ES細(xì)胞培養(yǎng)有益和有害的化合物。此外，不同批次血清支持人ES細(xì)胞有力(vigorous)未分化增殖的能力差別巨大。用明確成分代替血清能降低與這種血清批次變化有關(guān)的結(jié)果可變性，因此應(yīng)該能夠進(jìn)行更加明確的分化研究。
此外，含血清培養(yǎng)基的克隆率較低說明，通常使用的血清中存在對(duì)干細(xì)胞(尤其是當(dāng)細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞時(shí))存活有害的化合物。因此迫切需要避免使用這些化合物。
不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)后面的補(bǔ)充研究涉及在含有較高濃度FGF但不存在血清和飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)ES細(xì)胞系。該工作中采用三種不同的培養(yǎng)基配方，這些培養(yǎng)基配方在這里被稱為UM100、BM+和DHEM。UM100指添加有100ng/ml bFGF的非調(diào)節(jié)培養(yǎng)基。UM100培養(yǎng)基含有Gibco Knockout血清替代品產(chǎn)品，但不含或不需要使用任何類型的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞。BM+培養(yǎng)基是基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM/F12)加下述添加物，它也能在不含飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞，但該培養(yǎng)基省略了血清替代品產(chǎn)品。最后，DHEM指確定的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基。下面也將描述的這種培養(yǎng)基足以培養(yǎng)、克隆和無限增殖人ES細(xì)胞，它完全由無機(jī)成分和人類蛋白質(zhì)構(gòu)成，與含有牛白蛋白的BM+培養(yǎng)基相反。
在UM100/BM+/DHEM中培養(yǎng)人ES細(xì)胞系H1和H9UM100培養(yǎng)基制備如下在由80％(v/v)DMEM/F12(Gibco/Invitrogen)和20％(v/v)Knockout-血清替代品(Gibco/Invitrogen)構(gòu)成的非調(diào)節(jié)培養(yǎng)基(UM)中補(bǔ)充1mM谷氨酰胺(Gibco/Invitrogen)、0.1mM β-巰基乙醇(Sigma-St.Louis，MO)和1％非必需氨基酸原液(Gibco/Invitrogen)。加入100ng/ml bFGF并通過0.22μM尼龍濾器(Nalgene)過濾培養(yǎng)基以完成該培養(yǎng)基。
BM+培養(yǎng)基制備如下將16.5mg/ml BSA(Sigma)、196μg/ml胰島素(Sigma)、108μg/ml運(yùn)鐵蛋白(Sigma)、100ng/ml bFGF、1mM谷氨酰胺(Gibco/Invitrogen)、0.1mMβ-巰基乙醇(Sigma)和1％非必需氨基酸原液(Gibco/Invitrogen)混合在DMEM/F12(Gibco/Invitrogen)中，并用5M NaCl將重量克分子滲透壓濃度調(diào)制340mOsm。然后通過0.22μM尼龍濾器(Nalgene)過濾該培養(yǎng)基。
DHEM培養(yǎng)基制備如下將16.5mg/ml HSA(Sigma)、196μg/ml胰島素(Sigma)、108μg/ml運(yùn)鐵蛋白(Sigma)、100ng/ml bFGF、1mM谷氨酰胺(Gibco/Invitrogen)、0.1mM β-巰基乙醇(Sigma)、1％非必需氨基酸原液(Gibco/Invitrogen)、補(bǔ)充維生素(Sigma)、痕量礦物質(zhì)(Cell-gro)和0.014-0.07mg/L硒(Sigma)混合在DMEM/F12(Gibco/Invitrogen)中，并用5M NaCl將重量克分子滲透壓濃度調(diào)制340mOsm。注意，培養(yǎng)基中的補(bǔ)充維生素可包括硫胺素(6.6g/L)、還原型谷胱甘肽(2mg/L)和抗壞血酸PO4。同時(shí)，用于培養(yǎng)基的痕量礦物質(zhì)是痕量元素B(Cell-gro，目錄號(hào)MT 99-175-C1)和C(Cell-gro，目錄號(hào)MT 99-176-C1)的組合；它們各自以1,000X溶液出售。本領(lǐng)域已知痕量元素B和C的組分分別與Cleveland痕量元素I和II相同。(見Cleveland，W.L，Wood，I.Erlanger，B.F.，J.Imm.Methods 56221-234，1983)。然后通過0.22μM尼龍濾器(Nalgene)過濾該培養(yǎng)基。最后加入無菌的規(guī)定脂類(Gibco/Invitrogen)以完成該培養(yǎng)基。
用分散酶(1mg/ml)機(jī)械傳代之前生長(zhǎng)在MEF(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)飼養(yǎng)細(xì)胞上的H1或H9人胚胎干細(xì)胞，并將細(xì)胞接種到基質(zhì)膠(Becton Dickinson，Bedford，MA)上。每日更換合適的培養(yǎng)基直到測(cè)定的細(xì)胞密度足以進(jìn)行細(xì)胞傳代。然后用分散酶?jìng)鞔?xì)胞并維持在基質(zhì)膠(Becton Dickinson)上。
生長(zhǎng)速率為確定各種培養(yǎng)基中人ES細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，將細(xì)胞以約5×105細(xì)胞/孔的密度一式三份接種到6孔組織培養(yǎng)皿(Nalgene)中。在第3、5和7天用胰蛋白酶/EDTA(Gibco/Invitrogen)處理三復(fù)孔、分成單個(gè)細(xì)胞(individualized)并對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。在第7天，用胰蛋白酶處理其它的孔，計(jì)數(shù)，并以約2×105細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度再接種新的平板。通過FACS分析對(duì)已經(jīng)用胰蛋白酶處理過的第7天的培養(yǎng)物進(jìn)行分析以了解ES細(xì)胞表面標(biāo)記Oct4、SSEA4和Tral-60。收集連續(xù)3次傳代的生長(zhǎng)速率。生長(zhǎng)速率實(shí)驗(yàn)顯示，用UM100-培養(yǎng)的人ES細(xì)胞與用CM-培養(yǎng)的人ES細(xì)胞生長(zhǎng)得同樣迅猛。
貼壁(Attachment)動(dòng)力學(xué)為確定各種培養(yǎng)基中人ES細(xì)胞的貼壁速率，將細(xì)胞以2×105細(xì)胞/孔的密度接種到6孔組織培養(yǎng)皿(Nalgene)中。在30分鐘-48小時(shí)的各時(shí)間點(diǎn)上洗去未貼壁的細(xì)胞，用胰蛋白酶/EDTA(Gibco/Invitrogen)剝離貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)。進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)是為了檢測(cè)UM100生長(zhǎng)速率數(shù)據(jù)是否由于細(xì)胞貼壁較好和生長(zhǎng)較慢的組合(與UM100和CM的生長(zhǎng)速率相同相反)。我們發(fā)現(xiàn)，在所有測(cè)試時(shí)間點(diǎn)這兩個(gè)培養(yǎng)基的貼壁百分?jǐn)?shù)都是相等的。因此它們以相同速率生長(zhǎng)。
人ES細(xì)胞的FACS分析在37℃用胰蛋白酶/EDTA(Gibco/Invitrogen)+2％雞血清(ICN Biomedicals，Inc.，Aurora，OH)處理6孔組織培養(yǎng)平板(Nalgene)10分鐘以除去其上的人ES細(xì)胞。將細(xì)胞稀釋入等體積FACS緩沖液(PBS+2％FBS+0.1％疊氮化鈉)并通過80μM細(xì)胞過濾器(Nalgene)過濾。1000rpm離心5分鐘，收集細(xì)胞團(tuán)并將其重懸于1ml 0.5％低聚甲醛。將人ES細(xì)胞在37℃固定10分鐘，然后如上所述收集細(xì)胞團(tuán)。將ES細(xì)胞重懸于2ml FACS緩沖液并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算總細(xì)胞數(shù)。如上所述使細(xì)胞形成細(xì)胞團(tuán)并在90％甲醇中冰上通透30分鐘。如上所述使人ES細(xì)胞形成細(xì)胞團(tuán)，將1×105細(xì)胞稀釋入FACS管(Becton Dickinson)中的1ml FACS緩沖液+0.1％Triton X-100(Sigma)。如上所述使hESC形成細(xì)胞團(tuán)并重懸于50μl用FACS緩沖液+0.1％TritonX-100(Sigma)稀釋的第一抗體中。平行處理合適對(duì)照抗體的樣品。hESC在4℃孵育過夜。倒出上清，細(xì)胞用50μl第二抗體(Molecular Probes/Invitrogen)室溫避光孵育30分鐘。在Facscalibur(Becton Dickinson)細(xì)胞分選儀中用CellQuest軟件(BectonDickinson)進(jìn)行FACS分析。用這種方法進(jìn)行FACS分析能夠檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記，因此顯示是否得到了ES細(xì)胞。觀察到的結(jié)果是，培養(yǎng)在UM100中的人ES細(xì)胞有90％為Oct-4陽性群體。該結(jié)果與CM-培養(yǎng)的ES細(xì)胞相當(dāng)，證實(shí)該細(xì)胞為ES細(xì)胞群體。在分析SSEA4和Tral-60時(shí)采用和Oct-4一樣的方法，但細(xì)胞不用低聚甲醛或甲醇處理。細(xì)胞染色后，將細(xì)胞重懸于FACS緩沖液(無Triton)并如上所述在FACS緩沖液(同樣無Triton)中用合適的抗體分析。未分化的ES細(xì)胞培養(yǎng)物平均也有90％對(duì)這兩種細(xì)胞表面標(biāo)記呈陽性。這一點(diǎn)已經(jīng)通過上述FACS分析加以證實(shí)。
結(jié)果現(xiàn)在已經(jīng)將人ES細(xì)胞系H1的細(xì)胞在UM100培養(yǎng)基中培養(yǎng)33代以上(164以上的群體倍增)同時(shí)保持了人ES細(xì)胞的形態(tài)和特征。H1細(xì)胞在BM+培養(yǎng)基中培養(yǎng)6代以上(70天)同時(shí)保持了人ES細(xì)胞的形態(tài)和特征。H9細(xì)胞已經(jīng)在DHEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)5代以上(67天)。H9和H7人ES細(xì)胞也都在UM100培養(yǎng)基中以未分化狀態(tài)分別培養(yǎng)了22代和21代。之后對(duì)BM+和UM100-培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試顯示具有正常核型。
FGF形式的研究H1系的人ES細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)條件下用調(diào)節(jié)培養(yǎng)基培養(yǎng)3代，然后換成測(cè)試培養(yǎng)基。測(cè)試條件為，細(xì)胞在調(diào)節(jié)培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)(第0天)，第二天換成測(cè)試培養(yǎng)基(第1天)。之后用相應(yīng)的測(cè)試培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。人ES細(xì)胞系H9也在調(diào)節(jié)培養(yǎng)基配制的基質(zhì)膠上培養(yǎng)5代，然后平行換成測(cè)試培養(yǎng)基。
細(xì)胞按以下方法傳代。使細(xì)胞培養(yǎng)物在6孔組織培養(yǎng)平板中生長(zhǎng)至合適密度(需要大約7天)，然后在37℃用1ml分散酶(Dipase)(1mg/ml)(Gibco/Invitrogen)處理培養(yǎng)物5-7分鐘。然后除去分散酶并換成2ml合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。用5ml移液管從組織培養(yǎng)平板上機(jī)械除去細(xì)胞，然后通過上下吹打分散細(xì)胞。然后用醫(yī)用離心機(jī)1000rpm離心5分鐘使細(xì)胞形成細(xì)胞團(tuán)。然后將細(xì)胞團(tuán)重懸于適當(dāng)體積的培養(yǎng)基中并以所需稀釋度重新接種。
培養(yǎng)基配方相同，但加入的FGF不同?；A(chǔ)培養(yǎng)基為UM100，根據(jù)所需測(cè)試條件改變FGF。測(cè)試以下FGF變體，分別以100ng/ml加入培養(yǎng)基FGF1(酸性FGF)、FGF1β(酸性FGF的同種型)、FGF2(堿性FGF)、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20。所有FGF都通過商業(yè)購得或由重組宿主中產(chǎn)生。
每次傳代后判斷特定FGF形式支持人ES細(xì)胞培養(yǎng)物的能力。被判定為支持人ES細(xì)胞培養(yǎng)物的條件為在培養(yǎng)時(shí)支持培養(yǎng)物以未分化狀態(tài)適當(dāng)增殖，不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞，可有效傳代以及連續(xù)表達(dá)人ES細(xì)胞標(biāo)記Oct4、SSEA4和Tral-60。被判定為在培養(yǎng)時(shí)不支持人ES細(xì)胞的條件為通過形態(tài)觀察顯示培養(yǎng)物中有明顯的細(xì)胞分化，且細(xì)胞在集落傳代時(shí)無法增殖。支持人ES細(xì)胞培養(yǎng)物的FGF變體為FGF2、FGF4、FGF17和FGF18。不支持將人ES細(xì)胞維持于未分化狀態(tài)的FGF變體為FGF1、FGF1β、FGF3、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF10、FGF16、FGF19和FGF20。添加FGF9的培養(yǎng)基的結(jié)果起初是邊緣值。通過重復(fù)該過程發(fā)現(xiàn)，以100ng/ml補(bǔ)充FGF9似乎也能支持培養(yǎng)物中未分化的人ES細(xì)胞。
目前，補(bǔ)充有FGF4、FGF17和FGF20的培養(yǎng)基已經(jīng)支持未分化的H1系人ES細(xì)胞培養(yǎng)物傳代8次。用FGF4、FGF9、FGF17和FGF18對(duì)人ES細(xì)胞系H9和H14進(jìn)行類似重復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分別能延長(zhǎng)3代和2代。
上面已經(jīng)根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明。該概念的其它形式也包含在權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。例如，盡管上述試驗(yàn)采用的是重組制造的人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，但天然分離的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子也是適用的。此外，這些技術(shù)應(yīng)該也適用于猴或其它靈長(zhǎng)類細(xì)胞培養(yǎng)物。
因此，權(quán)利要求將被視為用來判定本發(fā)明的完整范圍。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明提供了培養(yǎng)靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞的方法以及用于該方法的培養(yǎng)基。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法，所述方法包括在基本不含哺乳動(dòng)物胎血清的培養(yǎng)物中和在含有氨基酸、維生素、鹽、礦物質(zhì)、運(yùn)鐵蛋白或運(yùn)鐵蛋白替代物、胰島素或胰島素替代物、白蛋白以及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，所添加的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子來自除飼養(yǎng)層之外的來源，其濃度至少與維持濃度一樣高，所述培養(yǎng)基能夠支持培養(yǎng)和增殖人未分化的增殖整倍體胚胎干細(xì)胞至少6代，不需要飼養(yǎng)細(xì)胞或者使培養(yǎng)基接觸飼養(yǎng)細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)物基本不含任何動(dòng)物血清。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述FGF選自FGF2、FGF4、FGF9、FGF17或FGF18。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述FGF是FGF2，其在培養(yǎng)基中的濃度是100ng/ml。
5.一種在不含血清且不含飼養(yǎng)細(xì)胞的確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法，所述方法包括在含有白蛋白、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、至少一種運(yùn)鐵蛋白或運(yùn)鐵蛋白替代物、至少一種胰島素或胰島素替代物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，所述培養(yǎng)基基本不含哺乳動(dòng)物胎血清并含有能夠激活成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體的至少約100ng/ml成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，所述生長(zhǎng)因子來自除飼養(yǎng)層之外的來源，所述培養(yǎng)基支持干細(xì)胞以未分化狀態(tài)增殖而不需要飼養(yǎng)細(xì)胞或條件培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)步驟包括在培養(yǎng)物中增殖胚胎干細(xì)胞一個(gè)月以上，同時(shí)維持該干細(xì)胞分化成內(nèi)胚層、中胚層和外胚層組織衍生物的潛能，同時(shí)維持該干細(xì)胞的核型。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述FGF選自FGF2、FGF4、FGF9、FGF17或FGF18。
8.一種人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物，其包含人胚胎干細(xì)胞；和含有白蛋白、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、至少一種運(yùn)鐵蛋白或運(yùn)鐵蛋白替代物、至少一種胰島素或胰島素替代物的干細(xì)胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基基本不含哺乳動(dòng)物胎血清并含有能夠激活成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體的至少維持濃度的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，所述培養(yǎng)基能夠在不含血清、不含飼養(yǎng)細(xì)胞且無需使培養(yǎng)基接觸飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下無限地培養(yǎng)干細(xì)胞，其中，所述培養(yǎng)物能夠?qū)⒏杉?xì)胞無限地維持于未分化狀態(tài)并具有正常核型。
9.如權(quán)利要求8所述的培養(yǎng)物，其特征在于，所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子是FGF2，其在培養(yǎng)基中的濃度至少約100ng/ml。
10.一種不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物，其包含干細(xì)胞培養(yǎng)基中的人胚胎干細(xì)胞，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基含有白蛋白、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、至少一種運(yùn)鐵蛋白或運(yùn)鐵蛋白替代物、至少一種胰島素或胰島素替代物，所述培養(yǎng)基基本不含哺乳動(dòng)物胎血清并含有至少維持濃度的選自FGF2、FGF4、FGF9、FGF17或FGF18的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，所述培養(yǎng)物不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞，且細(xì)胞維持整倍體并處于未分化狀態(tài)。
11.如權(quán)利要求10所述的培養(yǎng)物，其特征在于，所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度至少約100ng/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法，該方法是在基本不含哺乳動(dòng)物胎兒血清的環(huán)境中和在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基含有氨基酸、維生素、鹽、礦物質(zhì)、運(yùn)鐵蛋白、胰島素、白蛋白并添加有不止是飼養(yǎng)層來源的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。還公開了能夠支持人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)和增殖但不需要飼養(yǎng)細(xì)胞或者使培養(yǎng)基接觸飼養(yǎng)細(xì)胞的組合物。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK101072868SQ200580032533
公開日2007年11月14日 申請(qǐng)日期2005年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月28日
發(fā)明者J·A·托馬森, M·萊文斯坦 申請(qǐng)人:威塞爾研究所股份有限公司