本發(fā)明涉及疾病動(dòng)物模型，尤其涉及一種輕度銀屑病樣小鼠炎癥模型及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，全世界約有2％-3％的人患有此病。研究人員對(duì)銀屑病的研究方式大多數(shù)是通過(guò)體外和體內(nèi)模型來(lái)重現(xiàn)疾病，不斷深入了解發(fā)病機(jī)制，以及開(kāi)發(fā)新的療法。其中一種較為簡(jiǎn)單、廉價(jià)和常用的體外模型是小鼠咪喹莫特模型，小鼠背部皮膚每天接受劑量為62.5毫克的咪喹莫特乳膏治療5-7天后，會(huì)出現(xiàn)與銀屑病炎癥相似的皮損，咪喹莫特能誘導(dǎo)小鼠表皮表達(dá)不同的白細(xì)胞介素，如il-17a、il-23與cxcl1等，并引起與銀屑病患者皮損相似的組織病理學(xué)改變，如表皮厚度增加，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)增多，表皮過(guò)度增殖等。另一種被廣泛認(rèn)可的銀屑病小鼠模型是以細(xì)胞因子注射為基礎(chǔ)，在小鼠皮膚皮內(nèi)注射il-23，可刺激il-19和il-24等其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而影響角質(zhì)形成細(xì)胞的分化和增殖，誘發(fā)一些與銀屑病類似的變化，如棘皮病、角化不全和免疫細(xì)胞的真皮炎性浸潤(rùn)。

2、但無(wú)論是咪喹莫特誘導(dǎo)還是il-23注射的銀屑病模型都存在相應(yīng)的缺陷與不足。例如，咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠炎癥是急性的，而非銀屑病患者所承受的慢性炎癥，炎癥和免疫反應(yīng)也不局限于皮膚。此外，小鼠會(huì)抓撓用藥部位，導(dǎo)致表皮剝脫，咪喹莫特會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致體重減輕，但銀屑病患者不會(huì)有上述反應(yīng)。如果停止涂抹咪喹莫特，或者涂藥超過(guò)6天，小鼠銀屑病表型都會(huì)變得不明顯、不典型。在進(jìn)行一些外用新藥測(cè)試時(shí)，需要在造模期間同時(shí)涂抹藥物，一般要求在咪喹莫特涂抹后6-8h待完全吸收后再外涂藥物，造成實(shí)驗(yàn)過(guò)程繁瑣不便。il-23注射的銀屑病模型存在的問(wèn)題是，細(xì)胞因子il-23價(jià)格高昂，進(jìn)行批量實(shí)驗(yàn)時(shí)實(shí)驗(yàn)成本過(guò)高，并且皮內(nèi)注射較難操作，操作不當(dāng)容易導(dǎo)致造模不成功。因此，需要開(kāi)發(fā)一些新型銀屑病樣小鼠炎癥模型來(lái)彌補(bǔ)現(xiàn)有模型的缺陷，使銀屑病小鼠造模過(guò)程更簡(jiǎn)單、便捷，從而推動(dòng)銀屑病基礎(chǔ)科研的進(jìn)步。

3、增殖激活受體γ(pparg，也可縮寫(xiě)為pparγ)是核受體超家族的成員，是研究最廣泛的配體誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子之一。在免疫細(xì)胞、皮膚和其他器官中，pparg可調(diào)節(jié)脂質(zhì)、葡萄糖和氨基酸的代謝(hernandez-quiles,m.,m.f.broekema,and?e.kalkhoven,ppargamma?inmetabolism,immunity,and?cancer:unified?and?diverse?mechanisms?ofaction.frontiers?in?endocrinology,2021.12:p.624112.)。該受體將營(yíng)養(yǎng)、藥物和代謝刺激轉(zhuǎn)化為基因表達(dá)的變化。pparg的激活可促進(jìn)細(xì)胞分化、降低細(xì)胞增殖率并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。。在皮膚中，pparg也有助于皮膚屏障的功能。已被批準(zhǔn)用于其他疾病的pparg激動(dòng)劑也可能對(duì)銀屑病具有一定的治療作用。pparg具有抗炎特性，研究表明，激活pparg可減少tnf-α、il-6和il-1β等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。這種對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用對(duì)銀屑病至關(guān)重要，因?yàn)槁匝装Y是銀屑病的主要特征，銀屑病存在角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖和異常分化。pparg激活可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的適當(dāng)分化，減少銀屑病皮損中出現(xiàn)的過(guò)度增殖(sobolev,v.v.,et?al.,the?role?of?transcription?factor?ppar-γin?the?pathogenesis?ofpsoriasis,skin?cellls,and?immune?cells.international?journal?of?molecularsciences,2022.23(17).)。

4、鑒于pparg在皮膚和角質(zhì)形成細(xì)胞中的重要功能，針對(duì)pparg在銀屑病中的作用機(jī)制及其治療藥物的研究越來(lái)越多，但其在構(gòu)建銀屑病動(dòng)物模型中的研究罕見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的至少一個(gè)問(wèn)題，基于pparg在皮膚和角質(zhì)形成細(xì)胞中的重要功能，發(fā)明人設(shè)想皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中缺乏pparg可能會(huì)導(dǎo)致皮膚穩(wěn)態(tài)失調(diào)從而誘導(dǎo)銀屑病的發(fā)生，因此通過(guò)在角質(zhì)形成細(xì)胞中敲除pparg基因從而成功構(gòu)建了一種輕度銀屑病樣小鼠炎癥模型。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種輕度銀屑病樣小鼠炎癥模型的構(gòu)建方法，其通過(guò)在角質(zhì)形成細(xì)胞中特異性敲除pparg基因從而構(gòu)建所述輕度銀屑病樣小鼠炎癥模型。

4、進(jìn)一步地，所述構(gòu)建方法通過(guò)繁育ppargf/f；k14-cre小鼠獲得所述輕度銀屑病樣小鼠炎癥模型。

5、進(jìn)一步地，所述構(gòu)建方法包括步驟：

6、s1、通過(guò)f1代ppargf/+基因型小鼠自交，篩選獲得folx純合小鼠，記為f2代ppargf/f小鼠；

7、s2、利用步驟s1獲得的f2代ppargf/f小鼠與角質(zhì)形成細(xì)胞特異性表達(dá)cre酶的krt14-cre工具鼠交配，從中篩選出基因型為ppargf/+伴cre陽(yáng)性小鼠，記為f3代ppargf/+；k14-cre小鼠；

8、s3、將步驟s2獲得的f3代ppargf/+；k14-cre小鼠與步驟s1獲得的f2代ppargf/f純合小鼠交配，篩選獲得f4代組織特異性敲除純合小鼠，記為f4代ppargf/f；k14-cre小鼠，即表皮角質(zhì)形成細(xì)胞特異性敲除pparg小鼠。

9、上述k14-cre工具鼠(krt14-cre小鼠)中，k14啟動(dòng)子在角質(zhì)形成細(xì)胞中特異性表達(dá)，因此利用k14啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)cre重組酶的表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)角質(zhì)形成細(xì)胞中特異性基因敲除；其中cre重組酶是一種特異性dna重組酶，能夠識(shí)別并切割loxp位點(diǎn)。上述ppargf/f小鼠是通過(guò)基因工程技術(shù)，在pparg基因的兩側(cè)插入loxp位點(diǎn)。

10、進(jìn)一步地，所述f2代ppargf/f小鼠的pparg基因兩側(cè)插入了loxp位點(diǎn)，其在沒(méi)有cre重組酶的情況下，pparg基因正常表達(dá)；在所述f4代ppargf/f；k14-cre小鼠的角質(zhì)形成細(xì)胞中，cre重組酶識(shí)別并切割loxp位點(diǎn)，導(dǎo)致pparg基因的外顯子被刪除，從而實(shí)現(xiàn)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中特異性敲除pparg基因。

11、進(jìn)一步地，所述f1代ppargf/+基因型小鼠購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)the?jackson?laboratory，strain#:004584；所述krt14-cre工具鼠購(gòu)買(mǎi)于上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司，strain#:jax-004782。

12、進(jìn)一步地，各步驟小鼠的篩選鑒定包括：

13、步驟a、繁育的新生小鼠出生后10天剪小鼠腳趾，冷凍保存?zhèn)溆茫?/p>

14、步驟b、將裂解液加入到所需裂解的組織中，孵育；

15、步驟c、孵育完成的裂解產(chǎn)物混勻后離心，取dna上清進(jìn)行pcr反應(yīng)；

16、步驟d、將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；

17、步驟e、根據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)各小鼠進(jìn)行鑒定；

18、其中，所述f2代ppargf/f小鼠采用pparg引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；所述f3代ppargf/+；k14-cre小鼠、f4代ppargf/f；k14-cre小鼠同時(shí)分別采用pparg和k14-cre的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

19、進(jìn)一步地，所述pcr反應(yīng)體系為2×taq?plus?master?mix?5μl、上游+下游引物0.5μl、ddh2o?3.5μl、dna上清1μl。

20、進(jìn)一步地，采用k14-cre的引物序列為：ttcctcaggagtgtcttcgc以及gtccatgtccttcctgaagc；

21、進(jìn)一步地，采用pparg的引物序列為：tgtaatggaagggcaaaagg以及tggcttccagtgcataagtt。

22、進(jìn)一步地，ppargf/f小鼠dna擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)中僅有230bp一條帶，而ppargf/+有230bp與200bp兩條帶；k14-cre陽(yáng)性小鼠dna擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)中在494bp處有一條帶，而k14-cre陰性小鼠無(wú)條帶。

23、進(jìn)一步地，所述f4代ppargf/f；k14-cre小鼠的背部皮膚出現(xiàn)輕度銀屑病樣癥狀，皮損處銀屑病促炎因子mrna表達(dá)水平上升，表皮厚度增加，并伴有角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖。

24、本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供一種本發(fā)明的第一個(gè)方面中任一所述的構(gòu)建方法制備得到的輕度銀屑病樣小鼠炎癥模型。

25、本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供一種本發(fā)明的第一個(gè)方面中任一所述的構(gòu)建方法制備得到的輕度銀屑病樣小鼠炎癥模型的應(yīng)用；其中，所述輕度銀屑病樣小鼠炎癥模型作為動(dòng)物模型在研究銀屑病致病機(jī)理中的應(yīng)用。

26、本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供一種本發(fā)明的第一個(gè)方面中任一所述的構(gòu)建方法制備得到的輕度銀屑病樣小鼠炎癥模型的應(yīng)用；其中，所述輕度銀屑病樣小鼠炎癥模型作為動(dòng)物模型在篩選治療銀屑病的藥物中的應(yīng)用。

27、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用上述技術(shù)方案具有以下有益效果：

28、本發(fā)明中采用的k14-cre小鼠主要用于研究皮膚發(fā)育和疾病，由于其啟動(dòng)子的表達(dá)更廣泛，覆蓋更多的基底層細(xì)胞及其后代，常用于更全面地研究角質(zhì)形成細(xì)胞的基因功能?；诒景l(fā)明構(gòu)建的小鼠模型希望研究更廣泛的角質(zhì)形成細(xì)胞功能，因此選擇使用k14-cre小鼠而非k5-cre小鼠，從而得到在表達(dá)k14的所有角質(zhì)形成細(xì)胞中敲除pparg。另外，為了使建立的小鼠模型是具有長(zhǎng)期、慢性銀屑病病程的小鼠模型，而不是他莫昔芬注射后導(dǎo)致pparg短暫缺失而誘導(dǎo)出的疾病表型，本發(fā)明選擇使用cre小鼠而非creert2小鼠，進(jìn)行無(wú)誘導(dǎo)且長(zhǎng)期穩(wěn)定的在角質(zhì)形成細(xì)胞中敲除pparg。

29、本發(fā)明通過(guò)繁育ppargf/f；k14-cre小鼠獲得角質(zhì)形成細(xì)胞中特異性敲除pparg基因小鼠，其背部皮膚出現(xiàn)輕度銀屑病樣癥狀，皮損處銀屑病促炎因子mrna表達(dá)水平上升，表皮厚度增加，并伴有角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖，均符合銀屑病樣皮炎的特征與表現(xiàn)，其可作為輕度銀屑病樣皮炎良好的皮膚模型(即輕度銀屑病樣小鼠炎癥模型)，上述表皮角質(zhì)形成細(xì)胞特異性敲除pparg基因的小鼠為銀屑病的動(dòng)物模型提供了新選擇，且克服了現(xiàn)有銀屑病動(dòng)物模型的缺陷，從而成為進(jìn)行銀屑病相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究、藥物測(cè)試的良好動(dòng)物模型。