高濃度干細(xì)胞的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于制備高濃度干細(xì)胞的方法，更特定而言，涉及一種以足以用 于臨床應(yīng)用的高收率來(lái)培育干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞是指不僅具有自我復(fù)制能力還具有分化成至少兩種類型的細(xì)胞的能力的 細(xì)胞，且能夠劃分為全能干細(xì)胞、亞全能干細(xì)胞（pluripotent stem cell)和多能干細(xì)胞 (multipotent stem cell)。全能干細(xì)胞是具有能夠發(fā)育成一個(gè)完整個(gè)體的全能性質(zhì)的細(xì) 胞，而這些性質(zhì)為卵母細(xì)胞和精子受精之后直到八細(xì)胞期的細(xì)胞所擁有。當(dāng)這些細(xì)胞分離 并移植到子宮內(nèi)時(shí)，它們可發(fā)育成一個(gè)完整的個(gè)體。亞全能干細(xì)胞，即能夠發(fā)育成外胚層、 中胚層和內(nèi)胚層來(lái)源的各種細(xì)胞和組織的細(xì)胞，來(lái)源于位于受精4-5天后生成的胚囊內(nèi)部 的內(nèi)細(xì)胞群。這些細(xì)胞被稱為"胚胎干細(xì)胞"，能夠分化成各種其他組織細(xì)胞，但不能形成 新的活有機(jī)體。多能干細(xì)胞，即僅能夠分化成特異于包含這些細(xì)胞的組織和器官的細(xì)胞的 干細(xì)胞，不僅涉及胎兒期、新生兒期和成體期的各種組織和器官的生長(zhǎng)和發(fā)育，還涉及成體 組織的穩(wěn)態(tài)的維持和組織損傷后誘發(fā)再生的功能。組織特異性多能細(xì)胞統(tǒng)稱為"成體干細(xì) 胞"。
[0003] 成體干細(xì)胞通過(guò)從各種人器官中取得細(xì)胞并使該細(xì)胞發(fā)育成干細(xì)胞而獲得，并且 特征在于它們分化成僅特異性的組織。然而，近來(lái)，用于使成體干細(xì)胞分化成包括肝細(xì)胞的 各種組織的試驗(yàn)取得巨大成功，這成為了熱點(diǎn)。特定而言，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中已經(jīng)做出努 力，所述再生醫(yī)學(xué)通過(guò)使用細(xì)胞來(lái)再生生物組織和器官，并恢復(fù)它們由于疾病或事故等導(dǎo) 致喪失的功能。在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中經(jīng)常使用的方法包括以下步驟：從患者采集干細(xì)胞、血 液來(lái)源的單核細(xì)胞或骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞；通過(guò)試管培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖和/或分化；和 通過(guò)移植將所選擇的未分化的（干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞）和/或已分化的細(xì)胞引入到患者體 內(nèi)。因此，期望用細(xì)胞/組織替代療法來(lái)替代通過(guò)藥物或外科手術(shù)來(lái)治療疾病的現(xiàn)有經(jīng)典 方法，所述細(xì)胞/組織替代療法是用健康細(xì)胞、組織或器官來(lái)替代受損細(xì)胞、組織或器官， 因而干細(xì)胞的用途將進(jìn)一步增加。
[0004] 因此，目前正在研宄干細(xì)胞的各種功能。特定而言，由于使用間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞 療法技術(shù)開始受到關(guān)注，故已經(jīng)開發(fā)了用于改進(jìn)自人體分離間充質(zhì)干細(xì)胞以便適合于治療 目的的技術(shù)（W0 2006/019357,韓國(guó)專利第0795708號(hào)和韓國(guó)專利第0818214號(hào)）。
[0005] 然而，還沒有充分地研宄出以足夠用于臨床應(yīng)用的量來(lái)增殖經(jīng)分離的干細(xì)胞的方 法。
[0006] 因此，本發(fā)明者們進(jìn)行了許多努力來(lái)以大的量制備干細(xì)胞，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)在包 含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和至少兩種選自下組的成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞時(shí)，干細(xì)胞能夠在短時(shí)期 內(nèi)以高濃度增殖，所述成分為：N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC)、抗壞血酸、胰島素或胰島素樣 因子、皮質(zhì)醇、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF)、EGF(表皮生長(zhǎng)因子）和抗氧化劑，從而完 成了本發(fā)明。
[0007] 本【背景技術(shù)】部分揭示的上述信息僅用于增進(jìn)對(duì)本發(fā)明【背景技術(shù)】的理解，因而其可 包含并未構(gòu)成已為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的現(xiàn)有技術(shù)的信息。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種在短時(shí)期內(nèi)以高濃度制備干細(xì)胞的方法。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種用于制備高濃度干細(xì)胞的方法，該方法 包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基；和至少兩種選自下組的成 分：N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC)、抗壞血酸、胰島素或胰島素樣因子、皮質(zhì)醇、地塞米松 (dexamethasone)、bFGF (堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子）、硫酸乙酰肝素、2-疏基乙醇、EGF (表 皮生長(zhǎng)因子）和抗氧化劑。
[0010] 通過(guò)以下詳細(xì)描述和所附權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他特征和實(shí)施方式將更加明 顯O
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1是示出在每種培養(yǎng)基中持續(xù)4天培養(yǎng)獲得自20、30、70和80歲成年男性的脂 肪來(lái)源的干細(xì)胞期間的細(xì)胞群倍增水平的圖表。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 除非另有定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員通常理解相同的含義。一般而言，本文使用的命名和實(shí)驗(yàn)方法是公知的以及本領(lǐng) 域通常采用的那些。
[0013] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"干細(xì)胞"是指不僅具有自我復(fù)制能力而且具有分化成至少兩 種類型的細(xì)胞的能力的細(xì)胞。"成體干細(xì)胞"是指在發(fā)育過(guò)程之后形成胚胎的各個(gè)器官的時(shí) 期或者在成體時(shí)期出現(xiàn)的干細(xì)胞。
[0014] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"間充質(zhì)干細(xì)胞"是指分離自人或哺乳動(dòng)物的組織的未分化干 細(xì)胞，其可來(lái)源于各種組織。特定而言，間充質(zhì)干細(xì)胞可以是臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、臍 帶血來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、肌肉來(lái)源 的間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、皮膚來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、羊膜來(lái)源的間充質(zhì) 干細(xì)胞和胎盤來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。從各個(gè)組織分離干細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。
[0015] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞"是分離自脂肪組織的未分化的成 體干細(xì)胞，在本文中也稱為"脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞"、"脂肪干細(xì)胞"或"脂肪來(lái)源的干細(xì) 胞"。這些細(xì)胞能夠通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)方法獲得。用于分離脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干 細(xì)胞的方法例如如下。即，脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)以下方法來(lái)分離：（在生理鹽 水中）培養(yǎng)通過(guò)脂肪抽吸獲得的含脂肪的懸液，然后或者通過(guò)胰蛋白酶處理來(lái)采集附著到 諸如燒瓶等培養(yǎng)容器的干細(xì)胞層，或者使用刮刀通過(guò)刮擦直接采集懸浮在少量生理鹽水中 的那些干細(xì)胞。
[0016] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"高濃度干細(xì)胞的制備"是指干細(xì)胞的數(shù)量以高收率增殖。如 本文所使用，術(shù)語(yǔ)"高濃度的干細(xì)胞"也被稱為"大量干細(xì)胞"。在本發(fā)明的實(shí)施例中，已證 實(shí)當(dāng)在根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞分離組織時(shí)，所獲得的干細(xì)胞數(shù)量顯著增加。優(yōu) 選地，證實(shí)當(dāng)經(jīng)3-5次傳代培養(yǎng)時(shí)，能夠以I X 107-5X IO8個(gè)細(xì)胞/ml的濃度獲得干細(xì)胞。 [0017] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"傳代培養(yǎng)"是指通過(guò)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿并通過(guò)將培養(yǎng) 基基質(zhì)用新鮮培養(yǎng)基替換以便長(zhǎng)期培養(yǎng)健康細(xì)胞而周期性地傳代一部分細(xì)胞。隨著細(xì)胞數(shù) 量在培養(yǎng)皿的有限空間內(nèi)增加，細(xì)胞由于預(yù)定時(shí)間內(nèi)營(yíng)養(yǎng)耗盡或廢物積累而自然死亡。因 此，傳代培養(yǎng)用于增加健康細(xì)胞的數(shù)量。典型地，1次傳代是指通過(guò)替換一次基質(zhì)（培養(yǎng)皿） 或細(xì)胞群體分離一次的培養(yǎng)物。可以使用本領(lǐng)域已知的任何傳代培養(yǎng)方法而沒有任何限 制，但優(yōu)選進(jìn)行機(jī)械或酶分離方法。
[0018] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"機(jī)械分離"是指物理或機(jī)械地分離細(xì)胞聚集物?？梢允褂帽?領(lǐng)域已知的任何機(jī)械分離方法而沒有任何限制，但細(xì)胞可優(yōu)選通過(guò)使用刀片、組織切塊機(jī)、 針、移液、EBD(胚狀體分配器，embryoid body divider)或刮刀分離。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選 實(shí)施方式，已證實(shí)通過(guò)使用刀片或組織切塊機(jī)傳代培養(yǎng)干細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)干細(xì)胞的大規(guī)模增 殖。
[0019] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"酶分離"是指通過(guò)酶處理解離細(xì)胞聚集物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域 已知的任何酶分離方法而沒有任何限制，但可優(yōu)選通過(guò)用包括膠原蛋白酶I、II、III和IV 的膠原蛋白酶、Accutase、分散酶或胰蛋白酶處理來(lái)解離細(xì)胞聚集物，接著傳代培養(yǎng)。
[0020] 可以通過(guò)各種途徑，例如靜脈內(nèi)給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥或腹膜內(nèi)給藥，將干細(xì)胞給藥到 體內(nèi)。在這些給藥途徑當(dāng)中，優(yōu)選靜脈內(nèi)給藥，因?yàn)槠淠軌蛞苑奖闱野踩姆绞街委熂膊《?無(wú)需外科手術(shù)操作。為了靜脈內(nèi)給予干細(xì)胞以安全地到達(dá)靶位點(diǎn)并呈現(xiàn)預(yù)期的治療效果， 應(yīng)當(dāng)滿足各種需求。首先，應(yīng)當(dāng)以一定的濃度或較高的濃度給予干細(xì)胞，使得干細(xì)胞在到達(dá) 靶位點(diǎn)后呈現(xiàn)預(yù)期的治療效果。因而，大量獲得被希望臨床應(yīng)用的干細(xì)胞很重要。此外，干 細(xì)胞應(yīng)當(dāng)具有適合血管內(nèi)給藥的尺寸，使得當(dāng)血管內(nèi)給藥時(shí)，這些干細(xì)胞既不會(huì)降低血液 流速也不會(huì)形成血栓塊。而且，干細(xì)胞在血管內(nèi)給藥之前應(yīng)當(dāng)不會(huì)破碎或聚集，并應(yīng)當(dāng)以單 個(gè)細(xì)胞安全到達(dá)其靶位點(diǎn)而即使在血管內(nèi)給藥之后也不會(huì)破碎或聚集。
[0021] 鑒于如上所述的若干需求，本發(fā)明意在提供臨床有效的一定濃度或更高濃度的干 細(xì)胞。根據(jù)常規(guī)方法的干細(xì)胞培養(yǎng)物，必須進(jìn)行許多次傳代培養(yǎng)來(lái)獲得干細(xì)胞的高收率，因 而花費(fèi)許多人力和時(shí)間。特定而言，由于一部分傳代培養(yǎng)必需的基質(zhì)成分非常昂貴，故在經(jīng) 濟(jì)效率方面是不利的。然而，本發(fā)明能夠以足夠臨床應(yīng)用的高濃度制備干細(xì)胞。
[0022] -方面，本發(fā)明涉及一種制備高濃度干細(xì)胞的方法，該方法包括在含有基礎(chǔ)培 養(yǎng)基和至少兩種選自下組的成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞的步驟：N-乙?；?L-半胱氨酸 (NAC)、抗壞血酸、胰島素或胰島素樣因子、皮質(zhì)醇、地塞米松、bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因 子）、硫酸乙酰肝素、2-巰基乙醇、EGF (表皮生長(zhǎng)因子）和抗氧化劑。
[0023] 優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的干細(xì)胞可使用成體干細(xì)胞，特別是獲得自脂肪組織或諸 如毛根鞘囊腫、羊膜等上皮組織的成體干細(xì)胞。更優(yōu)選地，可使用脂肪組織來(lái)源的成體干細(xì) 胞作為所述干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)可用作所述干細(xì)胞，特別是脂肪組織來(lái)源的間充 質(zhì)干細(xì)胞可用作所述干細(xì)胞。脂肪組織或上皮組織優(yōu)選源自哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選源自人。在 本發(fā)明的實(shí)施例中，使用人脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（AdMSC)。
[0024] 本發(fā)明中使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是指具有本領(lǐng)域已知的適于干細(xì)胞培養(yǎng)的簡(jiǎn)單組成 的典型培養(yǎng)基。通常用于培養(yǎng)干細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的實(shí)例包括MEM(最低必需培養(yǎng)基）、 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium) > RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium)和K_SFM(Keratinocyte Serum Free Medium)。作為本發(fā)明中使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 可以使用任何培養(yǎng)基而沒有限制，只要它們?cè)诒绢I(lǐng)域使用。優(yōu)選地，基礎(chǔ)培養(yǎng)基可選自下 組：M199/F12 (混合物）（GIBCO)、MEM- α培養(yǎng)基（GIBCO)、含低濃度葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基 (Welgene)、MCDB 131 培養(yǎng)基（Welgene)、MEM 培養(yǎng)基（GIBCO)、K-SFM、DMEM/F12 培養(yǎng)基、 PCM培養(yǎng)基和MSC擴(kuò)增培養(yǎng)基（Chemicon)。特定而言，其中可優(yōu)選使用K-SFM。
[0025] 用于獲得經(jīng)培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可補(bǔ)充本領(lǐng)域已知的添加劑，所述 添加劑促進(jìn)處于未分化狀態(tài)的間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖同時(shí)抑制其分化。并且，培養(yǎng)基可包含 等滲溶液中的中性緩沖液（如磷酸鹽和/或高濃度碳酸氫鹽），和蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物（例如，血 清如FBS、FCS(胎牛血清，fetal calf serum)或馬血清、血清替代物、白蛋白或者必需或非 必需氨基酸如谷氨酰胺或L-谷氨酰胺）。而且，其可以包含脂類（脂肪酸、膽固醇、血清的 HDL或LDL提取物）和存在于大多數(shù)這類儲(chǔ)存介質(zhì)中的其他成分（如胰島素或轉(zhuǎn)鐵蛋白、核 苷或核苷酸、丙酮酸鹽、諸如葡萄糖的糖源、呈任何離子化形式或鹽的硒、諸如皮質(zhì)醇的糖 皮質(zhì)激素和/或諸如β-巰基乙醇的還原劑）。
[0026] 并且，出于防止細(xì)胞彼此粘附、粘附于容器壁或形成太大的團(tuán)簇的目的，培養(yǎng)基可 有利地包含抗凝聚劑，如Invitrogen銷售的抗凝聚劑（