一種uplc測定穿心蓮藥材指紋圖譜及四種二萜內(nèi)酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種穿心蓮藥材的超高效液相指紋圖譜及四種二萜內(nèi)酯的檢測方法， 屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 穿心蓮 Andrographispaniculata (Burm. f. ) Nees.為爵床科（Acanthaceae)穿心 蓮屬AndrographisWall. exNees.植物，又名一見喜、苦草、四方草、印度草等，主產(chǎn)于廣東、 福建等地，干燥地上部分作為藥用?！吨袊幍洹?010年版一部記載其性寒、味苦，具有清熱 解毒、涼血、消腫之功效，被廣泛用于治療細(xì)菌性痢疾、急性扁桃體炎、尿路感染、流行性感 冒和毒蛇咬傷等癥。
[0003] 由于中藥化學(xué)成分復(fù)雜，作用機(jī)制不明確，致使現(xiàn)有中藥制藥技術(shù)難以確保中藥 產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性，中藥指紋圖譜建立的可以全面反映中藥內(nèi)在化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn) 而反映中藥的質(zhì)量?，F(xiàn)階段中藥的有效成分絕大多數(shù)沒有明確，采用中藥指紋圖譜的方式， 將有效地表征中藥質(zhì)量。指紋圖譜已為國際社會所認(rèn)可，有利于中藥及產(chǎn)品進(jìn)入國際市場。
[0004] 穿心蓮藥材的真?zhèn)?、?nèi)在質(zhì)量對于后期制劑的工藝規(guī)范化控制和臨床用藥的有效 性、安全性和穩(wěn)定性都具有非常重要的意義，所以尋找到一種比較好的穿心蓮藥材的鑒別 和穿心蓮提取物含量的測定方法是極其具有價值的，而且采取多成分指標(biāo)同時測定，也是 保證藥材質(zhì)量和確切療效行之有效的方法。首先，本發(fā)明從鑒別穿心蓮藥材的方法入手，利 用超高效液相色譜法（UPLC)建立穿心蓮藥材的指紋圖譜；并且同時測定了穿心蓮內(nèi)酯、脫 水穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯四個穿心蓮主要二萜內(nèi)酯類成分的含量。本 發(fā)明通過對超高效液相色譜法的提取溶劑、提取時間、提取方式、色譜柱、流動相、梯度洗脫 程序以及檢測波長等色譜條件進(jìn)行多方面考察，找到了一種更加準(zhǔn)確、快速、靈敏度高、重 復(fù)性好的鑒定穿心蓮藥材以及有效成分含量測定的方法。
[0005] 目前，現(xiàn)有技術(shù)中有對穿心蓮提取物進(jìn)行指紋圖譜研究的報道，但采用4種參比 物，最終只鑒定出7個共有峰，操作相對復(fù)雜，而精密度較差。本發(fā)明人有針對性的對這些 缺點(diǎn)進(jìn)行了研究，建立了一種新的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，利用該圖譜對穿心蓮藥材進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)督， 以確保產(chǎn)品質(zhì)量。采用本發(fā)明的方法，提取時間短，不需減壓干燥，可防止有效成分變性。且 色譜峰形和分離度得到了極大的改善。與現(xiàn)有文獻(xiàn)選擇了 7個指紋峰比較，本發(fā)明中選取 了更多的指紋峰，使得藥材質(zhì)量控制的準(zhǔn)確性得到了很大的提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種穿心蓮超高效液相標(biāo)準(zhǔn)對照指紋圖譜，其建立方法如下：
[0007] 1)供試品洛液制備：
[0008] 取穿心蓮，采用甲醇水溶液進(jìn)行提取，再加入甲醇水溶液調(diào)整溶液濃度，濾過，取 濾液，既得；
[0009] 2)獲得色譜圖：
[0010] 配制穿心蓮內(nèi)酯溶液作為參照物，將供試品溶液和穿心蓮內(nèi)酯溶液注入超高效液 相色譜儀，得到色譜圖；
[0011] 3)生成對照指紋圖譜
[0012] 選擇合格的多批穿心蓮樣品的指紋圖譜，以穿心蓮內(nèi)酯峰為參比峰，得到27個共 有峰的圖譜，用軟件，例如"中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評價系統(tǒng)3. 0"（文獻(xiàn)：張 宇，孫國祥，焦寶明等。冠心蘇合丸高效液相色譜數(shù)字化定量指紋圖譜研究[J].中南藥學(xué)， 2013, 11 (1).)，按平均值法計(jì)算生成標(biāo)準(zhǔn)對照指紋圖譜。
[0013] 其中，色譜條件如下：采用 Acquity UPLC BEH C18 色譜柱（L 7μπι，2· lXIOOmm); 梯度洗脫；流動相A為0. 2% -0. 4%甲酸-水溶液，流動相B為甲醇：乙腈=1 :9~2 :8 混合溶液；進(jìn)樣量為1-3 μ L ;色譜柱溫度20°C -30°C ;以穿心蓮內(nèi)酯為參照物，檢測波長為 247_251nm ;
[0014] 其中梯度洗脫程序如下所示：0~2min，88%~82%- 80%~74% B ;2~3min， 80%~74% B ;3 ~5min，80%~74%- 79%~73% B ;5 ~7min，79%~73%- 78%~ 72% B ;7 ~7. 5min，78%~72%- 72%~66% B ;7· 5 ~8min，72%~66% B ;8 ~9min， 72%~66%-68%~62%B ;9 ~llmin，68%~62%-63%~57%B ;11 ~12min，63%~ 57%-61%~55%B;12~13min,61%~55%B;13~15min,61%~55%-38%~32% B ;15 ~17min，38%~32%- 23%~17% B ;17 ~19min，23%~17%- 88%~82% B ; 19 ~21min,88%~82% B。
[0015] 優(yōu)選的本發(fā)明所述的標(biāo)準(zhǔn)對照指紋圖譜，其建立方法如下：
[0016] 1)供試品溶液的制備，方法如下：
[0017] 精密稱定穿心蓮藥材粉末，加入20-200倍量（重量體積比）60-80%甲醇-水溶液 超聲提取20-60min，超聲后，放置至室溫，用60-80%甲醇-水溶液據(jù)體積定容，0. 22 μ m微 孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得；
[0018] 2)以穿心蓮內(nèi)酯作為參照物制備標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液，方法如下：
[0019] 精密稱取穿心蓮內(nèi)酯對照品適量，加60-80%甲醇-水溶解制成0. 5~1. 5mg/ml 的溶液，即得；
[0020] 3)標(biāo)準(zhǔn)對照指紋圖譜的確定，方法如下：
[0021] 將供試品溶液和對照品溶液注入高效液相色譜儀，得到色譜圖，
[0022] 多批穿心蓮樣品的指紋圖譜中共有27個峰為共有峰，計(jì)算27個共有指紋峰的相 對保留時間和相對保留時間的RSD值，將積分信號導(dǎo)入"中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù) 字化評價系統(tǒng)3. 0"軟件，按平均值法計(jì)算生成標(biāo)準(zhǔn)對照指紋圖譜，其中，與穿心蓮內(nèi)酯對照 品峰保留時間相同的色譜峰為17號峰；
[0023] 其中，色譜條件如下：采用 Acquity UPLC BEH C18 色譜柱（1. 7μπι，2· lXIOOmm); 梯度洗脫；流動相A為0. 3%甲酸-水溶液，流動相B為甲醇：乙腈=1 :9的混合溶液；進(jìn)樣 量為2μ L ;色譜柱溫度25°C ;以穿心蓮內(nèi)酯為參照物，檢測波長為249nm ;
[0024] 其中梯度洗脫程序如下所示：0~2min，85%- 77% B ;2~3min，77% B ;3~ 5min，77 % - 76 % B ;5 ~7min，76 % - 75 % B ;7 ~7. 5min，75 % - 69 % B ;7· 5 ~8min， 69% B ;8 ~9min,69%- 65% B ;9 ~llmin,65%- 60% B ;11 ~12min,60%- 58% B ; 12 ~13min,58% B ;13 ~15min,58%- 35% B ;15 ~17min,35%- 20% B ;17 ~19min， 20%- 85% B ;19 ~21min,85% B。
[0025] 最優(yōu)選的，本發(fā)明所述的標(biāo)準(zhǔn)對照指紋圖譜，其建立方法如下：
[0026] 其中步驟1)供試品溶液的制備，方法如下：
[0027] 精密稱定穿心蓮藥材粉末，加入重量體積比為50倍量的80%甲醇-水溶液超聲提 取20min,超聲后，放置至室溫，用80 %甲醇-水溶液據(jù)體積定容，用0.22 μ m微孔濾膜濾 過，取續(xù)濾液，即得。
[0028] 2)以穿心蓮內(nèi)酯作為參照物制備標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液，方法如下：
[0029] 精密稱取穿心蓮內(nèi)酯對照品適量，加80%甲醇-水溶解制成lmg/ml的溶液，即得。
[0030] 本發(fā)明還提供一種穿心蓮的超高效液相色譜指紋圖譜檢測方法，其特征在于，包 括如下步驟：
[0031] 1)待測樣品色譜圖的制備：
[0032] 取穿心蓮，采用甲醇水溶液進(jìn)行提取，再加入甲醇水溶液調(diào)整溶液濃度，濾過，取 濾液，注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖；
[0033] 2)待測樣品色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)對照指紋圖譜相似度計(jì)算：
[0034] 將待測樣品的色譜圖導(dǎo)入"中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評價系統(tǒng)3. 0"軟 件，比較待測樣品的色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)對照指紋圖譜相似度；
[0035] 其中，色譜條件如下：采用 Acquity UPLC BEH C18 色譜柱（1. 7μπι，2· lXIOOmm); 梯度洗脫；流動相A為0. 2% -0. 4%甲酸-水溶液，流動相B為甲醇：乙腈=1 :9~2 :8 混合溶液；進(jìn)樣量為1-3 μ L ;色譜柱溫度20°C -30°C ;以穿心蓮內(nèi)酯為參照物，檢測波長為 247_251nm ;
[0036] 其中梯度洗脫程序如下所示：0~2min，88%~82%- 80%~74% B ;2~3min， 80%~74% B ;3 ~5min，80%~74%- 79%~73% B ;5 ~7min，79%~73%- 78%~ 72% B ;7 ~7. 5min，78%~72%- 72%~66% B ;7· 5 ~8min，72%~66% B ;8 ~9min， 72%~66%-68%~62%B ;9 ~llmin，68%~62%-63%~57%B ;11 ~12min，63%~ 57%-61%~55%B;12~13min,61%~55%B;13~15min,61%~55%-38%~32% B ;15 ~17min，38%~32%- 23%~17% B ;17 ~19min，23%~17%- 88%~82% B ; 19 ~21min,88%~82% B。
[0037] 優(yōu)選的，本發(fā)明指紋圖譜檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0038] 1)待測樣品色譜圖的制備：
[0039] 精密稱定穿心蓮藥材粉末，加入20-200倍量（重量體積比）60-80%甲醇-水溶液 超聲提取20-60min，超聲后，放置至室溫，用60-80%甲醇-水溶液據(jù)體積定容，微孔濾膜濾 過，取續(xù)濾液，注入高效液相色譜儀，得到色譜圖；
[0040] 2)待測樣品色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)對照指紋圖譜相似度計(jì)算：
[0041] 將待測樣品的色譜圖導(dǎo)入"中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評價系統(tǒng)3. 0"軟 件，比較待測樣品的色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)對照指紋圖譜相似度：相似度為0. 90以上為合格，相似 度為0. 95以上為相符。
[0042] 其中，色譜條件如下：采用 Acquity UPLC BEH C18 色譜柱（1. 7μπι，2· lXIOOmm); 梯度洗脫；流動相A為0. 3%甲酸-水溶液，流動相B為甲醇：乙腈=1 :9混合溶液；進(jìn)樣量 為2μ L ;色譜柱溫度25°C ;以穿心蓮內(nèi)酯為參照物，檢測波長為249nm ;
[0043] 其中優(yōu)選的梯度洗脫程序如下所示：0~2min，85% - 77% B ;2~3min，77% B ; 3 ~5min，77%-76%B ;5 ~7min，76%-75%B ;7 ~7. 5min，75%-69%Β ;7· 5 ~8min， 69% B ;8 ~9min,69% - 65% B ;9 ~llmin,65% - 60% B ;11 ~12min,60% - 58% B ; 12 ~13min,58% B ;13 ~15min,58%- 35% B ;15 ~17min,35%- 20% B ;17 ~19min， 20%- 85% B ;19 ~21min,85% B。
[0044] 最優(yōu)選的，本發(fā)明所述的指紋圖譜檢測方法，其中，
[0045] 步驟1)供試品溶液的制備，方法如下：
[0046] 精密稱定穿心蓮藥材粉末，加入重量體積比為50倍量的80%甲醇-水溶液超聲 提取20min,超聲后，放置至室溫，用80%甲醇-水溶液據(jù)