一種細(xì)胞凍存液及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)胞凍存液及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)自1907年開創(chuàng)以來，歷經(jīng)一個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，已成為自然科學(xué)領(lǐng)域不可缺少的研究方法之一。在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一，具體而言，細(xì)胞凍存是指利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于O?-196°C的低溫保存，使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來，這樣在需要的時(shí)候再復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)或者其他用途。
[0003]在醫(yī)學(xué)方面，近年來干細(xì)胞的研究越來越被人們關(guān)注，由于它是一種具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，可分化為多種功能細(xì)胞。根據(jù)發(fā)育階段和取材來源，干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞兩大類。骨髓和臍血是成體干細(xì)胞的主要來源。骨髓干細(xì)胞在骨髓中含量極少，約占骨髓有核細(xì)胞的十萬分之一，所以要在臨床上廣泛應(yīng)用首先必須具備先進(jìn)的凍存與復(fù)蘇技術(shù)。而干細(xì)胞研究的深入將解決包括癌癥等一系列為人們所知的“絕癥”。而“冬眠”技術(shù)對(duì)醫(yī)學(xué)的發(fā)展有著里程碑式的意義。
[0004]對(duì)于細(xì)胞凍存技術(shù)，1972年，Mazur等首先根據(jù)中國倉鼠組織培養(yǎng)細(xì)胞的低溫保存實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，提出關(guān)于冷凍損傷的兩因素假說目，即冰晶損傷和溶液損傷假說。這個(gè)假說認(rèn)為隨著溫度的下降，細(xì)胞內(nèi)外的水分結(jié)冰，所形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞并引起細(xì)胞死亡。這種因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而致的細(xì)胞損傷即就是冰晶損傷(Intracellularice damage)。冰晶損傷是由冷卻速度過快造成，冷卻速度越快，冰晶損傷越大。同時(shí)隨著溫度的下降，細(xì)胞外部的水分會(huì)先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高，細(xì)胞膜上的脂質(zhì)會(huì)因長時(shí)問暴露在高溶質(zhì)的溶液中而受到損壞，細(xì)胞發(fā)生滲漏，導(dǎo)致在復(fù)溫時(shí)大量水分滲入細(xì)胞內(nèi)造成細(xì)胞死亡。這種因保存溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細(xì)胞損傷被稱為溶液損傷(SoIut1n damage)。溶液損傷是由冷卻速度過慢，使細(xì)胞在高濃度的溶液中暴露的時(shí)間過長而造成，冷卻速度越慢，此損傷越嚴(yán)重。
[0005]為解決上述問題，在細(xì)胞凍存過程中使用添加二甲基亞砜(DMSO)的細(xì)胞凍存液。但是DMSO也是一種對(duì)細(xì)胞毒性很大的化學(xué)試劑。培養(yǎng)液中殘存的DMSO是凍存細(xì)胞復(fù)蘇后出現(xiàn)細(xì)胞毒現(xiàn)象的主要原因，盡量去除DMSO是減少其對(duì)細(xì)胞毒性作用和保證細(xì)胞盡快恢復(fù)生長增殖的關(guān)鍵。另外，目前采用10%的DMSO和人血清白蛋白深低溫保存干細(xì)胞是最常用的方法，但加入藥品人血清白蛋白時(shí)，既增加冷凍保護(hù)劑的費(fèi)用，也可能增加輸注異體人體白蛋白產(chǎn)生不良反應(yīng)的機(jī)會(huì)。而用自體血漿代替人血清白蛋白，在冷凍和解凍過程中可能發(fā)生凝集和凝膠化。這是因?yàn)樽泽w外周血干細(xì)胞采集均是用血液成分離機(jī)完成的，血小板和有核細(xì)胞一起被富集。當(dāng)凍存物中有多量血小板時(shí)，血小板在深低溫保存和解凍的過程中將被活化，釋放出促凝物質(zhì)，導(dǎo)致凍存物中出現(xiàn)凝集和凝膠化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于現(xiàn)有技術(shù)中為保證凍存效果不得不在細(xì)胞凍存液中添加DMSO，由此帶來的對(duì)細(xì)胞的毒性作用，進(jìn)而提供一種既能夠達(dá)到DMSO對(duì)細(xì)胞凍存的效果，又能夠減少細(xì)胞毒性作用的細(xì)胞凍存液。
[0007]本發(fā)明還提供了所述凍存液的應(yīng)用方法。
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的細(xì)胞凍存液，包括人血白蛋白、AB血清、HBS中的兩種或者三種的混合物。
[0009 ] 優(yōu)選地，所述的細(xì)胞凍存液，包括人血白蛋白與AB血清。
[0010]優(yōu)選地，所述的細(xì)胞凍存液，包括AB血清與HBS。
[0011 ]優(yōu)選地，所述的細(xì)胞凍存液，包括人血白蛋白與HBS。
[0012]優(yōu)選地，所述細(xì)胞凍存液以復(fù)方電解質(zhì)注射液作為溶劑。
[0013]需要說明的是，所述人血白蛋白的英文名稱為Albumin Human，CAS號(hào)為70024-90-7;HBS的英文名稱為hemoglobin S，即血紅蛋白S;AB血清的英文名稱為AB-Human Serum。
[0014]本發(fā)明的應(yīng)用所述的細(xì)胞凍存液的方法，包括以下步驟:
[0015](I)檢測待凍存的細(xì)胞的細(xì)胞活率、誘導(dǎo)分化、端粒酶，并進(jìn)行核型分析；
[0016](2)取所述的細(xì)胞凍存液，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行凍存；
[0017](3)復(fù)蘇步驟2)中凍存的細(xì)胞；
[0018](4)檢測復(fù)蘇培養(yǎng)的細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活率、誘導(dǎo)分化、端粒酶，并進(jìn)行核型分析。
[0019]本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0020](I)本發(fā)明的細(xì)胞凍存液，包括人血白蛋白、AB血清、HBS中的兩種或者三種的混合物。本發(fā)明所述的細(xì)胞凍存液，未添加DMSO，可避免DMSO對(duì)細(xì)胞的毒性做用，更為重要的是，可以實(shí)現(xiàn)在不添加DMSO的情況下實(shí)現(xiàn)良好的細(xì)胞凍存的效果。
[0021](2)本發(fā)明的細(xì)胞凍存液對(duì)細(xì)胞有更好和更穩(wěn)定的保護(hù)作用，融解后活細(xì)胞比例為8513% ±6115% ;集落的回收率90158% ±9176%。
【附圖說明】
[0022]為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，其中，
[0023]圖1為生理鹽水和凍存液人工計(jì)數(shù)活率比較圖；
[0024]圖2為生理鹽水組和凍存液組保存后細(xì)胞貼壁能力變化圖；
[0025]圖3為凍存液組保存后核型分析對(duì)比圖；
[0026]圖4為流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]實(shí)施例1
[0028]本實(shí)施例的細(xì)胞凍存液，包括以下重量份的組分:人血白蛋白1g;AB血清1g。
[0029]其制備方法包括以下步驟:
[0030]按選定的重量份取人血白蛋白以及AB血清，與150ml復(fù)方電解質(zhì)注射液混合均勻，即得。
[0031]實(shí)施例2
[0032]本實(shí)施例的細(xì)胞凍存液，包括以下重量份的組分:AB血清10g;HBS1go
[0033]其制備方法包括以下步驟:
[0034]按選定的重量份取HBS以及AB血清，與120ml復(fù)方電解質(zhì)注射液混合均勻，即得。
[0035]實(shí)施例3
[0036]本實(shí)施例的細(xì)胞凍存液，包括以下重量份的組分:人血白蛋白1g;HBSlOg。<