具有改變含量的甾體糖苷生物堿的植物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及留體生物堿的生物合成中的關(guān)鍵基因以及具有改變含量的留體生物 堿的遺傳修飾植物，特別是具有降低含量的抗營養(yǎng)留體糖苷生物堿的茄果類作物。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物王國產(chǎn)生通常具有屬或科特異性的無數(shù)種不同的小化合物。這些分子(稱為 次級代謝產(chǎn)物)對于產(chǎn)生其的細胞不是至關(guān)重要的，但促進生物體的整體健康。生物堿是次 級代謝產(chǎn)物的一個實例。它們是通常具有雜環(huán)結(jié)構(gòu)的低分子量含氮有機化合物。植物中的 生物堿生物合成在發(fā)育期間以及響應(yīng)于應(yīng)力和病原體而受到嚴格控制。
[0003] -組廣泛的三萜類-生物堿化合物普遍存在于植物中并且源自細胞質(zhì)甲羥戊酸類 異戊二烯生物合成途徑。留體皂苷和留體生物堿是由植物產(chǎn)生的三萜類化合物的兩大類 另IJ。甾體生物堿(SA)(也稱為"茄屬生物堿"）是屬于茄科、特別是茄屬的眾多植物的常見成 分。百合科中的大量物種也產(chǎn)生留體生物堿。
[0004] 據(jù)估計在大約1350個物種中，茄屬是開花植物的最大屬之一，約占茄科中的物種 的一半。不同的結(jié)構(gòu)組成和生物活性以及在包括番前（Solanum lycopersicum)、馬鈴薯 (Solanum tuberosum)和前子（Solanum melongena)的食用植物中的出現(xiàn)使得SA成為廣泛 研究的主題(Eich E.2008.茄科和旋花科-次級代謝產(chǎn)物:生物合成、化學(xué)分類學(xué)、生物學(xué)和 經(jīng)濟意義：手冊（Solanaceae and Convolvulaceae-secondary metabolites: biosynthesis,chemotaxonomy,biological and economic significance:a handbook) .Berlin:Springer)〇
[0005] SA由C-27膽甾烷骨架和雜環(huán)氮組分組成，它被認為是在細胞質(zhì)中由膽固醇合成 的。膽固醇轉(zhuǎn)化成氨基醇SA應(yīng)該需要若干羥基化、氧化和氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)(Eich 2008,同上）， 并且在大多數(shù)情況下進一步糖基化以形成留體糖苷生物堿(SGA)(Arnqvist L.等,2003.植 物生理學(xué)(Plant Physiol)131:1792-1799) AGA的低聚糖部分組分直接結(jié)合至在氨基醇甾 體骨架的C-30處的羥基(糖苷配基）。所述低聚糖部分包括D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、 D-木糖和L-阿拉伯糖，前兩種單糖是主要單元。
[0006] SGA生物合成取決于編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)的基因，其用各種糖部分裝飾糖苷 配基(McCue K F等，20054直物科學(xué)(Plant Sci.)168:267-273;Itkin Μ等，20114直物細胞 (Plant Cell )23:4507-4525)。番茄糖苷生物堿代謝 1(GLYC0ALKAL0ID METABOLISM 1/ GAME1)糖基轉(zhuǎn)移酶(馬鈴薯SGT1的同源物）(McCue等，2005,同上)催化氨基醇番茄堿的半乳 糖基化（Itkin等，2011，同上）。
[0007] 留體生物堿在保護植物抵抗廣泛多種病原體中起作用，并且因此被稱為植物抗菌 素(口1^1:〇&111:;[(^?;[11)(抗微生物化合物）。許多364對包括哺乳動物和人類的生物體是有害 的。當(dāng)存在于可食用植物部分中時，這些有害的SGA被稱為抗營養(yǎng)物質(zhì)。SGAa-茄堿和α-查茄 堿是馬鈴薯中的主要有毒物質(zhì)。這些SGA造成胃腸道和神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，并且在高濃度下可能 對人類是致命的。毒性機制包括細胞膜的破壞和乙酰膽堿酯酶活性的抑制（Roddick J 6.1989.植物化學(xué)(？1^丨0(^61^8杜7)28:2631-2634)。為此，超過20011^/1^食用塊莖鮮重的 總SGA水平被認為對于人類食用是不安全的。
[0008] 正在嘗試闡明留體生物堿的生物合成途徑和控制其產(chǎn)生。美國專利No. 5，959，180 公開了編碼酶茄啶UDP-葡萄糖葡糖基轉(zhuǎn)移酶(SGT)的來自馬鈴薯的DNA序列。此外公開了用 于抑制SGT產(chǎn)生并從而降低茄果類植物例如馬鈴薯中的糖苷生物堿水平的手段和方法。
[0009] 類似地，美國專利No. 7，375，259和7，439，419公開了分別編碼酶UDP-葡萄糖:茄啶 葡糖基轉(zhuǎn)移酶（SGT2)和β-茄堿/β-查茄堿鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶（SGT3)的來自馬鈴薯的核酸序 列。此外描述了含有所述序列的重組DNA分子和其用途，特別是，使用所述序列和反義構(gòu)建 體來抑制SGT2/SGT3的產(chǎn)生并從而降低茄果類植物如馬鈴薯中的主要留體糖苷生物堿α-查 前堿和α-前堿的水平。
[0010] 本發(fā)明的發(fā)明人最近鑒定了據(jù)推定參與番茄留體生物堿（糖苷生物堿代謝1-3 (GAME 1-3))代謝的三種糖基轉(zhuǎn)移酶。更具體地，GAME 1表達的改變更改了番茄植物中的生殖 和營養(yǎng)部分中的SA分布。表明這些基因部分地通過產(chǎn)生番前四糖部分而參與番前堿(α-番 茄素前體)的代謝(Itkin等，2011，同上）。
[0011]國際專利申請公開No.W0 00/66716公開了用于制造包含編碼甾醇糖基轉(zhuǎn)移酶的 DNA序列的轉(zhuǎn)基因生物體或細胞的方法。所述轉(zhuǎn)基因生物體包括細菌、真菌、植物和動物，其 相比于野生型生物體或細胞展現(xiàn)類固醇糖苷、類固醇生物堿和/或留醇糖苷的產(chǎn)生增加。所 合成的化合物可用于制藥和食品工業(yè)中以及用于保護植物。
[0012] 美國專利申請公開No. 2012/0159676公開了源自屬于茄科的植物例如馬鈴薯 (Solanum tuberosum)的編碼糖苷生物堿生物合成酶的基因。此外公開了使用編碼所述蛋 白質(zhì)的基因來制造/檢測新穎生物體的方法。
[0013] 美國專利申請公開No. 2013/0167271和國際申請公開No.W0 2012/095843涉及在 甾體皂苷和留體生物堿的生物合成中的關(guān)鍵基因以及用于改變留體皂苷和留體生物堿的 基因表達和產(chǎn)生的手段和方法。
[0014] 在本發(fā)明的優(yōu)先權(quán)日期后公布的本發(fā)明的發(fā)明人的論文描述了參與SGA生物合成 的一系列10種基因。發(fā)現(xiàn)所述基因中的5-7種以簇形式存在于7號染色體上，而另外兩種相 鄰位于重復(fù)的基因組區(qū)域中的12號染色體上。遵循系統(tǒng)功能分析，已提出了從膽固醇起始 直至連接到番茄SGA糖苷配基的四糖部分的新穎SGA生物合成途徑（Itkin M.等，2013科學(xué) (Science)341(6142):175-179)。
[0015] 對于更高食品數(shù)量和食品品質(zhì)提高的需求不斷增加。非常需要改善營養(yǎng)品質(zhì)以及 除去抗營養(yǎng)特性。在作物馴化的過程中，通過育種降低抗營養(yǎng)素的水平。然而，茄果類作物 仍含有顯著量的抗營養(yǎng)物質(zhì)，特別是留體糖苷生物堿。
[0016]因此，需要用于控制茄果類植物中的留體生物堿的產(chǎn)生，用于獲得高品質(zhì)無毒食 品以及用于產(chǎn)生具有有益的、特別是治療性作用的留體生物堿的手段和方法，并且其將是 非常有利的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]本發(fā)明涉及在將膽固醇轉(zhuǎn)化成留體糖苷生物堿(SGA)的生物合成途徑中的關(guān)鍵基 因和酶，其可用于調(diào)節(jié)留體生物堿的表達和可用于植物中。特別地，本發(fā)明涉及具有降低含 量的抗營養(yǎng)生物堿的轉(zhuǎn)基因茄果類植物。
[0018] 本發(fā)明是部分地基于如下出乎意料的發(fā)現(xiàn):SGA在茄果類植物中的生物合成涉及 一系列基因，其中所述基因中的5-7種(取決于植物物種)簇集在7號染色體上并且另外兩種 基因相鄰位于重復(fù)基因組區(qū)域中的12號染色體上。發(fā)現(xiàn)若干調(diào)芐基因（包括轉(zhuǎn)錄因子)與成 簇基因共表達。調(diào)節(jié)陣列內(nèi)的特定基因的表達能夠嚴格控制留體生物堿和其糖基化衍生物 的產(chǎn)生。出乎意料的是，調(diào)節(jié)單一基因或轉(zhuǎn)錄因子的表達導(dǎo)致番茄植物中的茄堿和/或查茄 堿以及番茄植物中的番茄素的含量顯著升高/降低。特別是，本發(fā)明現(xiàn)在表明，調(diào)節(jié)單一轉(zhuǎn) 錄因子(本文稱為GAME9轉(zhuǎn)錄因子)導(dǎo)致對于馬鈴薯塊莖皮中的留體糖苷生物堿的產(chǎn)生的嚴 格控制。抑制編碼2_酮戊二酸依賴性雙加氧酶的基因(GAME11)的表達導(dǎo)致番茄植物中α-番 茄素水平的顯著降低和若干膽留烷醇型皂苷的累積。
[0019] 根據(jù)一個方面，本發(fā)明提供一種遺傳修飾植物，其包含具有至少一種基因的改變 的表達的至少一個細胞，所述至少一種基因選自編碼GAME9轉(zhuǎn)錄因子的基因、編碼2-酮戊二 酸依賴性雙加氧酶(GAME11)的基因、編碼堿性螺旋-環(huán)-螺旋(BHLH)轉(zhuǎn)錄因子的基因或其組 合，其中所述遺傳修飾植物相比于相應(yīng)的未被修飾的植物具有改變含量的至少一種留體生 物堿或其糖基化衍生物。
[0020] 根據(jù)某些實施方案，所述遺傳修飾植物相比于相應(yīng)的未被修飾的植物具有編碼 GAME9轉(zhuǎn)錄因子的基因的改變的表達。根據(jù)示例性實施方案，所述GAME9轉(zhuǎn)錄因子包含與SEQ ID NO: 1具有至少80%同源性的氨基酸序列。根據(jù)一些實施方案，所述GAME9轉(zhuǎn)錄因子包含 以SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列。根據(jù)其他實施方案，所述GAME9轉(zhuǎn)錄因子包含以SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。
[0021 ] 根據(jù)其他實施方案，所述編碼GAME9轉(zhuǎn)錄因子的基因（本文稱為GAME9)包含以SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6中的任一個所示的核酸序列。
[0022]根據(jù)其他實施方案，所述遺傳修飾植物具有編碼2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶 (GAME11)的基因的改變的表達。根據(jù)示例性實施方案，所述2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶包 含與SEQ ID N0:7具有至少80%同源性的氨基酸序列。根據(jù)一些實施方案，所述2-酮戊二酸 依賴性雙加氧酶包含以SEQ ID N0:7所示的氨基酸序列。根據(jù)其他實施方案，所述2-酮戊二 酸依賴性雙加氧酶包含以SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列。
[0023]根據(jù)其他實施方案，所述編碼2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶的基因（本文稱為 GAME11)包含以SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11和SEQIDN0:12中的任一個所 示的核酸序列。
[0024]根據(jù)其他實施方案，所述遺傳修飾植物相比于相應(yīng)的未被修飾的植物具有編碼 BHLH轉(zhuǎn)錄因子的基因的改變的表達。根據(jù)示例性實施方案，所述BHLH轉(zhuǎn)錄因子包含與SEQ ID N0:13具有至少80%同源性的氨基酸序列。根據(jù)一些實施方案，所述BHLH轉(zhuǎn)錄因子包含 以SEQ ID N0:13所示的氨基酸序列。
[0025] 根據(jù)其他實施方案，所述編碼BHLH轉(zhuǎn)錄因子的基因（本文稱為BHLH)包含以SEQ ID N0:14、SEQIDN0:15、SEQIDN0:16和SEQIDN0:17中的任一個所示的核酸序列。
[0026]根據(jù)其他實施方案，所述遺傳修飾植物相比于相應(yīng)的未被修飾的植物包含具有編 碼GAME9轉(zhuǎn)錄因子的基因、編碼2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶的基因和編碼(BHLH)轉(zhuǎn)錄因子 的基因的改變的表達的至少一個細胞。
[0027] 根據(jù)某些實施方案，所述植物是茄果類植物。根據(jù)某些示例性實施方案，所述茄果 類植物選自馬鈴薯、番茄和茄子。
[0028] 根據(jù)某些實施方案，至少一種基因或其任何組合在遺傳修飾植物中的表達相比于 其在相應(yīng)的未被修飾的植物中的表達得到抑制，從而所述遺傳修飾植物相比于所述相應(yīng)的 未被修飾的植物包含降低含量的至少一種留體生物堿或其糖基化衍生物。根據(jù)某些示例性 實施方案，所述遺傳修飾植物包含無毒量的抗營養(yǎng)留體生物堿或其糖基化衍生物。
[0029] 應(yīng)理解，可通過各種手段來抑制至少一種基因或其組合的表達，所有手段都明確 涵蓋于本發(fā)明的范圍內(nèi)。根據(jù)某些實施方案，可以使用干擾轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的多種分子在基 因組和/或轉(zhuǎn)錄物水平下抑制GAME9、GAME 11或BHLH的表達，所述分子包括(但不限于)反義、 siRNA、核糖酶或脫氧核酶分子。還可以使用向至少一種基因中插入突變，包括缺失、插入、 位點特異性突變、鋅指核酸酶等，只要所述突變導(dǎo)致基因表達的下調(diào)即可。根據(jù)其他實施方 案，使用拮抗劑、裂解多肽的酶在蛋白質(zhì)水平下抑制表達。
[0030] 根據(jù)某些示例性實施方案，所述遺傳修飾植物是一種轉(zhuǎn)基因植物，其包含含有靶 向選自GAME9、GAME 11、BHLH或其組合的基因的至少一種沉默分子的至少一個細胞。每種可 能性代表著本發(fā)明的另一個實施方案。根據(jù)一些實施方案，所述至少一種沉默分子選自RNA 干擾分子和反義分子。根據(jù)這些實施方案，所述轉(zhuǎn)基因植物相比于非轉(zhuǎn)基因植物包含降低 含量的至少一種留體生物堿或其糖基化衍生物。根據(jù)某些實施方案，所述至少一種留體生 物堿是留體糖苷生物堿。根據(jù)某些示例性實施方案，所述留體糖苷生物堿選自α-茄堿、α-查 前堿、澳洲前邊堿(solmargine)、澳洲前堿(solasonine)、番前素、番前堿和其衍生物。
[0031] 根據(jù)一些實施方案，所述轉(zhuǎn)基因植物包含多個細胞，所述細胞包含靶向選自 GAME9、GAME11和BHLH的至少一種基因的沉默分子。根據(jù)其他實施方案，大多數(shù)植物細胞包 含沉默分子。
[0032] 根據(jù)某些實施方案，包含至少一種沉默分子的轉(zhuǎn)基因植物是具有降低含量的選自 茄堿、澳洲茄邊堿、澳洲茄堿和查茄堿的至少一種留體糖苷生物堿的茄果類作物。根據(jù)某些 實施方案，所述茄果類作物是馬鈴薯。根據(jù)其他實施方案，所述茄果類作物是茄子。
[0033] 根據(jù)其他實施方案，包含至少一種沉默分子的轉(zhuǎn)基因植物是具有降低含量的番前 素、番茄堿或其衍生物的番茄植物。
[0034] 可以設(shè)計作為GAME9、GAME11和BHLH中的至少一種的靶標的沉默分子是本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的。根據(jù)某些實施方案，所述沉默分子包含具有與GAME9基因或