專利名稱：一種蓮藕dna指紋圖譜構(gòu)建的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蓮藕的分子標(biāo)記與DNA指紋圖譜構(gòu)建，更具體涉及一種蓮藕DNA指紋圖譜構(gòu)建的分子標(biāo)記方法，適用于蓮藕品種資源的鑒定。
背景技術(shù)：
蓮藕是我國(guó)重要的水生經(jīng)濟(jì)植物，栽培歷史悠久。我國(guó)種植較多，尤其是近十多年來(lái)，在我國(guó)的種植面積增長(zhǎng)很快，其次是日本和印度，其它東南亞國(guó)家和美國(guó)、俄羅斯有少量種植。
從蓮藕品種資源看，八十年代初期，國(guó)內(nèi)外廣泛征集的品種只有125份，而經(jīng)過(guò)近二十年的選育與應(yīng)用，已衍生出幾百個(gè)品種，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前蓮藕品種數(shù)量已達(dá)近500份。由于涉及多家研究單位，研究工作的不規(guī)范，導(dǎo)致品種來(lái)源系譜不清、同種材料不同記名等，此結(jié)果顯然不利于蓮藕雜交育種的親本選擇與可持續(xù)利用。因此，開(kāi)展蓮藕遺傳資源研究、鑒定，建立核心種質(zhì)資源庫(kù)已成為當(dāng)務(wù)之急。
生物指紋圖譜是能夠鑒別生物個(gè)體之間差異的電泳圖譜。這種電泳圖譜多態(tài)性豐富，且具有高度的個(gè)體特異性和環(huán)境穩(wěn)定性，就像人的指紋一樣，因而被稱為“指紋圖譜”。指紋圖譜技術(shù)極其適合于品種的鑒定工作。
作物品種指紋圖譜目前主要有兩種類型一類是較早開(kāi)始研究的蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜，另一類是90年代之后發(fā)展起來(lái)的DNA分子標(biāo)記指紋圖譜。“DNA指紋圖譜”一詞可以泛指一切具有某一種質(zhì)特異性的譜帶，借助指紋圖譜，可以區(qū)分不同的種質(zhì)資源。指紋圖譜是鑒別品種、品系的有力工具。
目前，廣泛應(yīng)用于DNA指紋圖譜繪制的分子標(biāo)記主要包括以下5種RFLP分析限制性內(nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的以生物基因組DNA序列變異為基礎(chǔ)研究不同基因組差異的一項(xiàng)新技術(shù)。RFLP不受顯隱性關(guān)系、環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響；在數(shù)量上不受限制，檢測(cè)方便；具有穩(wěn)定遺傳和特異性；而且用于檢測(cè)RFLP的克隆探針可隨意選擇，可以是核糖體DNA、葉綠體DNA或總DNA，這樣就可以產(chǎn)生大量的多態(tài)性，為研究植物類群特別是屬間、種間甚至品種間的親緣關(guān)系、系統(tǒng)發(fā)育與演化提供有力的依據(jù)。由于RFLP技術(shù)復(fù)雜，所需DNA量大，對(duì)所研究對(duì)象需要有一定的遺傳背景知識(shí)，目前已逐漸被其它分子標(biāo)記所代替。
RAPD分析隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性(RAPD)是J.Williams和J.Welsh兩個(gè)研究小組在1990年發(fā)展起來(lái)的一種新型遺傳標(biāo)記，它是以人工合成的隨機(jī)引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增而產(chǎn)生能顯示多態(tài)性的DNA指紋圖譜，RAPD是一種基于序列的多態(tài)性，由于可以在沒(méi)有任何分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)的情況下對(duì)某一物種進(jìn)行指紋圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性的研究；相對(duì)于RFLP來(lái)說(shuō)比較經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便，DNA用量也少(ng級(jí))；而且避免了使用放射性同位素，因而近年來(lái)在品種資源鑒定方面得到了廣泛的應(yīng)用。但是，RAPD在目前主要存在以下兩個(gè)問(wèn)題①重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，有許多因素均會(huì)影響RAPD的擴(kuò)增結(jié)果，在進(jìn)行RAPD分析之前，要反復(fù)進(jìn)行RAPD反應(yīng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以得到令人信服和可靠的結(jié)果。②RAPD過(guò)于靈敏，而且一般為顯性標(biāo)記，有時(shí)會(huì)使遺傳分析變得復(fù)雜化。因?yàn)橛械腞APD標(biāo)記不依照預(yù)期的遺傳樣式，在研究中運(yùn)用RAPD標(biāo)記時(shí)應(yīng)當(dāng)非常謹(jǐn)慎。
小衛(wèi)星DNA(VNTR)1980～1984年，人類遺傳學(xué)家相繼在人體基因組中發(fā)現(xiàn)了一些串聯(lián)重復(fù)序列，這些序列由長(zhǎng)度為11～60bp的核心序列串聯(lián)重復(fù)而成，后來(lái)稱之為小衛(wèi)星DNA。由于重復(fù)單位的數(shù)目不同和重復(fù)拷貝數(shù)的等位性不同，使其表現(xiàn)出高度多態(tài)性。不同生物、同一生物的不同品種，甚至同一品種的不同個(gè)體，其所含小衛(wèi)星各異，雜交產(chǎn)生的圖譜各不相同，譜帶遵循孟德?tīng)栠z傳方式遺傳并具有體細(xì)胞穩(wěn)定性。這些特點(diǎn)使之成為目前較先進(jìn)的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)而廣泛應(yīng)用在許多作物的品種鑒定和遺傳多樣性研究中。
SSR(微衛(wèi)星)技術(shù)SSR是一類由幾個(gè)核苷酸(一般為15個(gè))為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。植物體內(nèi)的二核苷酸重復(fù)(AT)n遠(yuǎn)比哺乳動(dòng)物豐富，植物基因組中平均每隔2Kb就有一個(gè)三核苷酸或四核苷酸重復(fù)，且每種類型的SSR在不同的物種中出現(xiàn)的頻率不同。SSR多態(tài)性的信息量非常豐富，具有所有RFLP的遺傳學(xué)優(yōu)點(diǎn)，又比RAPD重復(fù)性能和可信度高，因而是目前遺傳標(biāo)記中的熱點(diǎn)。但是由于SSR必須針對(duì)每個(gè)染色體座位的微衛(wèi)星，發(fā)現(xiàn)其兩端的單拷貝序列以設(shè)計(jì)引物，因而給SSR標(biāo)記的利用帶來(lái)了一定困難，然而一旦開(kāi)發(fā)出某種生物的SSR標(biāo)記，就又顯現(xiàn)出該標(biāo)記的利用價(jià)值。SSR目前已廣泛應(yīng)用于許多農(nóng)作物中。
AFLP技術(shù)AFLP技術(shù)是1993年由荷蘭生物技術(shù)公司KEYGENE的Zabeau和Vos等人發(fā)明的，已申請(qǐng)了專利。AFLP實(shí)際上是RFLP和PCR相結(jié)合的一種方法。與RAPD一樣，AFLP可以用于沒(méi)有任何分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)的物種，其引物在不同物種間是通用的，被稱為一種“半隨機(jī)”的擴(kuò)增。一個(gè)05mg的DNA樣品，可做4000個(gè)AFLP反應(yīng)，獲得8萬(wàn)個(gè)標(biāo)記，650萬(wàn)條帶紋?？梢?jiàn)AFLP的多態(tài)性非常高。利用放射性標(biāo)記或銀染方法在變性的聚丙烯酰胺凝膠上通?？蓹z測(cè)到50～100個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，而且重復(fù)性強(qiáng)，因而非常適合于品種指紋圖譜的繪制、遺傳連鎖圖的構(gòu)建及遺傳多樣性研究等。多數(shù)作物上的研究結(jié)果都表明其產(chǎn)生的多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了RFLP、RAPD等，目前被認(rèn)為是DNA指紋圖譜技術(shù)中多態(tài)性最為豐富的一項(xiàng)技術(shù)。實(shí)際上，AFLP最適的應(yīng)用范圍，也是Zabeau和Vos申請(qǐng)專利的關(guān)鍵，就是利用AFLP技術(shù)鑒定品種的指紋，檢測(cè)品種的質(zhì)量和純度。由于AFLP已申請(qǐng)專利，因而它在生產(chǎn)及商業(yè)上的應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蓮藕DNA指紋圖譜構(gòu)建的分子標(biāo)記方法，實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)便，操作方便、安全，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、有效。該方法能夠用于蓮藕新品種登記和品種鑒定、蓮藕品種純度和真實(shí)性檢驗(yàn)、蓮藕品種的親緣關(guān)系和分類分析、以及用于蓮藕基因組作圖。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。
本發(fā)明提出的方法有如下步驟1、DNA提取。每個(gè)蓮藕品種剪取幼嫩葉片2～5g，每份材料按高鹽低PH法提取總DNA。
2、PCR擴(kuò)增。對(duì)10-mer引物進(jìn)行篩選，并使用PCR熱循環(huán)儀分別對(duì)所研究的蓮藕品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。溫度控制在32-37℃，在PCR熱循環(huán)儀上循環(huán)42-47周期。
3、PCR產(chǎn)物鑒定。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠中電泳，EB染色后用掃描儀掃描記錄或照像。
4、數(shù)據(jù)分析。根據(jù)照片上各材料各引物擴(kuò)增情況作記錄，有帶記為1，無(wú)帶記為0。按根井正利(Nei)的方法計(jì)算蓮藕品種間的相似系數(shù)(GS)，進(jìn)而按平均距離法(UPGMA法)進(jìn)行聚類分析。
5、DNA指紋圖譜的構(gòu)建。根據(jù)照片上各材料各引物擴(kuò)增情況，挑取具有代表性(穩(wěn)定性和重復(fù)性良好的)的RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性)多態(tài)性帶，繪制蓮藕的DNA指紋圖譜。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果品種鑒定和種子純度檢測(cè)在生產(chǎn)上相當(dāng)重要，而檢測(cè)方法對(duì)種子準(zhǔn)確鑒定具有重要的意義。田間形態(tài)觀察的方法在上世紀(jì)70年代以前是主要的檢測(cè)方法，在品種鑒定和純度分析上起過(guò)很重要的作用，但隨著育種親本的利用集中化，品種鑒定愈來(lái)愈困難，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法愈來(lái)愈不適應(yīng)品種鑒定和純度分析。DNA分子標(biāo)記的出現(xiàn)，有利于品種鑒定和純度分析，目前DNA分子標(biāo)記技術(shù)鑒定品種和純度分析已在重要農(nóng)作物生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。但該方法在蓮藕種質(zhì)資源研究與蓮藕生產(chǎn)上還未見(jiàn)到報(bào)道，至今，蓮藕品種的鑒定與區(qū)分仍然采用最原始的田間形態(tài)觀察方法，這對(duì)蓮藕的研究與產(chǎn)業(yè)化發(fā)展極為不利?？紤]到RFLP分析的復(fù)雜性、AFLP已被發(fā)明人申請(qǐng)專利、以及小衛(wèi)星DNA(VNTR)與SSR(微衛(wèi)星)技術(shù)需要了解實(shí)驗(yàn)材料的遺傳背景等，本發(fā)明以RAPD分析技術(shù)為基礎(chǔ)，針對(duì)蓮藕的基因組特點(diǎn)，研究了一種蓮藕分子標(biāo)記方法。其一，該方法填補(bǔ)了蓮藕品種資源研究尤其是蓮藕遺傳資源DNA指紋圖譜的空白；其二，該方法比目前在蓮藕品種鑒定中所采用的田間形態(tài)觀察法更準(zhǔn)確、更有效，而且本專業(yè)領(lǐng)域的專業(yè)人員均能使用；其三，繪制的蓮藕品種DNA指紋圖譜簡(jiǎn)明、直觀，適于計(jì)算機(jī)管理。


圖1為以一種蓮藕DNA指紋圖譜構(gòu)建的分子標(biāo)記方法所繪制的DNA指紋圖譜的模式圖。
具體實(shí)施例方式
DNA提取每個(gè)蓮藕品種剪取新鮮幼葉2.5g，每份材料按高鹽低pH法提取總DNA。去RNA后用24∶1的氯仿異戊醇抽提一次，最后溶于0.1×TE中。經(jīng)調(diào)整濃度后用于PCR擴(kuò)增。
PCR擴(kuò)增用紅花蓮作模板對(duì)150個(gè)OPERON公司的10-mer引物進(jìn)行篩選，從中選出20個(gè)擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的引物，再分別對(duì)研究材料進(jìn)行擴(kuò)增。10μL反應(yīng)體系中含5ng DNA模板，0.5U Taq DNA聚合酶。退火溫度為35℃。在PCR熱循環(huán)儀上循環(huán)45周期。
PCR產(chǎn)物的鑒定用1.5％瓊脂糖電泳(TBE系統(tǒng))、EB染色鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。在Fotodye紫外透射儀上觀察，光敏紙成像或照相。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)為100bp Ladder(LKB公司)。
數(shù)據(jù)資料的分析統(tǒng)計(jì)8個(gè)能產(chǎn)生多態(tài)位點(diǎn)的引物在41個(gè)蓮藕品種的DNA樣品中擴(kuò)增的電泳帶總數(shù)與多態(tài)性帶的數(shù)目。在電泳圖譜上同一RAPD位點(diǎn)上有電泳帶記錄為1，無(wú)電泳帶記錄為0。作0，1矩陣圖輸入計(jì)算機(jī)。按根井正利(Nei)的方法計(jì)算蓮藕品種間的相似系數(shù)(GS)，從而得遺傳差異GD＝1-GS。利用GD按平均距離法(UPGMA法)進(jìn)行遺傳分類。
DNA指紋圖譜的構(gòu)建按照上述照片上各材料各引物擴(kuò)增情況，挑取具有代表性的(穩(wěn)定性和重復(fù)性良好的)RAPD多態(tài)性帶，繪制(15個(gè)生產(chǎn)上栽培的)蓮藕品種的DNA指紋圖譜。在這一DNA指紋圖譜中，每個(gè)蓮藕品種均有其特異的DNA指紋，可以把這15個(gè)品種彼此區(qū)分開(kāi)(圖1)。
權(quán)利要求
1.一種蓮藕DNA指紋圖譜構(gòu)建的分子標(biāo)記方法，其步驟A、DNA提取，對(duì)蓮藕品種剪取幼嫩葉片，按高鹽低PH法提取總DNA；B、PCR擴(kuò)增，對(duì)10-mer引物進(jìn)行篩選，并使用PCR熱循環(huán)儀分別對(duì)蓮藕品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，溫度控制在32-37℃，在PCR熱循環(huán)儀上循環(huán)42-47周期；C、PCR產(chǎn)物鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠中電泳，EB染色后用掃描儀掃描記錄；D、數(shù)據(jù)分析，根據(jù)照片上各材料各引物擴(kuò)增情況作記錄，有帶記為1，無(wú)帶記為0，按Nei的方法計(jì)算蓮藕品種間的相似系數(shù)，再按平均距離法進(jìn)行聚類分析；E、DNA指紋圖譜的構(gòu)建，根據(jù)照片上引物擴(kuò)增情況，挑取具有代表性的RAPD多態(tài)性帶，繪制蓮藕品種的DNA指紋圖譜。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種蓮藕DNA指紋圖譜構(gòu)建的分子標(biāo)記方法，其步驟是首先是DNA提取，剪取蓮藕幼嫩葉片，提取總DNA；其次是PCR擴(kuò)增，對(duì)引物進(jìn)行篩選，對(duì)蓮藕品種的基因組進(jìn)行擴(kuò)增；第三是PCR產(chǎn)物鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，EB染色后用掃描儀掃描記錄；第四是數(shù)據(jù)分析，根據(jù)照片上各材料各引物擴(kuò)增情況作記錄，計(jì)算蓮藕品種間的相似系數(shù)，進(jìn)行聚類分析；第五是DNA指紋圖譜的構(gòu)建，根據(jù)照片上引物擴(kuò)增情況，繪制蓮藕的DNA指紋圖譜。本發(fā)明過(guò)程簡(jiǎn)便，操作方便、安全，結(jié)果準(zhǔn)確、有效，該方法適用于蓮藕品種登記和鑒定。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1482257SQ0312825
公開(kāi)日2004年3月17日 申請(qǐng)日期2003年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月1日
發(fā)明者韓延闖, 刁英, 胡中立, 周明全, 宋運(yùn)淳 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)