一種細(xì)胞凍存液及其應(yīng)用與巨核祖細(xì)胞的凍存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種細(xì)胞凍存液及其應(yīng)用與巨核祖細(xì)胞的凍 存方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 巨核細(xì)胞祖細(xì)胞（megakaryocyteprogenitorcell)是一種使人們產(chǎn)生巨核細(xì)胞 的細(xì)胞，它是從骨髓祖（CFU-GEMM)而得，簡稱巨核祖細(xì)胞。巨核祖細(xì)胞存在于IL-6R-細(xì) 胞群中，而⑶34+細(xì)胞可分為兩個細(xì)胞亞群，表達(dá)IL-6R和不表達(dá)IL-6R，IL-6R+細(xì)胞能 被刺激形成粒-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞，而IL-6R-細(xì)胞當(dāng)被給予IL-6/sIL-6R時可 形成紅系及巨核系細(xì)胞。造血干細(xì)胞首先分化生成巨核系祖細(xì)胞，也稱巨核系集落形成單 位（colonyformingunit-megakaryocyte,CFU-Meg)。巨核系祖細(xì)胞分化成為成熟的巨核 細(xì)胞后，其邊緣部分破裂脫落，形成血小板，每個巨核細(xì)胞能生成1000-6000個左右的血小 板；巨核細(xì)胞雖然在骨髓的造血細(xì)胞中為數(shù)最少，僅占骨髓有核細(xì)胞總數(shù)的〇. 05%，但其 產(chǎn)生的血小板卻對機(jī)體的止血功能極為重要。
[0003] 如今惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一，目前主要是通過手術(shù)治療并結(jié) 合放化療。當(dāng)患者在接受高劑量放化療后，骨髓造血功能低下，常會出現(xiàn)血小板減少，嚴(yán)重 時會造成患者出血死亡。臨床上常采用輸注血小板，但血小板來源有限，存活期短，體外易 失活，且反復(fù)輸注血小板易導(dǎo)致輸注無效并增加輸血傳播疾病的危險。
[0004] 1997年，Bertolini等從外周血中分離⑶34+，體外誘導(dǎo)擴(kuò)增巨核細(xì)胞7天，用于 患者血小板恢復(fù)。結(jié)果顯示，體外誘導(dǎo)的巨核細(xì)胞可替代血小板輸入，或減少血小板輸入次 數(shù)。2000年，Paquette等將體外動員的外周血細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)擴(kuò)增巨核細(xì)胞9天后，用于改 善大劑量化療的乳腺癌病人中性粒細(xì)胞減少、血小板減少和貧血癥狀。VandenOudenrijn 等對外周血、骨髓、臍血來源的CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)臍血來源的CD34+具有 更強(qiáng)的巨核細(xì)胞擴(kuò)增能力。由于臍血造血干細(xì)胞移植后血小板的恢復(fù)較外周血、骨髓慢，因 此采用體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞，然后輸注患者體內(nèi)，進(jìn)一步發(fā)育成血小板， 縮短血小板的恢復(fù)期。
[0005] 可見，將巨核祖細(xì)胞用于惡性腫瘤的治療是目前的研究熱點(diǎn)，而為了能夠?qū)⒕藓?祖細(xì)胞能夠在體外長期保存，其凍存方法的研究也顯得尤為重要。如今，大多數(shù)巨核祖細(xì)胞 的凍存方法為把細(xì)胞加入DMS0:FBS:基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積比=1 :2 :7的凍存液配方中，分裝 至凍存管中，然后轉(zhuǎn)入凍存盒放進(jìn)-80°C冰箱中，最后轉(zhuǎn)入液氮中保存。該方法雖然能夠有 效地凍存細(xì)胞，但是復(fù)蘇后細(xì)胞活力偏低，而且復(fù)蘇后的細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)較慢，因此，研究一 種有效的巨核祖細(xì)胞的凍存方法，使細(xì)胞在東村后仍保持較好的活力十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種細(xì)胞凍存液及其應(yīng)用與巨核祖 細(xì)胞的凍存方法，本發(fā)明提供的凍存液能夠應(yīng)用于巨核祖細(xì)胞的凍存，能夠降低凍存期間 對細(xì)胞造成的損傷，復(fù)蘇后細(xì)胞活力較高。
[0007] 本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液，包括DMS0、胎牛血清、右旋糖酐、海藻糖和白蛋白。
[0008] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，DMS0、胎牛血清的體積比為（0. 5~1) : (4~6. 5)。
[0009] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，DMS0、胎牛血清的體積比為（0. 5~1) : (4. 5~5. 5)。
[0010] 在一些的實(shí)施例中，DMS0、胎牛血清的體積比為0. 5 :5. 5。
[0011] 在一些的實(shí)施例中，DMS0、胎牛血清的體積比為1 :4. 5。
[0012] 在一些的實(shí)施例中，DMS0、胎牛血清的體積比為1 :5。
[0013] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，右旋糖酐、海藻糖和白蛋白的質(zhì)量比為（50~100) : (10~ 20) : (80 ~120) 〇
[0014] 在一些實(shí)施例中，右旋糖酐、海藻糖和白蛋白的質(zhì)量比為5 :1 :12。
[0015] 在一些實(shí)施例中，右旋糖酐、海藻糖和白蛋白的質(zhì)量比為10 :1 :12。
[0016] 在一些實(shí)施例中，右旋糖酉干、海澡糖和白蛋白的質(zhì)量比為10 :2 :8。
[0017] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，右旋糖酐的終濃度為50mg/mL~100mg/mL;海藻糖的終濃 度為10mg/mL~20mg/mL;白蛋白的終濃度為80mg/mL~120mg/mL。
[0018] 在一些實(shí)施例中，右旋糖酐的終濃度為50mg/mL;海藻糖的終濃度為10mg/mL;白 蛋白的終濃度為120mg/mL。
[0019] 在一些實(shí)施例中，右旋糖酐的終濃度為100mg/mL;海藻糖的終濃度為10mg/mL;白 蛋白的終濃度為120mg/mL。
[0020] 在一些實(shí)施例中，右旋糖酐的終濃度為100mg/mL;海藻糖的終濃度為20mg/mL;白 蛋白的終濃度為80mg/mL。
[0021 ] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，右旋糖酐為低分子右旋糖苷。
[0022] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，白蛋白為人血白蛋白。
[0023] 作為優(yōu)選，每10mL細(xì)胞凍存液中包括DMS0 0. 5mL、胎牛血清5. 5mL、低分子右旋糖 酐50mg、海藻糖10mg、人血白蛋白120mg，余量為水。
[0024] 作為優(yōu)選，每10mL細(xì)胞凍存液中包括DMS0lmL、胎牛血清4. 5mL、低分子右旋糖酐 100mg、海藻糖10mg、人血白蛋白120mg，余量為水。
[0025] 作為優(yōu)選，每10mL細(xì)胞凍存液中包括DMS0lmL、胎牛血清5mL、低分子右旋糖酐 100mg、海藻糖20mg、人血白蛋白80mg，余量為水。
[0026] 二甲基亞砜（DMS0)是一種滲透性保護(hù)劑，能夠降低細(xì)胞冰點(diǎn)，減少冰晶的形成， 減輕自由基對細(xì)胞損害，改變生物膜對電解質(zhì)、藥物、毒物和代謝產(chǎn)物的通透性。
[0027] 胎牛血清（fetalbovineserum,FBS)含有各種血楽:蛋白、多肽、脂肪、碳水化合 物、生長因子、激素、無機(jī)物等，能夠提供蛋白酶抑制劑，使在細(xì)胞傳代時使剩余胰蛋白酶失 活，保護(hù)細(xì)胞不受傷害。
[0028] 海藻糖（D_(+)-Trehalosedihydrate)具有穩(wěn)定生物膜（細(xì)胞膜）和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 及抗干燥的作用，可用于生物制品保護(hù)。
[0029] 右旋糖酐分為有高分子右旋糖酐（平均分子量10萬-20萬）、中分子右旋糖酐（平 均分子量6萬-8萬）、低分子右旋糖酐（平均分子量2萬-4萬）、小分子右旋糖酐（平均 分子量1萬-2萬）。本發(fā)明采用的低分子右旋糖酐為右旋糖酐40,其作為藥物使用除可以 擴(kuò)充血容量的作用外，還可以降低血液粘滯性，改善微循環(huán)。右旋糖酐還有利于降低細(xì)胞的 粘滯性。
[0030] 白蛋白（又稱清蛋白，albumin，Alb)是血漿中含量最多、分子最小、溶解度大、功 能較多的一種蛋白質(zhì)，具有保護(hù)血細(xì)胞保護(hù)和調(diào)節(jié)凝血的功能，有利于防止細(xì)胞成團(tuán)。
[0031] 本發(fā)明將胎牛血清和DMS0混合，并在其中添加白蛋白、海藻糖和右旋糖酐，從而 能夠很好的保護(hù)細(xì)胞活性不受損傷。實(shí)驗(yàn)表明，采用本發(fā)明提供的凍存液對巨核祖細(xì)胞進(jìn) 行凍存，一個月后，檢測細(xì)胞復(fù)蘇后存活率可達(dá)94 %，且具有良好的增殖效果。
[0032] 本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液的制備方法為：將右旋糖酐、海藻糖和白蛋白依次加入 胎牛血清后，加入DMS0,制得細(xì)胞凍存液。
[0033] 本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液于4°C保存。
[0034] 本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液在凍存巨核祖細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0035] 本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液能夠很好的維持巨核祖細(xì)胞在凍存期間的細(xì)胞活性，降 低凍存和復(fù)蘇過程對細(xì)胞造成的損傷。實(shí)驗(yàn)表明，采用該凍存液凍存巨核祖細(xì)胞一個月后 細(xì)胞復(fù)蘇后活力可達(dá)94%，且增殖活力良好。顯著優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)。
[0036] 本發(fā)明還提供了巨核祖細(xì)胞的凍存方法，以本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液凍存巨核祖 細(xì)胞。
[0037] 本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液，包括DMS0、胎牛血清、右旋糖酐、海藻糖和白蛋白。
[0038] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，細(xì)胞凍存液于4°C預(yù)冷。
[0039] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，凍存的降溫程序?yàn)椋?°C保持5min;
[0040] 以_1°C/min的速度降溫至-4°C;
[0041] 以-12°C/min的速度降溫至-50°C;
[0042] 以15°C/min的速度升溫至-28°C;
[0043] -28°C保持 4min;
[0044] 以_1°C/min的速度降溫至-55°C;
[0045] 以_10°C/min的速度降溫至-90°C;
[0046] -9(TC保持 5min;
[0047] -80°C保持 7d;
[0048] 液氮保存。
[0049] 本發(fā)明提供的凍存降溫程序較為柔和，經(jīng)過本發(fā)明提供的降溫程序，再將細(xì)胞置 于液氮中保存，對細(xì)胞活力的影響較小，降低了凍存過程中對細(xì)胞造成的傷害。
[0050] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，巨核祖細(xì)胞在本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液中的密度為5X106 個/mL〇
[0051]本發(fā)明提供了一種細(xì)胞凍存液及其在巨核祖細(xì)胞凍存中的應(yīng)用，以及凍存巨核祖 細(xì)胞的方法，本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液中包括DMS0、胎牛血清、右旋糖酐、海藻糖和白蛋白。 該細(xì)胞凍存液能夠很好的維持巨核祖細(xì)胞在凍存期間的細(xì)胞活性，降低凍存和復(fù)蘇過程對 細(xì)胞造成的損傷。本發(fā)明提供的凍存降溫程序較為柔和，經(jīng)過本發(fā)明提供的降溫程序，再將 細(xì)胞置于液氮中保存，對細(xì)胞活力的影響較小，降低了凍存過程中對細(xì)胞造成的傷害。實(shí)驗(yàn) 表明，采用該凍存液凍存巨核祖細(xì)