專利名稱：對痢疾志賀氏菌8型的o－抗原特異的核苷酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及痢疾志賀氏菌8型(Shigella dysenteriae8)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特別是涉及痢疾志賀氏菌8型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用這些對O-抗原特異的寡核苷酸快速、準確地檢測人體及環(huán)境中的痢疾志賀氏菌8型并鑒定這些致病菌中的O-抗原。
O-抗原是革蘭氏陰性細菌脂多糖中的O特異性多糖成分，它由許多重復的寡糖單位組成。O-抗原的合成過程研究得較清楚先由糖基轉移酶將核苷二磷酸單糖轉移到一個固定在細胞內(nèi)膜的脂分子上，然后在內(nèi)膜的內(nèi)側合成寡糖單位，O-抗原的寡糖單位再通過轉運酶被轉移到內(nèi)膜外側，而后通過聚合酶聚合成多糖，再被連接到一個糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)655-682]。編碼負責O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色體上相鄰排列，形成一個基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4495-503]。在志賀氏菌、大腸桿菌和沙門氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之間[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen lociimplicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，116923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“TheEscherichia coli O111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgeneclusters encoding the same colitose-containing O antigen are highlyconserved”.Journal of Bacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三類基因糖合成路徑基因，糖基轉移酶基因，寡糖單位處理基因，其中糖合成路徑基因編碼的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸單糖；糖基轉移酶基因編碼的酶將核苷二磷酸單糖及其它分子轉到單糖上從而使單糖聚合成寡糖單位；寡糖單位處理基因包括轉運酶基因和聚合酶基因，它們將寡糖單位轉移到細菌內(nèi)膜外側，再聚合成多糖。糖基轉移酶基因和寡糖單位處理基因只存在于攜帶這些基因的基因簇里。O-抗原中單糖的不同，單糖間聯(lián)結鍵的不同和寡糖單位之間聯(lián)結鍵的不同構成了O-抗原的多樣性，而單糖的組成、單糖間的聯(lián)結鍵及寡糖單位之間的聯(lián)結鍵是由O-抗原基因簇中的基因控制著，所以O-抗原基因簇決定了O-抗原的合成，也決定了O-抗原的多樣性。
因為O-抗原是極強的抗原，是志賀氏菌重要的致病因素之一，同時它又具有極強的多樣性，這啟示我們能研究一種快速、準確地檢測志賀氏菌及其O-抗原的特異性好、靈敏度高的方法。以表面多糖為目標的血清學免疫反應自上世紀30年代以來一直被用于對細菌的分型和鑒定，是鑒定致病菌的唯一的手段。這種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數(shù)量不足，大量的抗血清在制備和儲存中也存在一些困難。另一方面此法耗時長、靈敏度低、漏檢率高、準確性差，所以，現(xiàn)在普遍認為這種傳統(tǒng)的血清學檢測方法將為現(xiàn)代分子生物學方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙門氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特異核苷酸序列通過PCR方法鑒定了沙門氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是將相應于沙門氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原內(nèi)的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到對不同血清型的沙門氏菌特異的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用對E.coli O111的O-抗原特異的源于wbdI基因的寡核苷酸鑒定了一株產(chǎn)毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiologicalinvestigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused bydry fermented sausage contaminated with Shiga-like toxin producingEscherichia coli”.J.Clin.Microbiol.341622-1627]，但是后來的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鑒定E.coli O111的血清型的方法有假陽性結果出現(xiàn)。Bastin D.A.and Reeves，P.R.認為，這是由于wbdI基因是一個推測的糖合成路徑基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111.Gene 16417-23]，而在其它細菌的O-抗原的結構中也可能有這個糖，所以糖合成路徑基因對于O-抗原并不是高度特異的志賀氏菌有46種血清型，但只有33種不同的O-抗原，大腸桿菌有166種不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，nichespecific selection and bacterial populations”.FEMSMicrobiol.Lett，100509-516]，二者親緣關系非常近，并且有12種是大腸桿菌和志賀氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’sidentification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenic relationships between the enteroinvasive Escherichiacoli antigens O28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and andShigella O antigens”J.clin Microbiol，17(4)681-684]
本發(fā)明的次一目的是提供了痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇的全長核苷酸序列。
本發(fā)明的另一目的是提供了構成痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇的基因轉運酶的基因即wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉移酶基因，包括orf1，orf4，orf5，orf7基因；糖合成路徑基因，包括gne基因。
本發(fā)明的又一目的是提供了寡核苷酸，它們分別源于痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇中編碼糖基轉移酶的基因包括orf1，orf4，orf5，orf7基因；源于編碼轉運酶的基因即wzx基因或與wzx有相似功能的基因、源于編碼聚合酶的基因即wzy基因或與wzy有相似功能的基因；它們是上述基因內(nèi)的寡核苷酸，長度在10-20nt；它們對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原是特異的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它們對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原是高度特異的，而且這些寡核苷酸還可重新組合，組合后的寡核苷酸對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原也是高度特異的。
本發(fā)明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作為引物用于核酸擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列，從而通過這些方法來檢測和鑒定痢疾志賀氏菌8型的O-抗原及檢測和鑒定痢疾志賀氏菌8型。
本發(fā)明的還一目的是提供了分離痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以獲得其他細菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以獲得編碼其他多糖抗原的細菌的基因簇的全序列。
本發(fā)明的目的是由以下技術方案實現(xiàn)的。
本發(fā)明對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸，其是如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長9227個堿基；或者具有一個或多個插入、缺失或取代的堿基，同時保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
前述的對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸，其由7個基因組成，都位于galF基因和gnd基因之間。
前述的對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸，其中所述的基因是轉運酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉移酶基因，包括orf1、orf4、orf5、orf7基因；其中所述的基因orf1是SEQ ID NO1中的1097至1912堿基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO1中的1899至3125堿基的核苷酸；wzx是SEQ IDNO1中的3180至4349堿基的核苷酸；orf4是SEQ ID NO1中的4419至5285堿基的核苷酸；orf5是SEQ ID NO1中的5282至5968堿基的核苷酸；orf7是SEQ ID NO1中的7004至7750堿基的核苷酸。
前述的對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸，其中它是源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基轉移酶基因orf1、orf4、orf5、orf7基因；以及它們的混合或它們的重組。
前述的對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸，其中所述的源于orf1基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的1103至1120堿基的核苷酸和1877至1896堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的1194至1213堿基的核苷酸和1763至1780堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的1261至1279堿基的核苷酸和1686至1704堿基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的1976至1995堿基的核苷酸和3096至3114堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2145至2162堿基的核苷酸和2997至3014堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2249至2268堿基的核苷酸和2834至2850堿基的核苷酸；源于wzx基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的3183至3191堿基的核苷酸和4261至4278堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的3241至3257堿基的核苷酸和4091至4109堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的3301至3318堿基的核苷酸和3991至4019堿基的核苷酸；源于orf4基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的4441至4460堿基的核苷酸和5201至5220堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的4501至4520堿基的核苷酸和5115至5132堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的4601至4620堿基的核苷酸和5072至5088堿基的核苷酸；源于orf5基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的5311至5330堿基的核苷酸和5947至5965堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5401至5420堿基的核苷酸和5895至5912堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5501至5520堿基的核苷酸和5828至5846堿基的核苷酸；源于orf7基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的7059至7076堿基的核苷酸和7651至7668堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的7099至7106堿基的核苷酸和7521至7540堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的7161至7180堿基的核苷酸和7481至7500堿基的核苷酸。
前述的對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸在檢測表達O-抗原的細菌、在診斷中鑒定細菌的O-抗原和細菌的其它多糖抗原的應用。
前述的對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，而且通過插入表達可提供表達痢疾志賀氏菌8型的O-抗原，并成為細菌疫苗。
前述的對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸的應用，其中它作為引物用于PCR、作為探針用于雜交反應與熒光檢測、或者用于制造基因芯片或微陣列，檢測人體和環(huán)境中的細菌。
前述的對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)痢疾志賀氏菌8型，離心收集細胞。用500ul50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul0.4M EDTA重懸細胞，37℃溫育20分鐘，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul20mg/ml的蛋白酶K、15ul10％SDS，50℃溫育2小時，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃ 30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇抽提兩次，取上清再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚。上清用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％7醇洗DNA，將DNA重懸于30ul TE中；基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)通過PCR擴增痢疾志賀氏菌8型中的O-抗原基因簇以痢疾志賀氏菌8型的基因組為模板通過Long PCR擴增其O-抗原基因簇。首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇啟動子區(qū)的JumpStart序列設計上游引物(#1523-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設計下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用BoehringerMannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴增O-抗原基因簇，PCR反應程序如下在94℃預變性2分鐘；然后94℃變性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分鐘，這樣進行30個循環(huán)。最后，在68℃繼續(xù)延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的大小及其特異性。合并6管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構建O-抗原基因簇文庫用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構建O-抗原基因簇文庫，反應體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應在室溫中進行。酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1kb-3kb之間，而后加入2ul0.1M EDTA終止反應。合并4管同樣的反應體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中。隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃30分鐘，將酶切產(chǎn)物補成平端，75℃終止反應后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應的緩沖液并將體系擴大為80ul，70℃反應20分鐘，使DNA的3’端加dA尾。此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接24小時，總體積為90ul。其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶。最后用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物；用BiO-Rad公司的電轉化感受態(tài)細胞的制備方法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5 a細胞，取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5a混合后，轉到BiO-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時間為5.0毫秒至6.0毫秒，電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃過夜培養(yǎng)，次日得到藍白菌落，將得到的白色菌落即白色克隆轉到含有氨卞青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時從每個克隆中提取質(zhì)粒，并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群構成了痢疾志賀氏8型的O-抗原基因簇文庫；(4)對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在700bp以上的120個克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自動測序儀對克隆中的插入片段單向進行測序，使序列達到90％的覆蓋率。剩余10％的序列再通過將部分序列反向測序，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國劍橋MRC(Medicai Research Council)分子生物學實驗室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列；序列的質(zhì)量主要由兩個方面來保證1)對痢疾志賀氏菌8型的基因組作6個Long PCR反應，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫。2)對每個堿基，保證3個以上高質(zhì)量的覆蓋率。在得到痢疾志賀氏菌8型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國國家生物技術信息學中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到7個開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對，最后得到痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇的結構；(6)特異基因的篩選針對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因設計引物；在每個基因內(nèi)各設計三對引物，每對引物分布在相應基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進行PCR，在其他組中都沒有擴增到任何大小正確的帶，即在大多數(shù)組中沒有得到任何PCR產(chǎn)物帶，雖然在少數(shù)組中得到PDR產(chǎn)物帶，但其大小不符合預期大小，所以wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原都是高度特異的。
也就是，本發(fā)明的第一個方面，提供了痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇的全長核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全長9227個堿基；或者具有一個或多個插入、缺失或取代的堿基，同時保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通過本發(fā)明的方法得到了痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇的結構，如表3所示，它總共由7個基因組成，都位于galF基因和gnd基因之間。
本發(fā)明的第二個方面，提供了痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇中的基因，即轉運酶基因(wzx基因或與wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或與wzy有相似功能的基因)；糖基轉移酶基因，包括orf1，orf4，orf5，orf7基因；細菌多糖抗原中特殊的糖合成路徑基因，包括gne基因。它們在O-抗原基因簇中的起始位置和終止位置及核苷酸序列都列在表4中；本發(fā)明尤其涉及到糖基轉移酶基因、轉運酶基因和聚合酶基因，因為糖合成路徑基因即合成核苷二磷酸單糖的基因現(xiàn)在被預示對較多胞外多糖是常見的、共同的，對細菌的O-抗原并不是很特異的，而本發(fā)明涉及到的糖基轉移酶基因、轉運酶基因和聚合酶基因對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原是高度特異的。
本發(fā)明的第三個方面，提供了源于痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇中的wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因和糖基轉移酶基因，包括orf1，orf4，orf5，orf7基因的寡核苷酸，它們是這些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，優(yōu)先被用的是列于表1中的寡核苷酸對，在表1中也列出了這些寡核苷酸對在O-抗原基因簇中的位置及以這些寡核苷酸對為引物所做的PCR反應的產(chǎn)物的大小，這些PCR反應可用表中的退火溫度進行。這些引物只在以痢疾志賀氏菌8型為模板進行的PCR擴增中得到預期大小的產(chǎn)物，而在以表2所列的其它菌為模板進行的PCR擴增中都未得到預期大小的產(chǎn)物。更詳細地說，以這些寡核苷酸對為引物所做的PCR反應在大多數(shù)細菌中均未得到任何產(chǎn)物。所以，可以確定這些引物即表1所列的寡核苷酸對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原是高度特異的。
所述的對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法包括下述步驟1)基因組的提??；2)PCR擴增痢疾志賀氏菌8型中的O-抗原基因簇；3)構建O-抗原基因簇文庫；4)對文庫中的克隆測序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特異基因的篩選。
本發(fā)明的其他方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
如本發(fā)明所用，“寡核苷酸”主要是指來源于O-抗原基因簇中的編碼糖基轉移酶的基因、編碼轉運酶的基因和編碼聚合酶的基因內(nèi)的一段核苷酸分子，它們在長度上可改變，一般在10到20個核苷酸范圍內(nèi)改變。更確切的說這些寡核苷酸是源于orf1基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的1097至1912堿基)，wzy基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的1899至3125堿基)，wzx基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的3180至4349堿基)，orf4基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的4419至5285堿基)，orf5基因(核苷酸位置是從SEQID NO1的5282至5968堿基)，orf7基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的7004至7750堿基)。源于以上基因內(nèi)的寡核苷酸對痢疾志賀氏菌8型是高度特異的。
此外，有時兩個遺傳相似的編碼不同O-抗原的基因簇通過基因重組或突變產(chǎn)生新的O-抗原，從而產(chǎn)生新的細菌類型，新的突變株。在這種環(huán)境中，需要篩選出多對寡核苷酸同重組基因雜交以提高檢測的特異性。因此，本發(fā)明提供了一整套多對寡核苷酸的混合物，它們源于糖基轉移酶基因；源于轉運酶和聚合酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。這些基因的混合物對一個特殊的細菌多糖抗原來說是特異的，從而使這套寡核苷酸對這個細菌的多糖抗原是特異的。更具體地說，這些寡核苷酸的混合物是源于糖基轉移酶基因、wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的組合。
在另一方面，本發(fā)明涉及寡核苷酸的鑒定，它們可以用于檢測表達O-抗原的細菌和在診斷中鑒定細菌的O-抗原。
本發(fā)明涉及到一種檢測食品中的一個或多個細菌多糖抗原的方法，這些抗原可以使樣品能與以下至少一個基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉移酶的基因(ii)編碼轉運酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個寡核苷酸能與至少一個表達特殊的O-抗原的細菌的一個以上的那樣的基因特異性雜交，這些細菌是痢疾志賀氏菌8型?？捎肞CR方法檢測，更可以將本發(fā)明方法中的核苷酸標記后作為探針通過雜交反應如southern-blot或熒光檢測，或者通過基因芯片或微陣列檢測樣品中的抗原及細菌。
本發(fā)明設計者考慮到以下情況當單個的特異的寡核苷酸檢測無效時，寡核苷酸的混合物能與靶區(qū)域特異性雜交以檢測樣品。因此本發(fā)明提供了一套寡核苷酸用于本發(fā)明所述的檢測方法。這里所說的寡核苷酸是指源于編碼糖基轉移酶的基因、編碼轉運酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。這套寡核苷酸對一個特殊的細菌的O-抗原來說是特異的，這一特殊的細菌O-抗原是由痢疾志賀氏菌8型表達的。
另一方面，本發(fā)明涉及到一種檢測排泄物中的一個或多個細菌多糖抗原的方法，這些抗原可以使樣品能與以下至少一個基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉移酶的基因(ii)編碼轉運酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個寡核苷酸能與至少一個表達特殊的O-抗原的細菌的一個以上的那樣的基因特異性雜交。這些細菌是痢疾志賀氏菌8型?？捎帽景l(fā)明中的寡核苷酸作引物通過PCR的方法檢測樣品，也可將本發(fā)明中的寡核苷酸分子標記后作為探針通過雜交反應如southern-blot或熒光檢測，或者通過基因芯片或微陣列檢測樣品中的抗原及細菌。
一般一對寡核苷酸可能與同樣的基因雜交也可與不同的基因雜交，但它們中必須有一個寡核苷酸能特異性雜交到特殊抗原型的特異序列上，另一個寡核苷酸可雜交于非特異性區(qū)域。因此，當特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新組合時，至少能選出一對寡核苷酸與多糖抗原基因簇中特異基因混合物雜交，或者選出多對寡核苷酸與特異基因的混合物雜交。甚至即使當一個特殊的基因簇中所有基因都獨一無二時，此方法也能應用于識別此基因簇內(nèi)的基因混合物的核苷酸分子。因此本發(fā)明提供了一整套用于檢測本發(fā)明方法的多對寡核苷酸，在這里多對寡核苷酸是源于編碼糖基轉移酶的基因、編碼轉運酶和聚合酶的基因包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因，這套寡核苷酸對一個特殊的細菌多糖來說是特異的，這套寡核苷酸可能是糖合成中必須基因的核苷酸。
另一方面，本發(fā)明也涉及到一種檢測源于病人的樣品中的一個或多個細菌多糖抗原的方法。樣品中的一個或多個細菌多糖抗原可以使樣品能與以下至少一個基因中的一對寡核苷酸中的一個特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉移酶的基因(ii)編碼轉運酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個寡核苷酸能與樣品中的至少一個表達特殊的O-抗原的細菌的一個以上的那樣的基因特異性雜交，這些細菌是痢疾志賀氏菌8型?？捎帽景l(fā)明中的寡核苷酸作引物通過PCR的方法檢測樣品，也可將本發(fā)明中的寡核苷酸標記后作為探針通過雜交反應，或者通過基因芯片或微陣列檢測樣品中的抗原及細菌。
更詳細地說，以上描述的方法可以理解為當寡核苷酸對被使用時，其中的一個寡核苷酸分子能雜交到一個并不是來源于糖基轉移酶基因、wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因的序列上。此外，當兩個寡核苷酸都能雜交上時，它們可能雜交于同一基因也可能雜交到不同基因上。也即，當交叉反應出現(xiàn)問題時，可選擇寡核苷酸的混合物來檢測混合的基因以提供檢測的特異性。
本發(fā)明者相信本發(fā)明不必限于以上所提的核苷酸序列編碼的特定的O-抗原，而且廣泛應用于檢測所有表達O-抗原和鑒定O-抗原的細菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如細菌胞外抗原)合成之間的相似性，本發(fā)明的方法和分子也應用于這些其他的多糖抗原。
本發(fā)明首次公開了痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇的全長序列，而且可從這個未被克隆的全長基因簇的序列中產(chǎn)生重組分子，通過插入表達可產(chǎn)生表達痢疾志賀氏菌8型的O-抗原，并成為有用的疫苗。
其次是感受態(tài)細胞的制備參照Bio-Rad公司提供的方法制備感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α。取一環(huán)大腸桿菌DH5α單菌落于5ml的LB培養(yǎng)基中，180rpm培養(yǎng)10小時后，取2ml培養(yǎng)物轉接到200ml的LB培養(yǎng)基中，37℃250rpm劇烈振蕩培養(yǎng)到OD600 0.5左右，然后冰浴冷卻20分鐘，于4℃4000rpm離心15分鐘。傾盡上清，用冷的冰預冷的去離子滅菌水200ml吹散菌體，于4℃4000rpm離心15分鐘。再用冷的冰預冷的去離子滅菌水100ml吹散菌體，于4℃4000rpm離心15分鐘。用冷的冰預冷的10％的甘油懸浮細胞，4℃6000rpm離心10分鐘，棄上清，最后沉淀用1ml冰預冷的10％的甘油懸浮細胞，即為感受態(tài)細胞。將制得的感受態(tài)細胞分裝為50ul一管，-70℃保存。
最后是電轉化感受態(tài)細胞取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉到Bio-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時間為5.0毫秒-6.0毫秒。電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復蘇。然后立即將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37℃倒置過夜培養(yǎng)，次日得到藍白菌落。將得到的白色菌落即白色克隆轉到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時從每個克隆中提取質(zhì)粒并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群構成了痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇文庫。實施例4對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在700bp以上的120個克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自動測序儀對克隆中的插入片段單向進行測序，使序列達到90％的覆蓋率。剩余10％的序列再通過將部分序列反向測序，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列。實施例5核苷酸序列的拼接及分析用英國劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學實驗室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列(見序列列表)。序列的質(zhì)量主要由兩個方面來保證1)對痢疾志賀氏菌8型的基因組作6個Long PCR反應，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫。2)對每個堿基，保證3個以上高質(zhì)量的覆蓋率。在得到痢疾志賀氏菌8型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國國家生物技術信息學中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到7個開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對，最后得到痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇的結構，如表3所示。
通過檢索和比較，發(fā)現(xiàn)orf1與Escherichia coli O91的glycosyltransferase基因在265個氨基酸中有25％的氨基酸序列是一樣的，即有17％的相同性，44％的相似性，說明它們之間有高度的同源性，可以推測orf1也為糖基轉移酶基因，命名為orf1。orf2是一個預測帶有10個跨膜片段的蛋白，它的內(nèi)膜的拓撲結構具有眾所周知的O-抗原聚合酶的典型特征，此外，它與E.coli的編碼O-抗原聚合酶的wzy基因在370個氨基酸中有25％的相同性，45％的相似性，說明它們之間有高度的同源性，所以命名orf2為wzy基因。Orf3和E.coli的wzx基因在419個氨基酸中有23％的相同性，44％的相似性，此wzx基因有12個潛在的穿膜區(qū)，而通過Eisenberg等的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984)“Analysis of membrane and surfaceprotein sequences with the hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179125-142]發(fā)現(xiàn)orf3也有12個潛在的穿膜區(qū)，而且與許多wzx蛋白相似，orf3在wzx蛋白的氨基端有一個大約50個氨基酸的保守基序，所以可以確定orf3是wzx基因，命名為wzx。orf4與Streptococcusagalactiae的CpsVN基因在295個氨基酸中有33％的相同性，56％的相似性，而CpsVN基因是糖基轉移酶基因；另外orf4與Streptococcus pneumoniae的glycosyl transferase，family2基因在301個氨基酸中有24％的相同性，43％的相似性，所以推測orf4是一個糖基轉移酶基因，命名為orf4。orf5與Streptococcus thermophilusEps10基因在246個氨基酸中有32％的相同性，52％的相似性，表現(xiàn)出較高的同源性，此基因編碼糖基轉移酶，所以推測orf5是糖基轉移酶基因，命名為orf5。orf6與Yersinia enterocolitica(type 08)的gne基因在336個氨基酸中有59％的相同性，74％的相似性，所以命名orf6為gne基因。orf7與Bacillusanthracis中編碼糖基轉移酶的基因和Escherichia coli O157H7中編碼糖基轉移酶的基因在氨基酸水平上分別有42％和36％的相同性，所以推測orf7也是一個糖基轉移酶基因，命名為orf7。
根據(jù)痢疾志賀氏菌8型的結構推測它應有四個糖基轉移酶基因，分別轉移五個糖以合成O-抗原的寡糖單位。需要wzx基因將寡糖單位轉移到膜外，wzy基因將寡糖單位聚合成多糖，寡糖單位中的特殊單糖也由O-抗原基因簇合成，如GalNAc由gne基因合成，這些基因在痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇里都被發(fā)現(xiàn)。實施例6特異基因的篩選針對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因設計引物，這些基因在核苷酸序列中的位置見表1。
表1列出了痢疾志賀氏菌8型的O抗原基因簇中糖基轉移酶基因和寡糖單位處理基因及基因內(nèi)的引物及PCR數(shù)據(jù)。在表中列出了痢疾志賀氏菌8型的O抗原基因簇的糖基轉移酶基因、轉運酶基因和聚合酶基因及它們的相應的功能和大小。在每個基因內(nèi)，我們各設計了三對引物，每對引物分布在相應基因內(nèi)的不同地方以確保其特異性。在表中還列出了每個引物在SEQ IDNO1中的位置和大小。以每對引物用表中所列的相應的退火溫度以表2中的所有菌的基因組為模板進行PCR，得到了相應的PCR產(chǎn)物，其大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大腸桿菌的基因組中且高度保守的一個基因，所以我們根據(jù)mdh基因設計了引物#101(-TTC ATC CTAAAC TCC TTA TT)和#102(-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG)，然后從166株大腸桿菌中提取基因組，方法如前所述。用這對引物從166株大腸桿菌的基因組中PCR以鑒定大腸桿菌并檢測其基因組的質(zhì)量。
表2是用于篩選特異基因的166株大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來源，為了檢測的方便，我們將它們每8-10個菌分為一組，總共27組，它們的來源都列于表中。
在第24組中含有痢疾志賀氏菌8型的基因組DNA作為陽性對照。以每組菌做模板，用表1中的每對引物按如下條件做PCR在94℃預變性2分鐘后，94℃變性15秒，退火溫度因引物的不同而不同(參照表1)，退火時間是50秒，72℃延伸2分鐘，這樣進行30個循環(huán)。最后在72℃繼續(xù)延伸10分鐘，反應體系是25ul。反應完畢后，取10ulPCR產(chǎn)物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增出的片段。
對于wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因，每個基因都有三對引物被檢測，每對引物除了在第24組中做PCR后得到了預期大小的正確的一條帶外，在其他組中都沒有擴增到任何大小正確的帶，也就是說，在大多數(shù)組中沒有得到任何PCR產(chǎn)物帶，所以wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因對痢疾志賀氏菌8型及其O-抗原是高度特異的。
最后，通過PCR從痢疾志賀氏菌8型中篩選到對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原高度特異的基因wzx、wzy和四個糖基轉移酶基因。而這些基因內(nèi)的任何一段10-20nt的寡核苷酸對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原是特異的，尤其是上述每個基因中的引物即寡核苷酸對經(jīng)PCR檢測后證實對痢疾志賀氏菌8型是高度特異的。所有的這些寡核苷酸都可用于快速準確地檢測人體和環(huán)境中的痢疾志賀氏菌8型，并能鑒定它們的O-抗原。
表3是痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇的結構表，在表中列出了痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇的結構，共由7個基因組成，每個基因用方框表示，并在方框內(nèi)寫入基因的名稱，數(shù)字表示的是O-抗原基因簇中的開放閱讀框(orf)的順序。在O-抗原基因簇的兩端是galF基因和gnd基因，它們不屬于O-抗原基因簇，我們只是用它們的一段序列設計引物來擴增O-抗原基因簇的全長序列。
表4是痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇中的基因的位置圖，在圖中列出了痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇中的所有開放閱讀框在全序列中的準確位置，在每個開放閱讀框的起始密碼子和終止密碼子的下面劃線。在志賀氏菌中開放閱讀框的起始密碼子有兩個ATG和GTG。序列列表<110>南開大學<120>對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸<130>對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>9227<212>DNA<213>Shigella dysenteriae<400>1attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc 60gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgaactgcg cgtgaagcgc 120caactgttgg cggaagtaca gtccatctgt ccgcctggcg tgaccattat gaacgtgcgt 180cagggcgaac ctttaggttt aggccactcc attttatgtg cacgacccgc cattggcgac 240aacccatttg tcgtggtact gccagacgta gtgatcgacg acgccagcgc cgacccgctg 300cgctacaacc ttgctgccgt gattgcgcgc ttcaatgaaa cgggccgtag ccaggtgctg 360gcaaaacgta tgccgggtga cctctctgaa tactccgtca ttcagaccaa agaaccgctg 420gaccgtgaag gcaaagtcag ccgcattgtt gaattcatcg aaaaaccgga tcagccacaa 480acgctggact cagacatcat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgccga tatttggccg 540gaacttgaac gcactcaacc tggtgcatgg gggcgtattc agctgactga tgccattgct 600gaactggcga aaaaacagtc cgttgatgca 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9227表1痢疾志賀氏菌8型的O抗原基因簇中的糖基轉移酶基因和寡糖單位處理基因及其中的引物及PCR數(shù)據(jù)

*在痢疾志賀氏菌8型中得到正確的一條帶表2 166株大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來源組號 該組中含有的菌株來源1 野生型大腸桿菌O1，O2，O3，O4，O10，O16，O18，O39IMVSu2 野生型大腸桿菌O40，O41，O48，O49，O71，O73，O88，O100 IMVS3 野生型大腸桿菌O102，O109，O119，O120，O121，O125，O126，O137IMVS4 野生型大腸桿菌O138，O139，O149，O7，O5，O6，O11，O12IMVS5 野生型大腸桿菌O13，O14，O15，O17，O19ab，O20，O21，O22 IMVS6 野生型大腸桿菌O23，O24，O25，O26，O27，O28，O29，O30IMVS7 野生型大腸桿菌O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O42IMVS8 野生型大腸桿菌O43，O44，O45，O46，O50，O51，O52，O53IMVS9 野生型大腸桿菌O54，O55，O56，O57，O58，O59，O60，O61IMVS10 野生型大腸桿菌O62，O63，O64，O65，O66，O68，O69，O70IMVS11 野生型大腸桿菌O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81IMVS12 野生型大腸桿菌O82，O83，O84，O85，O86，O87，O89，O90IMVS13 野生型大腸桿菌O91，O92，O95，O96，O97，O98，O99，O101 IMVS14 野生型大腸桿菌O112，O162，O113，O114，O115，O116，O117，O118IMVS15 野生型大腸桿菌O123，O165，O166，O167，O168，O169，O170，O171Seeb16 野生型大腸桿菌O172，O173，O127，O128，O129，O130，O131，O132， Seec17 野生型大腸桿菌O133，O134，O135，O136，O140，O141，O142，O143IMVS18 野生型大腸桿菌O144，O145，O146，O147，O148，O150，O151，O152IMVS19 野生型大腸桿菌O153，0154，O155，O156，O157，O158，O159，IMVS20 野生型大腸桿菌O160，O161，O163，O8，O9，O124，O111 IMVS21 野生型大腸桿菌O103，O104，O105，O106，O107，O108，O110 IMVS22 鮑氏志賀氏菌血清型B4，B5，B6，B8，B9，B11，B12，B14 Seed23 鮑氏志賀氏菌血清型B1，B3，B7，B8，B10，B13，B15，B16，B17，B18 Seed24 痢疾志賀氏菌血清型D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8Seed25 痢疾志賀氏菌血清D9，D10，D11，D12，D13 Seed26 弗氏志賀氏菌F6a，F(xiàn)1a，F(xiàn)1b，F(xiàn)2a，F(xiàn)2b，F(xiàn)3，F(xiàn)4a，F(xiàn)4b，F(xiàn)5(v7)F5(v4) Seed27 宋內(nèi)氏志賀氏菌D5，DRSeeda. Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australiab. O123 from IMVS；the rest from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc. 172 and 173 from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，the rest from IMVSd. 中國預防醫(yī)學科學院流行病學研究所表3痢疾志賀氏菌8型O抗原基因結構圖 表4痢疾志賀氏菌8型O抗原基因簇基因位置attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc 60gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgaactgcg cgtgaagcgc 120caactgttgg cggaagtaca gtccatctgt ccgcctggcg tgaccattat gaacgtgcgt 180cagggcgaac ctttaggttt aggccactcc attttatgtg cacgacccgc cattggcgac 240aacccatttg tcgtggtact gccagacgta gtgatcgacg acgccagcgc cgacccgctg 300cgctacaacc ttgctgccgt gattgcgcgc ttcaatgaaa cgggccgtag ccaggtgctg 360gcaaaacgta tgccgggtga cctctctgaa tactccgtca ttcagaccaa agaaccgctg 420gaccgtgaag gcaaagtcag ccgcattgtt gaattcatcg aaaaaccgga tcagccacaa 480acgctggact cagacatcat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgccga tatttggccg 540gaacttgaac gcactcaacc tggtgcatgg gggcgtattc agctgactga tgccattgct 600gaactggcga aaaaacagtc cgttgatgca atgctgatga ctggtgaaag ctacgactgc 660ggtaaaaaaa tgggctatat gcaggcgttt gtgaagtatg gattgcgcaa cctgaaagaa 720ggggcgaagt tccgtaaagg gattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccgg 780atgtaacggt tgataagaaa attataacgg cagtgaggat tcgtggcgaa agtaatttgt 840tgcgaatatt cctgccgttg ttttatataa acaatcagaa taacaacgag ttagcaatag 900gattttagtc aaagttttcc aggattttcc ttgtttccag agcgaattgg taagacaatt 960agcgtttgaa tttttcgagt taagcgcgag tgggtaacgc tcgtcacatc gtagacatgc1020atgcagtgct ctggtagctg taaagccagg ggcggtagcg ttatttatat tcataggtct1080orf1起始aaaatagata accgagatga aaatagctat aggtatatca acattaaata atggaataaa1140tcaggtttgg gaaaaaataa aaaatatacc agatgaattt ttaataataa tttcacatca1200agtgactgat aagcaaaaac aacatgggga tatttgtaag aaaaacaatg tgataataat1260aacgacatac tgtaaagggt taagtaaaag cagaaatatt ttattggcta ctgcatttca1320aaaaagcgtt gattatatga ttataagtga tgatgatgtc gcttaccttg ttaatggact1380ttatgaacta aaagatagaa taatcgaaga tagaggcaag tatcattatc aaattcaaag1440ttgtacgcaa gacggaagac taaggaaaaa atatccgcta atgaggaaaa ggctaaatag1500attgtcagca tttaacattt cttcaataga aatgtgcctt 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tgaaaggtcc ttccattatg cctggtgggc agaaagaagc ctatgaactg 8340gttgctccga tcctgaccaa aatcgccgca gtggttgaag atggcgagcc atgcgttacc 8400tatattggtg ccgatggtgc aggtcactat gtgaagatgg ttcacaacgg tattgaatac 8460ggcgatatgc agctgattgc tgaagcctat tctctgctta aaggtggcct gaatctttcc 8520aacgaagaac tggcgcagac gtttaccgag tggaataatg gtgaactgag cagctacctg 8580atcgacatca ccaaagatat cttcaccaaa aaagatgaag acggtaacta cctggttgat 8640gtgattctgg atgaagcagc aaataaaggt acgggcaaat ggaccagcca gagtgcgctg 8700gatctcggcg aaccgctgtc gctgattacc gagtctgtgt ttgctcgtta tatctcttct 8760ctgaaagatc agcgcgttgc cgcgtctaaa gttctctctg gcccgcaagc gcagccagct 8820ggcgacaagg ctgagttcat cgaaaaagtt cgtcgtgctc tgtatctggg caaaatcgtt 8880tcttacgccc aaggcttctc tcagctgcgt gcggcgtctg aagagtacaa ctgggatctg 8940aactacggcg aaatcgcgaa gattttccgt gctggctgca tcatccgtgc gcagttcctg 9000cagaaaatca ctgatgcata tgccgaaaat ccgcagatcg ctaatctgct gctggctccg 9060tactttaaac aaattgccga tgattaccag caggcgctgc gtgatgtcgt tgcttatgca 9120gtgcagaacg gtatcccggt tccgaccttc gccgctgcgg ttgcctatta tgacagctac 9180cgtgccgctg ttctgcctgc gaacctaatc caggcccagc gcgacta 9227以上所述，僅是本發(fā)明較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何形式限制，凡依本發(fā)明技術實質(zhì)對以上實施例作任何簡單修改、等同變化與修飾，仍屬本發(fā)明技術方案范圍。
權利要求
1.一種對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長9227個堿基；或者具有一個或多個插入、缺失或取代的堿基，同時保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
2.按照權利要求1所述的對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其是由7個基因組成，都位于galF基因和gnd基因之間。
3.按照權利要求2所述的對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，所述的基因是轉運酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉移酶基因，包括orf1、orf4、orf5、orf7基因；其中所述的基因orf1是SEQ IDNO1中的1097至1912堿基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO1中的1899至3125堿基的核苷酸；wzx是SEQ ID NO1中的3180至4349堿基的核苷酸；orf4是SEQ ID NO1中的4419至5285堿基的核苷酸；orf5是SEQ ID NO1中的5282至5968堿基的核苷酸；orf7是SEQ ID NO1中的7004至7750堿基的核苷酸。
4.按照權利要求1或2所述的對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，它是源于所述的wz基因、wzy基因或糖基轉移酶基因orf1、orf4、orf5、orf7基因；以及它們的混合或它們的重組。
5.按照權利要求4所述的對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，所述的源于orf1基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的1103至1120堿基的核苷酸和1877至1896堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的1194至1213堿基的核苷酸和1763至1780堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的1261至1279堿基的核苷酸和1686至1704堿基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的1976至1995堿基的核苷酸和3096至3114堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2145至2162堿基的核苷酸和2997至3014堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2249至2268堿基的核苷酸和2834至2850堿基的核苷酸；源于wzx基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的3183至3191堿基的核苷酸和4261至4278堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的3241至3257堿基的核苷酸和4091至4109堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的3301至3318堿基的核苷酸和3991至4019堿基的核苷酸；源于orf4基因的寡核苷酸對是SEQID NO1中的4441至4460堿基的核苷酸和5201至5220堿基的核苷酸；SEQ IDNO1中的4501至4520堿基的核苷酸和5115至5132堿基的核苷酸；SEQ IDNO1中的4601至4620堿基的核苷酸和5072至5088堿基的核苷酸；源于orf5基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的5311至5330堿基的核苷酸和5947至5965堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5401至5420堿基的核苷酸和5895至5912堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5501至5520堿基的核苷酸和5828至5846堿基的核苷酸；源于orf7基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的7059至7076堿基的核苷酸和7651至7668堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的7099至7106堿基的核苷酸和7521至7540堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的7161至7180堿基的核苷酸和7481至7500堿基的核苷酸。
6.權利要求1所述的對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸在檢測表達O-抗原的細菌、在診斷中鑒定細菌的O-抗原和細菌的其它多糖抗原的應用。
7.權利要求1所述的對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，而且通過插入表達可提供表達痢疾志賀氏菌8型的O-抗原，并成為細菌疫苗。
8.按照權利要求1所述的對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸的應用，其特征在于它作為引物用于PCR、作為探針用于雜交反應與熒光檢測、或者用于制造基因芯片或微陣列，檢測人體和環(huán)境中的細菌。
9.權利要求1所述的對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)痢疾志賀氏菌8型，離心收集細胞。用500ul50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細胞，37℃溫育20分鐘，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃ 30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇抽提兩次，取上清再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚。上清用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，將DNA重懸于30ul TE中；基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)通過PCR擴增痢疾志賀氏菌8型中的O-抗原基因簇以痢疾志賀氏菌8型的基因組為模板通過Long PCR擴增其O-抗原基因簇。首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇啟動子區(qū)的JumpStart序列設計上游引物(5’-ATT GTG GCTGCA GGG ATC AAA GAA AT-3’)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設計下游引物(5’-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C-3’)；用BoehringerMannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴增O-抗原基因簇，PCR反應程序如下在94℃預變性2分鐘；然后94℃變性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分鐘，這樣進行30個循環(huán)。最后，在68℃繼續(xù)延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的大小及其特異性。合并6管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構建O-抗原基因簇文庫用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構建O-抗原基因簇文庫，反應體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應在室溫中進行。酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應。合并4管同樣的反應體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中。隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃30分鐘，將酶切產(chǎn)物補成平端，75℃終止反應后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應的緩沖液并將體系擴大為80ul，70℃反應20分鐘，使DNA的3’端加dA尾。此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接24小時，總體積為90ul。其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶。最后用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物；用BiO-Rad公司的電轉化感受態(tài)細胞的制備方法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5a細胞，取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5a混合后，轉到BiO-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時間為5.0毫秒至6.0毫秒，電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃過夜培養(yǎng)，次日得到藍白菌落，將得到的白色菌落即白色克隆轉到含有氨卞青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時從每個克隆中提取質(zhì)粒，并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群構成了痢疾志賀氏8型的O-抗原基因簇文庫；(4)對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在700bp以上的120個克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自動測序儀對克隆中的插入片段單向進行測序，使序列達到90％的覆蓋率。剩余10％的序列再通過將部分序列反向測序，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學實驗室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列；序列的質(zhì)量主要由兩個方面來保證1)對痢疾志賀氏菌8型的基因組作6個Long PCR反應，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫。2)對每個堿基，保證3個以上高質(zhì)量的覆蓋率。在得到痢疾志賀氏菌8型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國國家生物技術信息學中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到7個開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對，最后得到痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇的結構；(6)特異基因的篩選針對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因設計引物；在每個基因內(nèi)各設計三對引物，每對引物分布在相應基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進行PCR，在其他組中都沒有擴增到任何大小正確的帶，即在大多數(shù)組中沒有得到任何PCR產(chǎn)物帶，雖然在少數(shù)組中得到PDR產(chǎn)物帶，但其大小不符合預期大小，所以wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因對痢疾志賀氏菌8型的O-抗原都是高度特異的。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對痢疾志賀氏菌8型(Shigelladysenteriae 8)的O－抗原特異的核苷酸，它是痢疾志賀氏菌8型中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ IDNO1所示的分離的核苷酸，全長9227個堿基；或者具有一個或多個插入、缺失或取代的堿基，同時保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸；還包括源于痢疾志賀氏菌8型的O－抗原基因簇中的糖基轉移酶基因和寡糖單位處理基因的寡核苷酸；本發(fā)明通過PCR證實寡核苷酸對痢疾志賀氏菌8型的O－抗原都有高度的特異性；本發(fā)明還公開了用本發(fā)明的寡核苷酸檢測和鑒定人體及環(huán)境中的痢疾志賀氏菌8型的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1429833SQ03100539
公開日2003年7月16日 申請日期2003年1月20日 優(yōu)先權日2003年1月20日
發(fā)明者王磊, 郭宏杰, 馮露 申請人:南開大學