專(zhuān)利名稱(chēng)：棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒穿梭表達(dá)載體及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒穿梭表達(dá)載體，還涉及該穿梭表達(dá)載體的制備方法。
背景技術(shù)：
桿狀病毒廣泛用于農(nóng)林害蟲(chóng)的生物防治。同時(shí)桿狀病毒-昆蟲(chóng)(細(xì)胞)系統(tǒng)還是十分優(yōu)良的真核表達(dá)系統(tǒng)，已用于外源基因、診斷試劑和疫苗等的研究和生產(chǎn)。和其它桿狀病毒一樣，中國(guó)棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒(Helicoverpaarmigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus，以下簡(jiǎn)稱(chēng)野生型病毒或HaSNPV)作為殺蟲(chóng)劑由于存在殺蟲(chóng)速度慢的缺點(diǎn)，致使其大面積控制棉鈴蟲(chóng)危害的作用受到限制；而不斷提高病毒表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量也一直是當(dāng)今生物工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。對(duì)桿狀病毒分子生物學(xué)的研究，特別是對(duì)病毒基因的結(jié)構(gòu)與功能的研究將有助于揭示病毒的復(fù)制和侵染規(guī)律，為重組病毒殺蟲(chóng)劑和快速、高效表達(dá)載體的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
自1983年Smith和Summers首次報(bào)道利用AcMNPV在Sf9細(xì)胞中表達(dá)人-β干擾素，桿狀病毒表達(dá)載體因其能在昆蟲(chóng)細(xì)胞和昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)中高效表達(dá)外源基因，且在大多數(shù)情況下桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有加工和修飾表達(dá)產(chǎn)物的能力，如信號(hào)肽的切割、糖基化和磷酸化作用以及大多數(shù)表達(dá)產(chǎn)物具有很高的生物活性等優(yōu)點(diǎn)，使其成為十分重要的真核表達(dá)系統(tǒng)。目前應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)已表達(dá)了幾百種不同來(lái)源的外源基因。
傳統(tǒng)的重組桿狀病毒構(gòu)建需要按以下兩步進(jìn)行首先必須將外源基因克隆到轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上，通常多克隆位點(diǎn)位于桿狀病毒的強(qiáng)啟動(dòng)子控制下。將轉(zhuǎn)移載體同桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染到昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)同源重組產(chǎn)生重組病毒，重組率通常在0.1-1％之間。其次需用空斑法鑒定和純化重組病毒。由于重組病毒的產(chǎn)生率低以及空斑純化法操作復(fù)雜、耗時(shí)，往往需數(shù)月甚至更長(zhǎng)的時(shí)間構(gòu)建一個(gè)完整的重組病毒。鑒于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)存在上述兩個(gè)缺陷，Kuckow發(fā)明了一種快速、有效產(chǎn)生重組桿狀病毒的方法，即Bac-to-Bac系統(tǒng)，能在7天內(nèi)完成重組病毒的構(gòu)建和外源基因的高效表達(dá)。該系統(tǒng)由Bacmid和pFastBacTM供體質(zhì)粒M兩部分組成。Bacmid含有一個(gè)低拷貝數(shù)的mini-F replicon、一個(gè)卡那霉素抗性基因和一個(gè)lacZα基因的8.5kb的DNA片段，一個(gè)作為細(xì)菌轉(zhuǎn)位子插入位點(diǎn)(mini-attTn7)的短片段插入到lacZα基因N-末端，該片段的插入并不改變lacZα基因的閱讀框。該Bacmid既能在E.coli內(nèi)復(fù)制又可在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制形成完整的病毒粒子。pFastBacTM供體質(zhì)粒則是由一個(gè)mini-Tn7轉(zhuǎn)位因子組成，在mini-Tn7左右臂之間插入有一個(gè)慶大霉素抗性基因、一個(gè)桿狀病毒特異強(qiáng)啟動(dòng)子、一個(gè)多克隆位點(diǎn)和SV40(A)poly信號(hào)序列組成的表達(dá)框。在輔助質(zhì)粒提供的轉(zhuǎn)位酶的作用下，克隆于pFastBacTM供體質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)的外源基因能轉(zhuǎn)位至Bacmid的mini-attTn7位點(diǎn)上，通過(guò)抗生素抗性篩選和藍(lán)白斑篩選鑒定重組Bacmid，隨后從E.coli內(nèi)提取BacmidDNA轉(zhuǎn)染到昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行外源基因的表達(dá)。該方法具有重組率高、重組病毒篩選方便等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒全基因組穿梭表達(dá)載體，能將外源基因快速插入棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒全基因組穿梭表達(dá)載體(HZ8)上，僅需要7-15天可獲得重組病毒，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源基因，同時(shí)在P10強(qiáng)啟動(dòng)子的調(diào)控下，高效表達(dá)外源基因，快速鑒定重組病毒。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供該多角體病毒穿梭表達(dá)載體的制備方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施將含有低拷貝數(shù)的mini-Freplicon、一個(gè)卡那霉素抗性基因和一個(gè)lacZα基因8.5kb的DNA片段插入到棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒基因組中的多角體基因內(nèi)，構(gòu)建了既能在E.coli內(nèi)復(fù)制又可在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制形成完整的病毒粒子的棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒HZ8(Ha-Bacmid)，最近我們?cè)趐FastDual質(zhì)粒的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了HapFastPhP10質(zhì)粒，并將eGFP基因插入到P10啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)，經(jīng)在DH10B受體菌中轉(zhuǎn)位后，將重組HZ8Ph+eGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HzAm1細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，至此我們已成功構(gòu)建一套完善的HaBac to Bac表達(dá)系統(tǒng)。棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒全基因組穿梭表達(dá)載體HaBacmid，保藏號(hào)CCTCC M201048。棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒全基因組穿梭表達(dá)載體HZ8轉(zhuǎn)化到Eschrichia Coli Dh10B株內(nèi)-80℃保藏。棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒全基因組穿梭表達(dá)載體(HZ8Bac)的構(gòu)建是利用同源重組的方法將一個(gè)含有低拷貝數(shù)的細(xì)菌DNA F復(fù)制因子(mini-F replicon)、一個(gè)卡那霉素抗性基因和一個(gè)lacZα基因、一個(gè)作為細(xì)菌轉(zhuǎn)位子插入位點(diǎn)(mini-attTn7)的短片段插入到lacZα基因N-末端的8.5kb的DNA片段置換到病毒基因組的多角體基因位點(diǎn)上，因此，所構(gòu)建的棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒全基因組穿梭表達(dá)載體(HZ8)是缺少多角體基因的重組病毒，用這種重組病毒感染棉鈴蟲(chóng)細(xì)胞(HzAm1)僅能產(chǎn)生細(xì)胞病變，但不能在細(xì)胞核內(nèi)形成包涵體，見(jiàn)圖。在利用供體質(zhì)粒(HapFastBac)將外源基因轉(zhuǎn)位到棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒全基因組穿梭表達(dá)載體(HZ8)的轉(zhuǎn)位子插入位點(diǎn)(mini-attTn7)，其DNA轉(zhuǎn)染棉鈴蟲(chóng)細(xì)胞(HzAm1)后，能形成具有感染性的重組病毒粒子，并能在多角體啟動(dòng)子和P10啟動(dòng)子控制下表達(dá)外源基因。與苜蓿銀紋夜蛾多粒包埋核型多角體病毒穿梭表達(dá)系統(tǒng)(AcBacmid)不同的是所構(gòu)建的供體質(zhì)粒(pFastPhP10)既有P10啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)又插入帶有多角體啟動(dòng)子序列的完整的多角體基因。
其優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)外源基因插入到P10控制下的多克隆位點(diǎn)后，經(jīng)轉(zhuǎn)位將外源基因和多角體基因同時(shí)插入到棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒全基因組穿梭表達(dá)載體(HaBcmid)中的轉(zhuǎn)位子插入位點(diǎn)，轉(zhuǎn)染到棉鈴蟲(chóng)細(xì)胞(HzAm1)后，能在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)是否形成包涵體，如細(xì)胞內(nèi)形成包涵體，證明轉(zhuǎn)染獲得成功，隨后可收集重組病毒粒子再感染細(xì)胞并可進(jìn)行外源基因表達(dá)水平的檢測(cè)。因此多角體基因的表達(dá)和包涵體的形成可作為轉(zhuǎn)染成功的重要識(shí)別標(biāo)記。另外，由于重新將多角體基因插入到病毒基因組，所產(chǎn)生的重組病毒是一個(gè)不缺失任何基因的重組病毒，因而該重組病毒不僅能在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)也可在昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)內(nèi)表達(dá)外源基因。另一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)是便于插入對(duì)昆蟲(chóng)有特異性毒殺作用的毒素基因，構(gòu)建高效、快速的重組病毒殺蟲(chóng)劑。


圖1為棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖；經(jīng)同源重組的方法將一個(gè)含有低拷貝數(shù)的細(xì)菌DNA復(fù)制子(mini-Freplicon)、一個(gè)卡那霉素抗性基因和一個(gè)lacZα基因、一個(gè)作為細(xì)菌轉(zhuǎn)位子插入位點(diǎn)(mini-attTn7)的短片段插入到lacZα基因N-末端的8.5kb的DNA片段置換到棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒(HaSNPV)基因組的多角體基因位點(diǎn)上，構(gòu)建能在昆蟲(chóng)細(xì)胞或昆蟲(chóng)體內(nèi)復(fù)制又可在細(xì)菌內(nèi)復(fù)制的棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒全基因組穿梭表達(dá)載體(HaBacmid)。
圖2為外源基因在棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒穿梭表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)示意圖；外源基因經(jīng)供體質(zhì)粒(HapFastPhP10)導(dǎo)入棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒全基因組穿梭表達(dá)載體(HaBacmid)內(nèi)隨后轉(zhuǎn)染到棉鈴蟲(chóng)細(xì)胞(HzAm1)內(nèi)表達(dá)外源基因的流程圖。
圖3為棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體穿梭表達(dá)載體DNA轉(zhuǎn)染棉鈴蟲(chóng)細(xì)胞的病理切片示意圖。
棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒全基因組穿梭表達(dá)載體(HaBacmid)感染棉鈴蟲(chóng)細(xì)胞(HzAm1)的病理切片。
具體實(shí)施例方式
其步驟如下1、含有HZ8(HaBacmid)和輔助質(zhì)粒的DH10B受體菌1的活化。將保存于-80℃ DH10B受體菌接種于含有卡那霉素(50μg/ml)和四環(huán)素(50μg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃，培養(yǎng)12-16小時(shí)，挑選單菌落接種到3mL含有卡那霉素(50μg/ml)和四環(huán)素(50μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，按常規(guī)方法制備感受態(tài)受體菌。
2、含有HapFastPhP10質(zhì)粒的DH5α菌的活化和HapFastPhP10質(zhì)粒2的提取。將保存于-80℃ DH5α受體菌接種于含有慶大霉素(50μg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃，培養(yǎng)12-16小時(shí)，挑選單菌落接種到3mL含有慶大霉素(50μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16小時(shí)，按常規(guī)提取質(zhì)粒的方法提取HapFastPhP10質(zhì)粒。
3、將外源基因連接到HapFASTPhP10質(zhì)粒3的多克隆位點(diǎn)中，隨后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有HZ8(HaBacmid)和輔助質(zhì)粒的DH10B受體菌中4，將受體菌放在1毫升含有四環(huán)素、卡拉霉素、慶大霉素的LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)4小時(shí)后，取100微升菌體接種于含有上述三種抗生素的X-的固體平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24小時(shí)。挑選白色菌種接種于3毫升含有上述三種抗生素的LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24小時(shí)。按常規(guī)方法提取插入有外源基因的質(zhì)粒HZ8(HaBacmid)DNA。
4、按照常規(guī)的轉(zhuǎn)染方法，利用脂質(zhì)體將含有外源基因的質(zhì)粒HZ8(HaBacmid)DNA轉(zhuǎn)染到HzAm1細(xì)胞內(nèi)28℃培養(yǎng)4-7天，在顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)是否有包涵體出現(xiàn)5。
5、利用常規(guī)方法檢測(cè)外源基因的表達(dá)量6。
權(quán)利要求
1.一種棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒穿梭表達(dá)載體，HZ8，HaBacmid，CCTCC M 201048。
2.一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒穿梭表達(dá)載體的制備方法，包括下列步驟A、含有HaBacmid和輔助質(zhì)粒的DH10B受體菌(1)的活化，將保存于-80℃DH10B受體菌接種于含有卡那霉素和四環(huán)素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)，挑選單菌落接種到3mL含有卡那霉素和四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，按常規(guī)方法制備感受態(tài)受體菌；B、含有pFastPhP10質(zhì)粒的DH5α菌的活化和pFastPhP10質(zhì)粒(2)的提取，將保存于-80℃ DH5α受體菌接種于含有慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)12-16小時(shí)，挑選單菌落接種到3mL含有慶大霉素的LB液體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16小時(shí)，按常規(guī)提取質(zhì)粒的方法提取HapFastPhP10質(zhì)粒；C、將外源基因連接到pFastPhP10質(zhì)粒(3)的多克隆位點(diǎn)中，隨后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有HaBacmid和輔助質(zhì)粒的DH10B受體菌中(4)，將受體菌放在含有四環(huán)素、卡拉霉素、慶大霉素的LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)4小時(shí)后，取100微升菌體接種于含有上述三種抗生素的X-的固體平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24小時(shí)。挑選白色菌種接種于含有上述三種抗生素的LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24小時(shí)，按常規(guī)方法提取插入有外源基因的質(zhì)粒HaBacmid DNA；D、照常規(guī)的轉(zhuǎn)染方法，利用脂質(zhì)體將含有外源基因的質(zhì)粒HaBacmid DNA轉(zhuǎn)染到HzAm1細(xì)胞內(nèi)28℃培養(yǎng)4-7天，在顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)是否有包涵體出現(xiàn)(5)。E、利用常規(guī)方法檢測(cè)外源基因的表達(dá)量(6)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒穿梭表達(dá)載體及構(gòu)建方法，將含有低拷貝數(shù)的細(xì)菌F復(fù)制子、卡那霉素抗性基因和β半乳糖苷酶基因、作為細(xì)菌轉(zhuǎn)位子插入位點(diǎn)的短片段插入到lacZα基因N－末端的8.5kb的DNA片段置換到病毒基因組的多角體基因位點(diǎn)上，利用供體質(zhì)粒將外源基因轉(zhuǎn)位到棉鈴蟲(chóng)單粒包埋核型多角體病毒穿梭表達(dá)載體的轉(zhuǎn)位子插入位點(diǎn)，其DNA轉(zhuǎn)染棉鈴蟲(chóng)細(xì)胞后，能形成具有感染性的重組病毒粒子，并能在多角體啟動(dòng)子和P10啟動(dòng)子控制下表達(dá)外源基因。本發(fā)明能將外源基因快速插入到HZ8表達(dá)載體上，獲得重組病毒，能高效表達(dá)外源基因，能通過(guò)多角體表型快速鑒定重組病毒。
文檔編號(hào)C12N7/01GK1429910SQ0113837
公開(kāi)日2003年7月16日 申請(qǐng)日期2001年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月31日
發(fā)明者王漢中, 陳新文, 胡志紅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所