生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料及其制備方法和應用，益生菌生物發(fā)酵活性載體的制備：由嗜酸乳桿菌LA0912、糞腸球菌EF1109、枯草芽孢桿菌BS0903、釀酒酵母SC1203分別液體發(fā)酵培養(yǎng)，所獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液按體積比1:1:1:1混合后進行固體發(fā)酵培養(yǎng)，所獲得的固體發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)低溫烘干、粉碎后得生物發(fā)酵活性載體；以生物發(fā)酵活性載體復配維生素、氨基酸、礦物質(zhì)、有機微量元素、氯化膽堿及食鹽即獲得適用于不同階段豬群的生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料。該生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料既發(fā)揮了益生菌的保健功能，又充分利用了益生菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物的多種生物活性作用，可以滿足不同階段豬的生理性營養(yǎng)需要。
【專利說明】生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵動物飼料【技術領域】，特別涉及一種生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]多年來，由于畜禽疾病的復雜性以及現(xiàn)代畜牧業(yè)節(jié)約化生產(chǎn)防病促生長的需要、在畜禽飼料中添加抗生素類藥物的現(xiàn)象普遍存在。然而，在飼料中長期使用抗生素類藥物會產(chǎn)生嚴重的負面效應，已直接或間接威脅到人類的身體健康，主要表現(xiàn)為養(yǎng)殖內(nèi)外環(huán)境的惡化、病原菌的抗藥性增加、抗菌藥物失效、人和動物的免疫力下降等。近年來，酶制劑、植物提取物、酸化劑、基因工程抗菌肽等產(chǎn)品的出現(xiàn)，對減少抗生素類藥物的使用起到了一定的促進作用，但此類產(chǎn)品仍然未能使全價飼料或預混合飼料擺脫對抗生素類藥物的依賴。隨著現(xiàn)代生物科學技術的發(fā)展，不添加抗生素的微生態(tài)制劑、微生物發(fā)酵飼料由于其安全性、有效性已被認為有希望發(fā)展成為一類新型綠色飼料添加劑和飼料應用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)。但由于微生物菌種的篩選和發(fā)酵工藝等一系列技術問題使得微生態(tài)制劑、微生物發(fā)酵飼料的生產(chǎn)和使用尚有諸多問題有待解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]解決的技術問題:為了促進飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收利用，提高豬的生產(chǎn)性能和抵御疾病的能力，減少抗生素類藥物的使用，本發(fā)明提供了一種生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料及其制備方法和應用。本發(fā)明所述生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料不添加任何抗生素類藥物，由四種益生菌通過液體、固體二次發(fā)酵產(chǎn)生的活菌及其代謝產(chǎn)物制成的生物發(fā)酵活性載體與多種維生素、氨基酸、礦物質(zhì)、有機微量元素、氯化膽堿、食鹽復配而成。該生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料既發(fā)揮了益生菌的保健功能，又充分利用了益生菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物的多種生物活性作用，不僅可以滿足不同階段豬的生理性營養(yǎng)需要，還能提高其免疫力，拮抗致病微生物，改善體內(nèi)外生態(tài)環(huán)境，提高飼料消化吸收利用率，提聞豬的生廣性能。
[0004]技術方案:一種生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料，由以下步驟制備而得:
[0005](I)益生菌生物發(fā)酵活性載體的制備:由嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus) LA0912 (CCTCC M2013577)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis) EF1109(CCTCC M2013576)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BS0903(CCTCC M2012078)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) SC1203 (CCTCC M2013578)分別液體發(fā)酵培養(yǎng)，所獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液按體積比1:1:1:1混合后進行固體發(fā)酵培養(yǎng)，所獲得的固體發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)低溫烘干、粉碎后作為生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料的母料，簡稱生物發(fā)酵活性載體；
[0006]( 2 )以生物發(fā)酵活性載體復配維生素、氨基酸、礦物質(zhì)、有機微量元素、氯化膽堿及食鹽即獲得適用于不同階段豬群的生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料。
[0007]—種生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料及其制備方法，生產(chǎn)工藝步驟為:[0008]1、益生菌生物發(fā)酵活性載體的制備:由嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus) LA0912 (CCTCC M2013577)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis) EF1109(CCTCC M2013576)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BS0903 (CCTCC M2012078)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) SC1203 (CCTCC M2013578)分別液體發(fā)酵培養(yǎng)，所獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液按體積比1:1:1:1混合后進行固體發(fā)酵培養(yǎng)，所獲得的固體發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)低溫烘干、粉碎后作為生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料的母料，簡稱生物發(fā)酵活性載體；
2、以生物發(fā)酵活性載體復配維生素、氨基酸、礦物質(zhì)、有機微量元素、氯化膽堿及食鹽即獲得適用于不同階段豬群的生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料。
[0009]所述生物發(fā)酵活性載體的具體制備步驟為:
[0010]⑴液體發(fā)酵
[0011]①嗜酸乳桿菌LA0912菌液的制備:將保藏的嗜酸乳桿菌LA0912菌種接種至裝有20mLMRS培養(yǎng)基的厭氧管中，37°C恒溫培養(yǎng)20h后即為嗜酸乳桿菌種子液，再將制備好的種子液按體積比1%_10%的接種量進行二級培養(yǎng)，每級37°C恒溫培養(yǎng)20h后獲得供固體發(fā)酵用的嗜酸乳桿菌菌液；
[0012]所述的MRS培養(yǎng)基配方如下:蛋白胨，10.0g/L;酵母膏，4.0g/L;牛肉膏，8.0g/L;葡萄糖，20.0g/L ;吐溫80，lmL/L ;三水乙酸鈉，5.0g/L ;磷酸氫二鉀，2.0g/L ;檸檬酸三銨，
2.0g/L ;七水硫酸鎂，0.2g/L ;硫酸錳，0.05g/L ；ρΗ6.2±0.2 ；
[0013]②糞腸球菌EF1109菌液的制備:將保藏的糞腸球菌EF1109菌種接種至裝有IOOmL的YPD液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37°C恒溫靜置培養(yǎng)20h即為糞腸球菌種子液，再將制備好的種子液按體積比1%-10%的接種量進行二級培養(yǎng)，每級37°C靜置恒溫培養(yǎng)10-20h后獲得供固體發(fā)酵用的糞腸球菌菌液；
[0014]所述的YPD液體培養(yǎng)基配方如下:蛋白胨，20.0g/L ;酵母浸粉，10.0g/L ;葡萄糖，20.0g/L ；ρΗ6.5±0.2 ;
[0015]③枯草芽孢桿菌BS0903菌液的制備:將保藏的枯草芽孢桿菌BS0903菌種接種至裝有IOOmL的MNR培養(yǎng)基的錐形瓶中，30°C、搖床轉(zhuǎn)速為225rpm、恒溫培養(yǎng)16h后即為枯草芽胞桿菌種子液，再將制備好的種子液按體積比1%_6%的接種量進行二級培養(yǎng)，每級37°C靜置恒溫培養(yǎng)10-20h后獲得供固體發(fā)酵用的枯草芽孢桿菌菌液；
[0016]所述的MNB培養(yǎng)基配方如下:蛋白胨，5.0g/L;牛肉膏，3.0g/L;酵母浸粉，1.0g/L;葡萄糖，5.0g/L ;七水硫酸鎂，0.5g/L ;硫酸錳，0.005g/L ；ρΗ7.0±0.2 ；
[0017]④釀酒酵母SC1203菌液的制備:將保藏的釀酒酵母SC1203菌種接種至裝有IOOmL的YPD液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在轉(zhuǎn)速為250rpm搖床中30°C恒溫培養(yǎng)16h后即為釀酒酵母菌種子液，再將制備好的種子液按體積比1%_3%的接種量進行二級培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為250rpm、3(TC恒溫培養(yǎng)16h后獲得供固體發(fā)酵用的釀酒酵母菌液；
[0018]所述的YPD液體培養(yǎng)基配方如下:蛋白胨，10.0g/L ;酵母浸粉，5.0g/L ;葡萄糖，20.0g/L;丙酸鈉，2.5g/L;pH4.0±0.1 ；
[0019]⑤復合菌菌液的配制:按體積比1:1:1:1配比量取嗜酸乳桿菌LA0912菌液、糞腸球菌EF1109菌液、枯草芽孢桿菌BS0903菌液及釀酒酵母SC1203菌液，混勻獲得復合菌菌液；
[0020]⑵固體發(fā)酵[0021]①固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制:按質(zhì)量比豆柏22%、玉米蛋白粉25%、米糠柏23%、麩皮25%、紅糖5%配制混合；
[0022]②固體發(fā)酵培養(yǎng)的條件:復合菌菌液在固體發(fā)酵培養(yǎng)基中的接種量按體積質(zhì)量比為3-6%(mL/g)，蛋白酶的添加量為100-120U/g，水與固體發(fā)酵培養(yǎng)基的比例按體積質(zhì)量比1:1-0.4:1 (mL/g)，復合菌菌液、蛋白酶及固體發(fā)酵培養(yǎng)基混勻后發(fā)酵，發(fā)酵溫度35-40°C，發(fā)酵時間為72-120h ；
[0023]③固體發(fā)酵產(chǎn)物的烘干粉碎:上述所獲得的固體發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)40-60°C低溫烘干、粉碎后即為配制生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料所需的生物發(fā)酵活性載體。
[0024]所述生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料的復配方法為:每千克生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料含有:銅，200-360mg ;鐵，600-1200mg ;鋅，800mg ;錳，120mg ；碘，1.4mg ；硒，Img ;維生素 A, 40000-60000IU ;維生素 D3,10000-15000IU ;維生素 E，120-200IU ;維生素 K3，8-16mg ;維生素 BI，10_20mg ;維生素 B2，20_40mg ;維生素 B6，12mg ；維生素B12,0.12-0.32mg ;煙酸，200mg ;葉酸，4_6mg ;泛酸IOOmg ;生物素，O-1mg ;氯化膽堿，2000mg ;賴氨酸，0.4-2.8g ;鈣，40_80g ;總磷，15g ;食鹽，30_60g。
[0025]⑴乳仔豬生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料的復配方法為:每千克生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料含有:銅，360mg ;鐵，1200mg ;鋅,80011^ ;猛，120mg ;碘，1.4mg ；硒，Img ;維生素A，60000IU ;維生素D3,15000IU ;維生素E，160IU ;維生素K3，16mg ;維生素Bl，20mg ;維生素 B2，20mg ;維生素 B6，12mg ;維生素 B12，0.12mg ;煙酸，200mg ;葉酸，6mg ;泛酸IOOmg ;氯化膽堿，2000mg ;賴氨酸，2.8g ;?丐，65g ;總磷，15g ;食鹽，30g。
[0026]⑵生長育肥豬生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料的復配方法為:每千克生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料含有:銅，240mg ;#,600mg ;鋅,80011^ ;猛，120mg ;碘，1.4mg ；硒，Img ;維生素A，40000IU ;維生素D3，10000IU ;維生素E，120IU ;維生素K3，8mg ;維生素BI，20mg ;維生素 B2，20mg ;維生素 B6，12mg ;維生素 B12，0.08mg ;煙酸，200mg ;泛酸，IOOmg ；葉酸，4mg ;氯化膽堿，2000mg。賴氨酸，2.4g ;鈣，58g ;總磷，15g ;食鹽，30g。
[0027]⑶妊娠母豬生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料的復配方法為:每千克生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料含有:銅，200mg ;鐵，1200mg ;鋅,80011^ ;猛，120mg ;碘，1.4mg ；硒，Img ;維生素A，50000IU ;維生素D3，15000IU ;維生素E，200IU ;維生素K3，8mg ;維生素BI，IOmg ;維生素 B2，40mg ;維生素 B6，12mg ;維生素 B12，0.32mg ;煙酸，200mg ;泛酸，IOOmg ；葉酸，6mg ;生物素,Img ;氯化膽堿，2000mg ;賴氨酸，0.4g ;?丐，65g ;總磷，15g ;食鹽，30g。
[0028]⑷哺乳母豬生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料的復配方法為:每千克生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料含有:銅，200mg ;鐵，1200mg ;鋅,80011^ ;猛，120mg ;碘，1.4mg ；硒，Img ;維生素A，50000IU ;維生素D3，15000IU ;維生素E，200IU ;維生素K3，8mg ;維生素BI，IOmg ;維生素 B2，40mg ;維生素 B6，12mg ;維生素 B12，0.32mg ;煙酸，200mg ;泛酸，IOOmg ；葉酸，60mg ;生物素,Img ;氯化膽堿,2000mg。賴氨酸，1.6g ;?丐，68g ;總磷，15g ;食鹽，30g。
[0029]任一所述方法制備而得的生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料在生豬養(yǎng)殖上的應用。
[0030]生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料占配制豬用全價飼料重量的10%。
[0031] 本發(fā)明所用的嗜酸乳桿菌LA0912 (Lactobacillus acidophilus LA0912)為 申請人:從豬腸道中分離的眾多菌株中篩選獲得，已于2013年11月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC N0:M2013577o該嗜酸乳桿菌能分泌抗生素類物質(zhì)(包括嗜酸乳菌素、嗜酸桿菌素、乳酸菌素等)，能拮抗腸道致病菌、抑制腸道不良微生物的增殖、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡。其生物學特征如下:桿菌，兩端圓。
0.6-0.9 X 1.5-6 μ m,以單個、成雙或短鏈出現(xiàn)；菌落粗糙、無邊帽。在顯微鏡下觀察，顯示纏繞或微絨毛絲狀物，從似暗影的菌堆的中心放射伸出?？赏溠刻恰肴樘?、乳糖、蔗糖、纖維二糖、甘露二糖、海藻糖、蜜二糖、苦杏仁苷，不能同化阿拉伯糖、葡萄糖酸鹽、甘露糖。15°C以下不生長，最適生長溫度35-38°C，最適生長pH為5.5-6.0。
[0032]本發(fā)明所用的糞腸球菌EF1109 (Enterococcus faecalis EF1109)為 申請人:從動物腸道中分離的眾多菌株中篩選獲得，已于2013年11月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC N0:M2013576。該菌是革蘭氏陽性菌，在MRS瓊脂平板上生長良好，菌落圓整、光滑、隆起、灰白色露滴樣、直徑0.5-lmm;顯微鏡下觀察，該菌呈球形，不形成芽孢；生長溫度范圍10°C -50°C，pH范圍4-10 ;對沙門氏菌、致病性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較強的抑制作用；可耐受pH2.5的人工胃液60min、最高耐受膽鹽濃度為2.0%。
[0033]本發(fā)明所用的枯草芽孢桿菌BS0903 (Bacillus subtilis BS0903)為 申請人:從健康動物腸道中分離的眾多菌株中篩選獲得，已于2012年3月14日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC N0:M2012078o其生物學特征如下:菌落圓形、邊緣呈鋸齒狀、表面粗糙、不透明、污白色，革蘭氏陽性菌，芽孢形狀為橢圓到柱狀、位于菌體中央或稍偏，形成芽孢后的菌體不膨大。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生對沙門氏菌、致病性大腸桿菌K88和金黃色葡萄球菌有強烈殺滅作用的細菌素(主要是脂肽類物質(zhì))，還具有較強的產(chǎn)纖維素酶的能力，可以降解纖維素。同時，具有耐高溫、耐酸及耐膽鹽的特點:可以耐受80°C的制粒溫度、1%ρΗ2.0的胃蛋白酶的人工胃液以及0.3%的人工膽鹽。
[0034]本發(fā)明的釀酒酵母SC1203(Saccharomyces cerevisiae SC1203)為 申請人:從健康動物腸道糞便中分離篩選獲得，已于2013年11月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC N0:M2013578o其生物學特征如下:單細胞真菌，呈卵圓形、圓形或圓柱形，菌落較大較厚、呈乳白色、表面濕潤、粘稠、易被挑起。本發(fā)明的釀酒酵母具有良好的抗逆性，能耐高溫、耐酸、耐膽鹽以及耐受常用抗生素類藥物等，并且能產(chǎn)酸、產(chǎn)酶及抑制病原菌等功效。
[0035]有益效果:本發(fā)明巧妙綜合了厭氧菌和好氧菌發(fā)酵的優(yōu)點，選用的特定益生菌菌種組合能使乳酸菌迅速繁殖，占據(jù)數(shù)量優(yōu)勢，而本發(fā)明選用的嗜酸乳桿菌能分泌抗生素類物質(zhì)(包括嗜酸乳菌素、嗜酸桿菌素、乳酸菌素等)；枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生對沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有強烈殺滅作用的細菌素(主要是脂肽類物質(zhì))，能有效抑制固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的雜菌、有害菌，但是對本發(fā)明所選用的酵母菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌的生長代謝影響較小，可以實現(xiàn)固體培養(yǎng)基原料不需要消毒就可以直接用于接種培養(yǎng)；釀酒酵母的生長能夠分解利用碳水化合物合成微生物蛋白，提高菌體蛋白的含量。通過液、固二次發(fā)酵所獲得的生物發(fā)酵活性成分除了含有經(jīng)反復篩選的具有優(yōu)異特點的益生菌外，還含常規(guī)復合預混合飼料所不具備的多種益生菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物，包括豐富的酶類、有機酸、維生素、抗菌肽類、未知生長因子等，不但可以提高動物免疫力，拮抗致病微生物，改善體內(nèi)外生態(tài)環(huán)境，提高飼料消化吸收利用率，同時可以替代或部分替代常規(guī)預混合飼料配方中的抗生素、誘食劑、酸化劑、酶制劑、防霉劑等。本發(fā)明設計的占配制豬全價飼料10%的生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料產(chǎn)品既保留了常規(guī)微生態(tài)制劑益生菌的功能，又避免了常規(guī)微生態(tài)制劑中具有重要功能的益生菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物少的缺點，使得產(chǎn)品除了常規(guī)的營養(yǎng)性功能外，還大大提高了產(chǎn)品的免疫調(diào)節(jié)和保健功能；同時，本發(fā)明所設計的產(chǎn)品使用方便，僅需配以玉米、豆柏和麩皮等即可制成全價飼料，既保留全價發(fā)酵飼料的優(yōu)異性能，又避免發(fā)酵全價料所帶來的能量損失，易于各類養(yǎng)殖戶、生產(chǎn)飼料企業(yè)使用；本發(fā)明設計的生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料產(chǎn)品制備及最終產(chǎn)品無抗生素類產(chǎn)品的添加，綠色安全，適用于不同階段豬群的使用。
【具體實施方式】
[0036]通過下列實施例將具體說明本發(fā)明，但所述的實施例僅是為了說明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0037]實施例1、液體發(fā)酵制備復合益生菌菌液
[0038]①嗜酸乳桿菌LA0912菌液的制備:將保藏的嗜酸乳桿菌LA0912菌種接種至裝有20mLMRS培養(yǎng)基的厭氧管中，37°C恒溫培養(yǎng)20h后即為嗜酸乳桿菌種子液，再將制備好的種子液按體積比1-10%的接種量進行二級培養(yǎng)，每級37°C靜置恒溫培養(yǎng)20h后獲得供固體發(fā)酵用的嗜酸乳桿菌菌液；
[0039]所述的MRS培養(yǎng)基配方如下:蛋白胨，10.0g/L;牛肉膏，8.0g/L;酵母膏，4.0g/L;葡萄糖，20.0g/L ;吐溫80，1111171 ;磷酸氫二鉀，2.0g/L ;三水乙酸鈉，5.0g/L ;檸檬酸三銨，
2.0g/L ;七水硫酸鎂，0.2g/L ;硫酸錳，0.05g/L ；ρΗ6.2±0.2 ；
[0040]②糞腸球菌EF1109菌液的制備:將保藏的糞腸球菌EF1109菌種接種至裝有IOOmL的YH)液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37°C恒溫靜置培養(yǎng)10_20h后即為糞腸球菌種子液，再將制備好的種子液按體積比1-10%的接種量進行二級培養(yǎng)，每級37°C靜置恒溫培養(yǎng)10-20h后獲得供固體發(fā)酵用的糞腸球菌菌液；
[0041]所述的YPD液體培養(yǎng)基配方如下:蛋白胨，20.0g/L ;酵母浸粉，10.0g/L ;葡萄糖，20.0g/L ；ρΗ6.5±0.2 ;
[0042]③枯草芽孢桿菌BS0903菌液的制備:將保藏的枯草芽孢桿菌BS0903菌種接種至裝有IOOmL的MNR培養(yǎng)基的錐形瓶中，30°C、搖床轉(zhuǎn)速為225rpm、恒溫培養(yǎng)16h后即為枯草芽胞桿菌種子液，再將制備好的種子液按體積比1-6%的接種量進行二級培養(yǎng)，每級30°C恒溫培養(yǎng)20h，搖床轉(zhuǎn)速為225rpm ;培養(yǎng)結(jié)束后獲得供固體發(fā)酵用的枯草芽孢桿菌菌液；
[0043]所述的MNB培養(yǎng)基配方如下:蛋白胨，5.0g/L;牛肉膏，3.0g/L;酵母浸粉，1.0g/L;葡萄糖，5.0g/L ;七水硫酸鎂，0.5g/L ;硫酸錳，0.005g/L ；ρΗ7.0±0.2 ；
[0044]④釀酒酵母SC1203菌液的制備:將保藏的釀酒酵母SC1203菌種接種至裝有IOOmL的YI3D液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在轉(zhuǎn)速為250rpm搖床中30°C恒溫培養(yǎng)16h后即為釀酒酵母菌種子液，再將制備好的種子液按1-3%的接種量進行二級培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為250rpm、3(TC恒溫培養(yǎng)16h后獲得供固體發(fā)酵用的釀酒酵母菌液；
[0045]所述的YPD液體培養(yǎng)基配方如下:蛋白胨，10.0g/L ;酵母浸粉，5.0g/L ;葡萄糖，
20.0g/L;丙酸鈉，2.5g/L;pH4.0±0.1 ；[0046]⑤復合菌菌液的配制:四種菌中嗜酸乳桿菌濃度為4.121ogCFU/mL，糞腸球菌濃度為4.121ogCFU/mL，枯草芽孢桿菌濃度為5.451ogCFU/mL，按照體積比為嗜酸乳桿菌:糞腸球菌:枯草芽孢桿菌:釀酒酵母=1:1:1:1混勻制成復合菌菌液。
[0047]實施例2、固體發(fā)酵制備生物發(fā)酵活性載體
[0048]①固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制:按豆柏22%、玉米蛋白粉25%、米糠柏23%、麩皮25%、紅糖5%配制混合。所述白分含量為重量百分比。
[0049]②固體發(fā)酵培養(yǎng)的條件:將實施例1制得的復合菌菌液在固體發(fā)酵培養(yǎng)基中的接種量為3-6%(mL/g)，蛋白酶的添加量為100-120U/g，水與固體發(fā)酵培養(yǎng)基的比例按1:1-0.4: I (mL/g)，復合菌菌液、蛋白酶及固體發(fā)酵培養(yǎng)基混勻后發(fā)酵，發(fā)酵溫度35-40°C，發(fā)酵時間為72-120h。通過多因子正交試驗獲得最優(yōu)發(fā)酵方案為:復合菌菌液在固體培養(yǎng)基中的接種量為4% (mL/g)，蛋白酶的添加量為110U/g，水與固體培養(yǎng)基的比例按1: 0.6(mL/g)，復合菌菌液、蛋白酶及培養(yǎng)基混勻后發(fā)酵，發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵時間為84h。
[0050]③固體發(fā)酵產(chǎn)物的烘干粉碎:上述所獲得的固體發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)低溫烘干、粉碎后即為配制生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料中的生物發(fā)酵活性載體。
[0051]實施例3、乳仔豬生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料的制備
[0052]以實施例2所獲得的益生菌發(fā)酵生物活性載體與多種維生素、氨基酸、有機微量元素、礦物質(zhì)、氯化膽堿、食鹽復配、均勻混合，即得乳仔豬生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料。本發(fā)明的乳仔豬生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料每千克含:銅，360mg ;鐵，1200mg ;鋅，800mg ;錳，120mg ;碘，1.4mg ;硒，Img ;維生素 A，60000IU ;維生素 D3，15000IU ；維生素E, 160IU ;維生素K3,16mg ;維生素BI, 20mg ;維生素B2, 20mg ;維生素B6,12mg ;維生素B12,0.12mg ;煙酸，200mg ;葉酸，6mg ;泛酸IOOmg ;氯化膽堿，2000mg ;賴氨酸，2.8g 丐,65g ;總磷，15g ;食鹽,30g。
[0053]實施例4、生長育肥豬生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料的制備
[0054]以實施例2所獲得的益生菌發(fā)酵生物活性載體與多種維生素、氨基酸、有機微量元素、礦物質(zhì)、氯化膽堿、食鹽復配、均勻混合，即得生長育肥豬生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料。本發(fā)明的生長育肥豬生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料每千克含:銅，240mg ;鐵，600mg ;鋅，800mg ;猛，120mg ;碘，1.4mg ;硒，Img ;維生素 A, 40000IU ;維生素 D3,10000IU ;維生素E，120IU ;維生素K3，8mg ;維生素Bl，20mg ;維生素B2，20mg ;維生素B6，12mg ;維生素B12,0.08mg ;煙酸，200mg ;泛酸，IOOmg ;葉酸，4mg ;氯化膽堿，2000mg。賴氨酸，2.4g ;鈣，58g ;總磷，15g ;食鹽，30g。
[0055]實施例5、妊娠母豬生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料的制備
[0056]以實施例2所獲得的益生菌發(fā)酵生物活性載體與多種維生素、氨基酸、有機微量元素、礦物質(zhì)、氯化膽堿、食鹽復配、均勻混合，即得妊娠母豬生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料。本發(fā)明的妊娠母豬生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料每千克含:銅，200mg ;鐵，1200mg ;鋅，800mg ;錳，120mg ;碘，1.4mg ;硒，Img ;維生素 A，50000IU ;維生素 D3，15000IU ；維生素E，200IU ;維生素K3，8mg ;維生素BI，IOmg ;維生素B2，40mg ;維生素B6，12mg ;維生素B12,0.32mg ;煙酸，200mg ;泛酸，IOOmg ;葉酸，6mg ;生物素,Img ;氯化膽堿，2000mg ;賴氨酸，0.4g ;鈣，65g ;總磷，15g ;食鹽，30g。
[0057]實施例6、哺乳母豬生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料的制備[0058]以實施例2所獲得的益生菌發(fā)酵生物活性載體與多種維生素、氨基酸、有機微量元素、礦物質(zhì)、氯化膽堿等復配、均勻混合，即得哺乳母豬生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料。本發(fā)明的哺乳妊娠母豬生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料每千克含:銅，200mg ;鐵，1200mg ;鋅，800mg ;錳，120mg ;碘，1.4mg ;硒，Img ;維生素 A，50000IU ;維生素 D3，15000IU ;維生素E，200IU ;維生素K3，8mg ;維生素BI，IOmg ;維生素B2，40mg ;維生素B6，12mg ;維生素B12,0.32mg ;煙酸，200mg ;泛酸，IOOmg ;葉酸，60mg ;生物素,Img ;氯化膽堿，2000mg。賴氨酸，1.6g ;?丐，68g ;總磷，15g ;食鹽，30g。
[0059]實施例7、驗證本發(fā)明的乳仔豬生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料對乳仔豬的飼用效果
[0060]⑴試驗方法:選擇35日齡左右、健康無病、品種一致、體重相近、個體均勻的仔豬150頭，隨機分成3組，分別為試驗組、對照組I和對照組2。試驗期5周。試驗各組欄舍條件一致，試驗期間各組豬只均自由采食、自動飲水，試驗豬免疫、消毒等按豬場常規(guī)進行。試驗組飼料是在玉米-豆柏日糧中按10%的含量添加本發(fā)明實施例3的乳仔豬生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料。對照組I飼料是在玉米-豆柏日糧中添加常規(guī)配方自配的10%仔豬復合預混合飼料(載體為脫脂米糠)。對照組2飼料是在玉米-豆柏日糧中添加常規(guī)市售的10%仔豬前期復合預混合飼料。
[0061](2)測定指標:
[0062]初重、末重、日均采食量、日均增重、料重比、腹瀉率。
[0063]⑶試驗結(jié)果:
[0064]
【權利要求】
1.一種生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料，其特征在于由以下步驟制備而得: (I)益生菌生物發(fā)酵活性載體的制備:由嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)LA0912、|^腸球菌(Enterococcus faecalis) EF1109、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)BS0903、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) SC1203分別液體發(fā)酵培養(yǎng)，所獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液按體積比1:1:1:1混合后進行固體發(fā)酵培養(yǎng)，所獲得的固體發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)低溫烘干、粉碎后作為生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料的母料，簡稱生物發(fā)酵活性載體； (2 )以生物發(fā)酵活性載體復配維生素、氨基酸、礦物質(zhì)、有機微量元素、氯化膽堿及食鹽即獲得適用于不同階段豬群的生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料。
2.一種生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料的制備方法，其特征在于其生產(chǎn)工藝步驟為: (I)益生菌生物發(fā)酵活性載體的制備:由嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)LA0912、|^腸球菌(Enterococcus faecalis) EF1109、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)BS0903、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) SC1203分別液體發(fā)酵培養(yǎng)，所獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液按體積比1:1:1:1混合后進行固體發(fā)酵培養(yǎng)，所獲得的固體發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)低溫烘干、粉碎后作為生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料的母料，簡稱生物發(fā)酵活性載體； (2 )以生物發(fā)酵活性載體復配維生素、氨基酸、礦物質(zhì)、有機微量元素、氯化膽堿及食鹽即獲得適用于不同階段豬群的生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料。
3.根據(jù)權利要 求2所述生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料的制備方法，其特征在于所述生物發(fā)酵活性載體的具體制備步驟為: ⑴液體發(fā)酵 ①嗜酸乳桿菌LA0912菌液的制備:將保藏的嗜酸乳桿菌LA0912菌種接種至裝有20mLMRS培養(yǎng)基的厭氧管中，37°C恒溫培養(yǎng)20h后即為嗜酸乳桿菌種子液，再將制備好的種子液按體積比1%_10%的接種量進行二級培養(yǎng)，每級37°C恒溫培養(yǎng)20h后獲得供固體發(fā)酵用的嗜酸乳桿菌菌液； 所述的MRS培養(yǎng)基配方如下:蛋白胨，10.0g/L ;酵母膏，4.0g/L ;牛肉膏，8.0g/L ;葡萄糖，20.0g/L ;吐溫80，lmL/L ;三水乙酸鈉，5.0g/L ;磷酸氫二鉀，2.0g/L ;檸檬酸三銨，2.0g/L ;七水硫酸鎂，0.2g/L ;硫酸錳，0.05g/L ；ρΗ6.2±0.2 ； ②糞腸球菌EFl109菌液的制備:將保藏的糞腸球菌EFl 109菌種接種至裝有IOOmL的YPD液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37°C恒溫靜置培養(yǎng)20h即為糞腸球菌種子液，再將制備好的種子液按體積比1%-10%的接種量進行二級培養(yǎng)，每級37°C靜置恒溫培養(yǎng)10-20h后獲得供固體發(fā)酵用的糞腸球菌菌液； 所述的Yro液體培養(yǎng)基配方如下:蛋白胨，20.0g/L;酵母浸粉，10.0g/L;葡萄糖，.20.0g/L ；ρΗ6.5±0.2 ; ③枯草芽孢桿菌BS0903菌液的制備:將保藏的枯草芽孢桿菌BS0903菌種接種至裝有.1OOmL的MNR培養(yǎng)基的錐形瓶中，30°C、搖床轉(zhuǎn)速為225rpm、恒溫培養(yǎng)16h后即為枯草芽胞桿菌種子液，再將制備好的種子液按體積比1%_6%的接種量進行二級培養(yǎng)，每級37°C靜置恒溫培養(yǎng)10-20h后獲得供固體發(fā)酵用的枯草芽孢桿菌菌液； 所述的MNB培養(yǎng)基配方如下:蛋白胨，5.0g/L ;牛肉膏，3.0g/L ;酵母浸粉，1.0g/L ;葡萄糖，5.0g/L ;七水硫酸鎂，0.5g/L ;硫酸錳，0.005g/L ；ρΗ7.0±0.2 ；④釀酒酵母SC1203菌液的制備:將保藏的釀酒酵母SC1203菌種接種至裝有IOOmL的YPD液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在轉(zhuǎn)速為250rpm搖床中30°C恒溫培養(yǎng)16h后即為釀酒酵母菌種子液，再將制備好的種子液按體積比1%_3%的接種量進行二級培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為250rpm、30°C恒溫培養(yǎng)16h后獲得供固體發(fā)酵用的釀酒酵母菌液； 所述的YB)液體培養(yǎng)基配方如下:蛋白胨，10.0g/L ;酵母浸粉，5.0g/L ;葡萄糖，20.0g/L ;丙酸鈉，2.5g/L;pH4.0±0.1 ； ⑤復合菌菌液的配制:按體積比1:1:1:1配比量取嗜酸乳桿菌LA0912菌液、糞腸球菌EFl 109菌液、枯草芽孢桿菌BS0903菌液及釀酒酵母SC1203菌液，混勻獲得復合菌菌液； (2)固體發(fā)酵 ①固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制:按質(zhì)量比豆柏22%、玉米蛋白粉25%、米糠柏23%、麩皮25%、紅糖5%配制混合； ②固體發(fā)酵培養(yǎng)的條件:復合菌菌液在固體發(fā)酵培養(yǎng)基中的接種量按體積質(zhì)量比為3-6%(mL/g)，蛋白酶的添加量為100-120U/g，水與固體發(fā)酵培養(yǎng)基的比例按體積質(zhì)量比1:1-0.4:1 (mL/g)，復合菌菌液、蛋白酶及固體發(fā)酵培養(yǎng)基混勻后發(fā)酵，發(fā)酵溫度35-40°C，發(fā)酵時間為72-120h ； ③固體發(fā)酵產(chǎn)物的烘干粉碎:上述所獲得的固體發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)40-60°C低溫烘干、粉碎后即為配制生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料所需的生物發(fā)酵活性載體。
4.根據(jù)權利要求2所述生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料的制備方法，其特征在于復配方法為:每千克生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料含有:銅，200-360mg ;鐵，600-1200mg ;鋅，800mg ;錳，120mg ;碘，L4mg ;硒，Img ;維生素 A，40000-60000IU ;維生素D3,10000-15000IU ;維生素 E, 120-200IU ;維生素 K3，8_16mg ;維生素 BI, 10_20mg ;維生素B2，20-40mg ;維生素 B6，12mg ;維生素 B12，0.12-0.32mg ;煙酸，200mg ;葉酸，4_6mg ;泛酸IOOmg ;生物素,O-1mg ;氯化膽堿，2000mg ;賴氨酸，0.4-2.8g ;鈣，40_80g ;總磷，15g ;食鹽,30-60go
5.根據(jù)權利要求2所述生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料的制備方法，其特征在于復配方法為:每千克生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料含有:銅，360mg ;鐵，1200mg ;鋅，800mg ;錳，120mg ;碘，I.4mg ;硒，Img ;維生素 A，60000IU ;維生素 D3，15000IU ;維生素 E，160IU ;維生素K3，16mg ;維生素Bl，20mg ;維生素B2，20mg ;維生素B6,12mg ;維生素B12,0.12mg ;煙酸，200mg ;葉酸，6mg ;泛酸IOOmg ;氯化膽堿，2000mg ;賴氨酸，2.8g ;?丐，65g ;總磷，15g ;食鹽，30g。
6.根據(jù)權利要求2所述生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料的制備方法，其特征在于復配方法為:每千克生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料含有:銅，240mg ;鐵，600mg ；鋅，800mg ;錳，120mg ;碘，L4mg ;硒，Img ;維生素 A，40000IU ;維生素 D3，10000IU ;維生素E，120IU ;維生素K3，8mg ;維生素Bl，20mg ;維生素B2，20mg ;維生素B6，12mg ;維生素B12，0.08mg ;煙酸，200mg ;泛酸，IOOmg ;葉酸，4mg ;氯化膽堿,2000mg。賴氨酸，2.4g ;鈣，58g ;總磷，15g ;食鹽，30g。
7.根據(jù)權利要求2所述生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料的制備方法，其特征在于復配方法為:每千克生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料含有:銅，200mg ;鐵，1200mg ；鋅，800mg ;錳，120mg ;碘，1.4mg ;硒，Img ;維生素 A，50000IU ;維生素 D3，15000IU ;維生素E，200IU ;維生素K3，8mg ;維生素BI，IOmg ;維生素B2，40mg ;維生素B6，12mg ;維生素B12，0.32mg ;煙酸，200mg ；泛酸，IOOmg ；葉酸，6mg ;生物素,Img ;氯化膽堿，2000mg ;賴氨酸，0.4g ;?丐，65g ;總磷，15g ;食鹽，30g。
8.根據(jù)權利要求2所述生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料的制備方法，其特征在于復配方法為:每千克生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料含有:銅，200mg ;鐵，1200mg ；鋅，800mg ;錳，120mg ;碘，L4mg ;硒，Img ;維生素 A，50000IU ;維生素 D3，15000IU ;維生素E，200IU ;維生素K3，8mg ;維生素BI，IOmg ;維生素B2，40mg ;維生素B6，12mg ;維生素B12，0.32mg ;煙酸，200mg ;泛酸，IOOmg ;葉酸，60mg ;生物素,Img ;氯化膽堿,2000mg。賴氨酸，1.6g ;?丐,68g ;總磷,15g ;食鹽,30g。
9.權利要求2~9任一所述方法制備而得的生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料在生豬養(yǎng)殖上的應用。
10.根據(jù)權利要求9所述生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料在生豬養(yǎng)殖上的應用，其特征在于:生物發(fā)酵活性載體型復合預混合飼料占配制豬用全價飼料重量的10%。
【文檔編號】A23K1/00GK103907749SQ201410148294
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月10日 優(yōu)先權日:2014年4月10日
【發(fā)明者】李德元, 高嘉泰 申請人:李德元, 南京潤沃生物科技有限公司