本發(fā)明屬于細胞冷藏保存領域，具體涉及一種干細胞冷藏保存液及其制備方法與應用。

背景技術(shù)：

1、干細胞是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞，主要分為胚胎干細胞、誘導多能干細胞和成體干細胞。間充質(zhì)干細胞是一種成體干細胞，存在于臍帶、脂肪、牙髓和骨髓等組織中，具有自我更新和分化為多種組織細胞的潛力。它們在免疫調(diào)節(jié)、組織修復和再生醫(yī)學中具有廣泛的應用。在臨床應用中，間充質(zhì)干細胞的保存是一個關(guān)鍵步驟，需要確保細胞活性和功能的維持。冷藏保存液用于暫時儲存間充質(zhì)干細胞，以保持其細胞活性。這對于缺乏長期儲存條件或需要在短時間內(nèi)使用的臨床應用場景非常重要，適當?shù)谋４鏁r間可以確保細胞在回輸或使用時保持最佳狀態(tài)。

2、冷藏保存液即在2℃-8℃條件下可以通過降低細胞的代謝活動來實現(xiàn)短期內(nèi)的細胞保存，避免細胞在常溫或37℃環(huán)境中的高代謝活動，減少氧自由基和脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，從而保護細胞?，F(xiàn)有技術(shù)中干細胞保存液中多含有二甲基亞砜，是一種滲透性保護劑，但二甲基亞砜存在一定的毒性作用，可與蛋白質(zhì)疏水基團發(fā)生作用，導致蛋白質(zhì)變性。此外，現(xiàn)有技術(shù)中的干細胞保存液很多無法長時間在2℃-8℃條件下維持干細胞的存活率，需要超低溫保存細胞，增加了保存及運輸成本。因此，有必要研發(fā)一種無需超低溫也能維持較長時間干細胞存活率，成分明確，安全無毒的干細胞冷藏保存液。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種即用型干細胞冷藏保存液。該冷藏保存液無血清、無蛋白、無dmso，化學成分明確，安全無毒，使用后無需離心換液，可直接輸注。此外，可以較長時間在低溫(2-8℃)條件下維持干細胞高活性和高質(zhì)量，為細胞治療提供可靠的細胞資源。

2、本發(fā)明的第二個目的在于提供一種上述干細胞冷藏保存液的制備方法。

3、本發(fā)明的第三個目的在于提供上述干細胞冷藏保存液在干細胞冷藏保存中的應用。

4、為達到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案。

5、第一方面，本發(fā)明提供了一種干細胞冷藏保存液，所述干細胞冷藏保存液包含如下組分：10-50g/l甘露醇、1-20g/l棉子糖五水合物、10-50g/l羥乙基淀粉、0.01-5g/l別嘌呤醇、1-5g/l谷胱甘肽、1-50μm槲皮素、1-50μm丹參酮、0.1-5g/l氯化鈉、0.1-5g/l氯化鉀、0.1-5g/l醋酸鈉、0.01-1g/l葡萄糖酸鎂、1-20g/l葡萄糖，10-50g/l蔗糖、1-10g/l腺嘌呤鹽酸鹽、1.5-3mm二丁酰環(huán)磷腺苷。

6、進一步地，所述干細胞冷藏保存液包含如下組分：10-45g/l甘露醇、1-15g/l棉子糖五水合物、10-45g/l羥乙基淀粉、0.01-4g/l別嘌呤醇、1-4g/l谷胱甘肽、1-45μm槲皮素、1-40μm丹參酮、0.1-4g/l氯化鈉、0.1-4g/l氯化鉀、0.1-4g/l醋酸鈉、0.01-0.5g/l葡萄糖酸鎂、1-15g/l葡萄糖、10-45g/l蔗糖、1-5g/l腺嘌呤鹽酸鹽、1.5-2.5mm二丁酰環(huán)磷腺苷。

7、進一步地，所述干細胞冷藏保存液包含如下組分：10g/l甘露醇、10g/l棉子糖五水合物、45g/l羥乙基淀粉、0.01g/l別嘌呤醇、1g/l谷胱甘肽、45μm槲皮素、40μm丹參酮、1g/l氯化鈉、0.1g/l氯化鉀、0.1g/l醋酸鈉、0.05g/l葡萄糖酸鎂、1g/l葡萄糖、10g/l蔗糖、1g/l腺嘌呤鹽酸鹽、2mm二丁酰環(huán)磷腺苷。

8、進一步地，所述保存液的ph為6.0-7.5。

9、進一步地，所述保存液的滲透壓為300～370mosm/kg。

10、第二方面，本發(fā)明提供了一種上述干細胞冷藏保存液的制備方法，該制備方法包括將所述組分按照預設濃度溶解于水中進行配制，調(diào)節(jié)ph至6.0-7.5，調(diào)節(jié)滲透壓至300～370mosm/kg，0.22μm濾器過濾除菌分裝后，2-8℃避光保存。使用時無需進一步制備，為即用型保存液。

11、第三方面，本發(fā)明提供了上述干細胞冷藏保存液在干細胞冷藏保存中的應用。

12、進一步地，所述干細胞選自臍帶干細胞、脂肪干細胞、牙髓干細胞或骨髓干細胞等。

13、進一步地，冷藏溫度為2-8℃；

14、進一步地，冷藏時間為7天以內(nèi)。

15、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，干細胞冷藏保存的方法包括：所述干細胞冷藏保存液同時支持低密度和高密度細胞保存，使用所述干細胞冷藏保存液重懸待保存的干細胞，調(diào)整細胞密度至0.5×106-1×108/ml，放置于2-8℃冷藏保存。

16、本發(fā)明的有益效果如下：

17、本發(fā)明主要采用羥乙基淀粉、棉子糖五水合物、甘露醇作為非滲透性物質(zhì)，有助于細胞滲透壓穩(wěn)定，防止細胞外腫脹，并且在細胞冷藏和復蘇過程中，可以減少細胞因滲透壓變化而產(chǎn)生的損傷。

18、本發(fā)明采用別嘌呤醇、谷胱甘肽、甘露醇、槲皮素作為抗氧化劑，可以清除氧自由基，進而減少在冷藏中細胞的氧化損傷。

19、本發(fā)明采用氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉作為電解質(zhì)平衡鹽溶液，用于維持細胞膜的完整性和穩(wěn)定性。

20、本發(fā)明采用葡萄糖、蔗糖、腺嘌呤鹽酸鹽作為能量底物，因細胞在冷藏條件下代謝活動緩慢，需要蔗糖和腺嘌呤鹽酸鹽維持細胞的基本功能，有助于細胞在冷藏過程中的保護和冷藏后保存后細胞的功能恢復。

技術(shù)特征：

1.一種干細胞冷藏保存液，其特征在于，所述干細胞冷藏保存液包含如下組分：10-50g/l甘露醇、1-20g/l棉子糖五水合物、10-50g/l羥乙基淀粉、0.01-5g/l別嘌呤醇、1-5g/l谷胱甘肽、1-50μm槲皮素、1-50μm丹參酮、0.1-5g/l氯化鈉、0.1-5g/l氯化鉀、0.1-5g/l醋酸鈉、0.01-1g/l葡萄糖酸鎂、1-20g/l葡萄糖，10-50g/l蔗糖、1-10g/l腺嘌呤鹽酸鹽、1.5-3mm二丁酰環(huán)磷腺苷。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細胞冷藏保存液，其特征在于，所述干細胞冷藏保存液包含如下組分：10-45g/l甘露醇、1-15g/l棉子糖五水合物、10-45g/l羥乙基淀粉、0.01-4g/l別嘌呤醇、1-4g/l谷胱甘肽、1-45μm槲皮素、1-40μm丹參酮、0.1-4g/l氯化鈉、0.1-4g/l氯化鉀、0.1-4g/l醋酸鈉、0.01-0.5g/l葡萄糖酸鎂、1-15g/l葡萄糖、10-45g/l蔗糖、1-5g/l腺嘌呤鹽酸鹽、1.5-2.5mm二丁酰環(huán)磷腺苷。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細胞冷藏保存液，其特征在于，所述干細胞冷藏保存液包含如下組分：10g/l甘露醇、10g/l棉子糖五水合物、45g/l羥乙基淀粉、0.01g/l別嘌呤醇、1g/l谷胱甘肽、45μm槲皮素、40μm丹參酮、1g/l氯化鈉、0.1g/l氯化鉀、0.1g/l醋酸鈉、0.05g/l葡萄糖酸鎂、1g/l葡萄糖、10g/l蔗糖、1g/l腺嘌呤鹽酸鹽、2mm二丁酰環(huán)磷腺苷。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細胞冷藏保存液，其特征在于，所述干細胞冷藏保存液的ph為6.0-7.5。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細胞冷藏保存液，其特征在于，所述干細胞冷藏保存液的滲透壓為300～370mosm/kg。

6.權(quán)利要求1-5任一項所述的干細胞冷藏保存液的制備方法，其特征在于，該制備方法包括將所述組分按照預設濃度溶解于水中進行配制。

7.權(quán)利要求1-5任一項所述的干細胞冷藏保存液在干細胞冷藏保存中的應用。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述的干細胞選自臍帶干細胞、脂肪干細胞、牙髓干細胞或骨髓干細胞。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，冷藏溫度為2-8℃；

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述干細胞冷藏保存液同時支持低密度和高密度細胞保存，使用所述干細胞冷藏保存液重懸待保存的干細胞，調(diào)整細胞密度至0.5×106-1×108/ml，放置于2-8℃冷藏保存。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種干細胞冷藏保存液及其制備方法與應用。該干細胞冷藏保存液包含如下組分：10?50g/L甘露醇、1?20g/L棉子糖五水合物、10?50g/L羥乙基淀粉、0.01?5g/L別嘌呤醇、1?5g/L谷胱甘肽、1?50μM槲皮素、1?50μM丹參酮、0.1?5g/L氯化鈉、0.1?5g/L氯化鉀、0.1?5g/L醋酸鈉、0.01?1g/L葡萄糖酸鎂、1?20g/L葡萄糖，10?50g/L蔗糖、1?10g/L腺嘌呤鹽酸鹽、1.5?3mM二丁酰環(huán)磷腺苷。本發(fā)明還提供了該干細胞冷藏保存液的制備及在冷藏保存干細胞中的應用。本發(fā)明的干細胞冷藏保存液化學成分明確，安全無毒，使用后無需離心換液，可直接輸注。此外，可以較長時間在低溫(2?8℃)條件下維持干細胞高活性和高質(zhì)量，為細胞治療提供可靠的細胞資源。

技術(shù)研發(fā)人員：張萌萌,付麗娜,馬靜,辛文
受保護的技術(shù)使用者：北京全式金生物技術(shù)股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21