專(zhuān)利名稱(chēng)：中國(guó)棉鈴蟲(chóng)基因工程病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別是一種能夠防治棉鈴蟲(chóng)和煙青蟲(chóng)等農(nóng)林害蟲(chóng)的中國(guó)棉鈴蟲(chóng)基因工程病毒。
中國(guó)棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核多角體病毒(Helicoverpa armigera singlenucleocapsid nucleopolyhedrovirus，以下簡(jiǎn)稱(chēng)野生型病毒或HaSNPV)已用于棉鈴蟲(chóng)和煙青蟲(chóng)的的防治。但由于它存在殺蟲(chóng)速度慢的缺陷，影響了其推廣應(yīng)用。為了提高該病毒的殺蟲(chóng)速度，陳新文等人已經(jīng)通過(guò)基因工程的方法構(gòu)建了缺失蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(EcdysteroidUDP-glucosyltransferase，簡(jiǎn)稱(chēng)egt)基因的重組棉鈴蟲(chóng)病毒-中國(guó)棉鈴蟲(chóng)病毒基因工程株1號(hào)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)工程病毒1號(hào))，以及缺失egt基因即蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因并插入蝎子昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素AaIT基因的雙重重組病毒-中國(guó)棉鈴蟲(chóng)重組病毒(以下簡(jiǎn)稱(chēng)工程病毒2號(hào))，并分別申請(qǐng)了專(zhuān)利(工程病毒1號(hào)申請(qǐng)?zhí)?9116683．3，保藏號(hào)CGMCC 0374；工程病毒2號(hào)申請(qǐng)?zhí)?0114307．7，保藏號(hào)CGMCC0419)。
本發(fā)明的目的是將先前的工作進(jìn)一步提高，利用基因工程的方法對(duì)野生型病毒進(jìn)行了雙重重組，提供一種殺蟲(chóng)速度更快、田間應(yīng)用效果更好的中國(guó)棉鈴蟲(chóng)基因工程病毒CGMCC0489。
本發(fā)明的目的是按下述方案實(shí)現(xiàn)的所提供的中國(guó)棉鈴蟲(chóng)基因工程病毒CGMCC0489(以下簡(jiǎn)稱(chēng)工程病毒3號(hào))，其基因組中缺失egt基因即蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，在缺失egt基因位點(diǎn)處，插入了由HaSNPV堿性DNA結(jié)合蛋白基因(p6．9)的啟動(dòng)子和多角體蛋白基因(ph)的啟動(dòng)子雙啟動(dòng)子控制的蝎子昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素(AaIT)基因以及熱休克蛋白基因(hsp70)啟動(dòng)子控制的標(biāo)記基因-半乳糖苷酶(LacZ)基因。工程病毒3號(hào)是利用基因工程的方法對(duì)野生型病毒通過(guò)二次重組而獲得的。
和現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明提供的工程病毒3號(hào)具有更快的殺蟲(chóng)速度和更好的田間應(yīng)用效果。請(qǐng)見(jiàn)附表和附


圖1生測(cè)結(jié)果表明，工程病毒3號(hào)對(duì)二齡棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的半致死時(shí)間(LT50)比野生型病毒縮短20．1％，比工程病毒1號(hào)縮短11％。田間試驗(yàn)結(jié)果表明工程病毒3號(hào)比野生型病毒和工程病毒1號(hào)、2號(hào)的殺蟲(chóng)效果明顯提高。
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
一．實(shí)施例1．本發(fā)明提供的工程病毒3號(hào)，其基因組中缺失了egt基因即蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄基轉(zhuǎn)移酶基因，在缺失egt基因位點(diǎn)處，插入由中國(guó)棉鈴蟲(chóng)病毒堿性DNA結(jié)合蛋白基因(p6．9)的啟動(dòng)子和該病毒的多角體蛋白基因啟動(dòng)子控制的昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素AaIT基因，以及熱休克蛋白基因(hsp70)啟動(dòng)子控制的標(biāo)記基因即β-半乳糖苷酶基因(LacZ)。AaIT基因的來(lái)源、作用、替換及插入位點(diǎn)同現(xiàn)有技術(shù)。標(biāo)記基因還可以用綠色熒光蛋白GFP基因等替換，也可以在重組病毒構(gòu)建好后刪除標(biāo)記基因。
2．本發(fā)明提供的工程病毒3號(hào)，其構(gòu)建方法包括以下步驟先進(jìn)行第一次重組，構(gòu)建重組病毒HaNPV GFP+egt-，即(1)將野生型病毒egt基因的5’端及上游序列、3’端及下游序列這兩個(gè)片段分別克隆到通用載體pBluescriptIIKS-(簡(jiǎn)稱(chēng)pKSPS-)(見(jiàn)Short，J．M．，1988，Nucleic Acid Research，167583)。
(2)在這兩個(gè)片段之間，利用分子生物技術(shù)在已刪除了egt基因編碼區(qū)的位點(diǎn)處，插入苜蓿銀紋夜蛾多核衣殼核多角體病毒(Autographacalifornica multicapsid nucleopolyhedrovirus，簡(jiǎn)稱(chēng)AcMNPV)的多角體蛋白基因啟動(dòng)子AcPph控制的綠色熒光蛋白GFP基因(見(jiàn)Boxer，S．G．，1996，Nature，383484)，獲得重組質(zhì)粒pHaGFP+egt-。
(3)將pHaGFP+egt-與HaSNPV的DNA共轉(zhuǎn)染宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞，通過(guò)等位基因交換，獲得缺失egt基因的重組病毒體HaNPV GFP+egt-。經(jīng)過(guò)多輪輪空斑純化，得到純的重組病毒HaNPV GFP+egt-。再進(jìn)行第二次重組，獲工程病毒3號(hào)，即先用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法從含p6．9基因的質(zhì)粒pCXW49中擴(kuò)增出p6．9基因的啟動(dòng)子序列，并克隆到T載體(pGEM-T)上，獲得含p6．9基因的啟動(dòng)子p69p的中間質(zhì)粒pGEMT-p69p。再應(yīng)用BamHI和XbaI雙酶切pGEMT-p69p，獲得帶雙酶切粘端的p69p，并把其克隆到用同樣的兩個(gè)酶消化的質(zhì)粒pHaegt--14A中，獲得中間質(zhì)粒pHaegt--p69p。然后在pHaegt--p69p上克隆進(jìn)作為篩選標(biāo)記的lacZ基因，得到中間質(zhì)粒pWHL4A。最后用BamHI酶從pXC6中剪切下蝎子昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素AaIT基因并克隆到pWHL4A中，得到含正向啟動(dòng)AaIT基因的轉(zhuǎn)移載體pWHL4A-AaIT。
(5)將pWHL4A-AaIT與重組病毒HaNPV GFP+egt-共轉(zhuǎn)染Hz2e5細(xì)胞。經(jīng)過(guò)多輪空斑純化，得到純的工程病毒3號(hào)HaNPV-CGMCC0489。
二．圖例說(shuō)明
圖1是工程病毒3號(hào)結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是野生型病毒、工程病毒1號(hào)、工程病毒2號(hào)及工程病毒3號(hào)處理后田間棉鈴蟲(chóng)的校正蟲(chóng)口減退率的柱形示意圖。圖例 為清水對(duì)照， 為野生型病毒， 為工程病毒1號(hào)， 為工程病毒2號(hào)； 為工程病毒3號(hào)；R校正蟲(chóng)口減退率(％)。
圖3是工程病毒3號(hào)的構(gòu)建過(guò)程示意圖其中pHaegt--14A為含egt基因的5’端及上游序列(即egt3’)、3’端及下游序列(即egt5’)、以及HaSNPV多角體蛋白基因啟動(dòng)子HaPph的質(zhì)粒；pAcDZl為含β-半乳糖苷酶基因的質(zhì)粒；pXC6為含蝎子昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素基因AaIT的質(zhì)粒。pGEM-p69p、pHaegt--p69p、pWHL4A及pWHL4A-AaIT為中間載體。AaIT為蝎子昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素基因。p69p為HaSNPV堿性DNA結(jié)合蛋白基因(p6．9)的啟動(dòng)子；HaPph為HaSNPV多角體蛋白基因(ph)的啟動(dòng)子；hsp70p為熱休克蛋白基因(hsp70)啟動(dòng)子。LacZ為β-半乳糖苷酶基因。HaNPVGFP+egt-為缺失egt-基因并插入GFP基因的重組中國(guó)棉鈴蟲(chóng)多角體病毒。
圖4顯示了圖3中重組病毒HaNPV GFP+egt-構(gòu)建過(guò)程。其中HaSNPV為中國(guó)棉鈴蟲(chóng)多角體病毒基因組DNA。p3、p4、p5為中間載體。pKSPS-為通用載體pBluescriptIIKS-。pGFP為含綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒。GFP為綠色熒光蛋白基因。AcPph為AcMNPV多角體蛋白基因的啟動(dòng)子。
本發(fā)明提供的工程病毒3號(hào)即中國(guó)棉鈴蟲(chóng)基因工程病毒，已于1999年10月9日提供保藏，保藏單位是位于北京中關(guān)村中國(guó)科學(xué)院微生物研究所內(nèi)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)是CGMCCNO．0489，保藏名稱(chēng)是“中國(guó)棉鈴蟲(chóng)病毒基因工程株3號(hào)”，分類(lèi)命名是“中國(guó)棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒基因工程株3號(hào)”(Genetically modifiedHelicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus No．3，請(qǐng)見(jiàn)存活性報(bào)告書(shū))。所提供的病毒培養(yǎng)物為昆蟲(chóng)病毒多角體，只能采用活體增殖。增殖方法以1×106個(gè)多角體／ml的濃度感染3齡中國(guó)棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)，然后置26-28℃培養(yǎng)5-7天，收集病死蟲(chóng)。檢測(cè)存活亦要求生物測(cè)定，即檢測(cè)病毒感染棉鈴蟲(chóng)的活性。
三．其它1．中國(guó)棉鈴蟲(chóng)基因工程病毒CGMCC0489的鑒定(1)利用限制性?xún)?nèi)切酶初步鑒定該病毒的正確性；(2)設(shè)計(jì)合適的引物，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法進(jìn)一步確定該病毒中egt基因的大部分編碼序列已被刪除，外源基因(AaIT和LacZ基因)已正確插入；(3)分析該病毒的蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，確定egt基因已經(jīng)失活。
(4)室內(nèi)生物活性測(cè)定以及田間藥效試驗(yàn)，確定病毒的效果。
2．本工程病毒可以通過(guò)蟲(chóng)體或細(xì)胞培養(yǎng)的方法大批量增殖，配制成可濕性粉劑或乳懸劑等劑型病毒殺蟲(chóng)劑，用于棉花、煙草、辣椒等作物上棉鈴蟲(chóng)及煙青蟲(chóng)的防治。該殺蟲(chóng)劑保留了野生型棉鈴蟲(chóng)病毒殺蟲(chóng)劑不傷害天敵、對(duì)環(huán)境的安全以及害蟲(chóng)不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。
下表是中國(guó)棉鈴蟲(chóng)野生型病毒及三種工程病毒田間殺蟲(chóng)效果比較
權(quán)利要求
1.一種對(duì)野生型病毒進(jìn)行雙重重組的中國(guó)棉鈴蟲(chóng)基因工程病毒CGMCC0489，在缺失了egt基因即蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的位點(diǎn)處，插入了由中國(guó)棉鈴蟲(chóng)病毒堿性DNA結(jié)合蛋白基因p6．9的啟動(dòng)子和多角體蛋白基因ph的啟動(dòng)子共同啟動(dòng)的蝎子昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素AaIT基因，以及由熱休克蛋白基因啟動(dòng)子控制的標(biāo)記基因β-半乳糖苷酶基因LacZ。
2.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的中國(guó)棉鈴蟲(chóng)基因工程病毒CGMCC0489的方法，包括以下步驟先進(jìn)行第一次重組，構(gòu)建重組病毒HaNPV GFP+egt-，即(1)將野生型病毒egt基因的5’端及上游序列、3’端及下游序列這兩個(gè)片段分別克隆到通用載體pBluescriptIIKS-，即pSKPS-；(2)在這兩個(gè)片段之間，利用分子生物技術(shù)在已刪除了egt基因編碼區(qū)的位點(diǎn)處，插入苜蓿銀紋夜蛾多核衣殼核多角體病毒的多角體蛋白基因啟動(dòng)子AcPph控制的綠色熒光蛋白GFP基因，獲得重組質(zhì)粒pHaGFP+egt-；(3)將pHaGFP+egt-與HaSNPV的DNA共轉(zhuǎn)染宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞，通過(guò)等位基因交換，獲得缺失egt基因的重組病毒體HaNPV GFP+egt-，經(jīng)過(guò)多輪空斑純化，得到純的重組病毒HaNPV GFP+egt-；再進(jìn)行第二次重組，獲重組工程病毒HaNPV-CGMCC0489，即(4)先用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法從含p6．9基因的質(zhì)粒pCXW49中擴(kuò)增出p6．9基因的啟動(dòng)子序列，并克隆到pGEM-T載體上，獲得含p6．9基因啟動(dòng)子p69p的中間質(zhì)粒pGEMT-p69p，再應(yīng)用BamHI和XbaI雙酶切pGEMT-p69p，獲得帶雙酶切粘端的p69p，并把其克隆到用同樣的兩個(gè)酶消化的質(zhì)粒pHaegt--14A中，獲得中間質(zhì)粒pHaegt--p69p，然后在pHaegt--p69p上克隆進(jìn)作為篩選標(biāo)記的lacZ基因，得到中間質(zhì)粒pWHL4A，最后用BamHI酶從pXC6中剪切下蝎毒毒素基因AaIT并克隆到pWHL4A中，得到含正向啟動(dòng)AaIT基因的轉(zhuǎn)移載體pWHL4A-AaIT；(5)將pWHL4A-AaIT與重組病毒HaNPV GFP+egt-共轉(zhuǎn)染Hz2e5細(xì)胞，再經(jīng)過(guò)多輪空斑純化，得到純的工程病毒HaNPV-CGMCC0489。
全文摘要
本發(fā)明是一種利用基因工程方法對(duì)野生型病毒進(jìn)行雙重重組的中國(guó)棉鈴蟲(chóng)基因工程病毒,其基因組中缺失了egt基因即蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因,在缺失egt基因的位點(diǎn)處,插入由中國(guó)棉鈴蟲(chóng)病毒堿性DNA結(jié)合蛋白基因(p6.9)的啟動(dòng)子及多角體蛋白基因(ph)的啟動(dòng)子共同控制的昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素AaIT基因以及由熱休克蛋白基因(hsp70)的啟動(dòng)子控制的標(biāo)記基因β－半乳糖苷酶(LacZ)基因。本發(fā)明比野生型病毒具有更快的殺蟲(chóng)速度和更好的田間應(yīng)用效果等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1291649SQ0013115
公開(kāi)日2001年4月18日 申請(qǐng)日期2000年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月16日
發(fā)明者王華林, 陳新文, 孫修煉, 胡志紅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所