專利名稱：一種芍藥胚培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物的組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及ー種芍藥胚培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
芍藥(Peaonia lactiflora Pali.)為芍藥科芍藥屬多年生宿根草本植物，是我國的傳統(tǒng)名花，在中國已有3900多年的栽培歷史。播種繁殖，方法簡單，種子隨采隨播，繁殖系數(shù)大，但芍藥播種繁殖存在如下問題I)由于經(jīng)過幾千年的人工栽培選育，芍藥優(yōu)良品種的雌蕊、雄蕊大部分瓣化，結(jié)實(shí)率低；2)芍藥種子有上胚軸休眠現(xiàn)象，種子萌發(fā)對季節(jié)的依賴性強(qiáng)，繁殖周期長，播后發(fā)育良好的植株4-5年才可開花；3)芍藥是異花授粉植物，播種繁殖無法保持母本的優(yōu)良性狀。目前，芍藥常規(guī)繁殖方法以分株繁殖為主，3-5年分株一次，周期長，繁殖系數(shù)低，很難適應(yīng)和滿足產(chǎn)業(yè)化大生產(chǎn)和國內(nèi)外市場的需求。芍藥組織培養(yǎng)可以解決育種中遠(yuǎn)緣雜交不能正常發(fā)育、種子休眠、種子生活力地下和自然不育、育種周期過長、品質(zhì)改良等方面的問題，且通過組織培養(yǎng)可以大大加快其繁殖速度，縮短育種年限，滿足現(xiàn)代大規(guī)模生產(chǎn)的需要。但關(guān)于芍藥屬植物的離體培養(yǎng)研究多集中于牡丹，芍藥的研究近年來雖已有進(jìn)展，但仍顯薄弱，目前國內(nèi)外研究較少，用的最多的是地下芽的組培，但是其生根移栽困難，且在打破上胚軸休眠、胚苗的誘導(dǎo)、増殖、生根方面存在較大的難題。而芍藥胚培養(yǎng)目前還未形成一套完整的體系，不能為芍藥的育種和生長提供很好的幫助。

發(fā)明內(nèi)容
針對芍藥傳統(tǒng)分株繁殖不能滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)需求，芍藥地下芽組培均存在困難的現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的在于提供一種芍藥胚培養(yǎng)方法，包括如下步驟I)胚的啟動(dòng)培養(yǎng)獲得經(jīng)滅菌消毒的芍藥胚，接種到以Ca2+濃度加倍的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有6-芐氨基嘌呤的濃度為0. 2-0. 5mg/L、萘こ酸的濃度為0-0. 05mg/L、赤霉素的濃度為0. lmg/L的培養(yǎng)基上，常規(guī)培養(yǎng)；2)將步驟I)中獲得的胚苗，先后進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、叢生芽増殖培養(yǎng)、壯苗生根培養(yǎng)，獲得芍藥組培苗。其中，步驟I)所述胚的啟動(dòng)培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基優(yōu)選以Ca2+濃度加倍的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有6-芐氨基嘌呤的濃度為0. 2mg/L、萘こ酸的濃度為0. 05mg/L、赤霉素的濃度為0. lmg/L的培養(yǎng)基上，或者以Ca2+濃度加倍的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有6-芐氨基嘌呤的濃度為0. 5mg/L、萘こ酸的濃度為Omg/L、赤霉素的濃度為0. Img/L的培養(yǎng)基。其中，步驟I)所述獲得經(jīng)滅菌消毒的芍藥胚，具體方法為將芍藥種子剝除種皮后，用洗潔精清洗種子表面的污潰，用1-3% (重量百分比)的NaClO浸泡20-30min，流水沖洗30-40min，用75% (體積百分比)的酒精消毒30s，無菌水沖洗至少一次，再用0. 1% (重量百分比)的HgCl2消毒lOmin，無菌水沖洗至少一次，去除胚乳，獲得經(jīng)滅菌消毒的芍藥胚。其中，步驟2)所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為以Ca2+濃度加倍的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有6-芐氨基嘌呤I. Omg/L、赤霉素0. 5mg/L的培養(yǎng)基。其中，步驟2)所述叢生芽増殖培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為以Ca2+濃度加倍的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有6-芐氨基嘌呤I. Omg/L、赤霉素0-1. Omg/L、激動(dòng)素0-1. 5mg/L的培養(yǎng)基。優(yōu)選以Ca2+濃度加倍的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有6-芐氨基嘌呤的濃度為I. Omg/L、赤霉素的濃度為I. 0mg/L的培養(yǎng)基。其中，步驟2)所述壯苗生根培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為以Ca2+濃度加倍的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有吲哚こ酸2. Omg/L、活性炭質(zhì)量百分含量0. 2%的培養(yǎng)基。 其中，所述胚的啟動(dòng)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為30天；所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為30-40天；所述叢生芽增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為30-40天；所述壯苗生根培育，培養(yǎng)時(shí)間為30天。其中，芍藥胚取材時(shí)間為9月上旬。其中，所述常規(guī)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為，溫度25±2°C，光照時(shí)間14小吋/天，光照強(qiáng)度1500-20001x。其中，所述芍藥，為芍藥品種粉玉奴、粉蓮絨或亳芍。本發(fā)明還提供所述的ー種芍藥胚培養(yǎng)的方法在芍藥繁育中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在干(I)本發(fā)明通過組培可以解決芍藥常規(guī)播種選育過程中遠(yuǎn)緣雜交種子不能正常發(fā)育、種子休眠、種子生活力低下和自然不育、育種周期過長、不能保持母本品質(zhì)等方面的問題，為芍藥的育種工作帶來很大的方便，為芍藥產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。(2)芍藥組培一直是國內(nèi)外的難題，用的最多的是地下芽的組培，但是其生根移栽困難，而通過愈傷的途徑，其分化存在的問題目前也很難解決，而本發(fā)明通過芍藥胚培養(yǎng)能很好的解決上述難題。(3)關(guān)于芍藥胚培養(yǎng)的系統(tǒng)的方法未見報(bào)道，而本發(fā)明通過對芍藥種胚的啟動(dòng)培養(yǎng)、叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、叢生芽増殖培養(yǎng)、壯苗生根培養(yǎng)，得到完整的芍藥組培苗植株，提供了一種有效的芍藥成熟胚離體培養(yǎng)方法。(4)本發(fā)明提供的芍藥胚培養(yǎng)方法，操作簡單，成本廉價(jià)，能夠廣泛適用于多數(shù)芍藥品種。(5)本發(fā)明還研究了多效唑(PP333)對芍藥胚培養(yǎng)的壯苗和生根的影響。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例I芍藥品種粉玉奴的胚培養(yǎng)于9月初從北京市昌平區(qū)小湯山國家花卉工程中心采取3年生以上的芍藥品種粉玉奴(可市售)的成熟種子作為外植體。I)胚的啟動(dòng)培養(yǎng)
將采集的種子用自來水浸泡3d后用刀片剝除外層堅(jiān)硬的種皮，用洗潔精清洗種子表面的污潰，用1%的NaClO浸泡30min，流水沖洗40min，用75%的酒精消毒30s，無菌水沖洗I次，再用0. 1%的HgCl2消毒lOmin，無菌水沖洗4次，去除胚乳后，將里面的小胚接種在胚的啟動(dòng)培養(yǎng)基上，啟動(dòng)培養(yǎng)采用不同的啟動(dòng)培養(yǎng)基分批次進(jìn)行，采用L9(34)的正交設(shè)計(jì)。啟動(dòng)培養(yǎng)基配方為表I所列的a-i各組培養(yǎng)基配方，a[l/2MS(Ca2+加倍)+0. 2BA]為以Ca2+濃度加倍的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有6-芐氨基嘌呤0. 2mg/L的培養(yǎng)基，b [1/2MS (Ca2+加倍)+0. 2BA+0. 05NAA+0. IGA3]為以Ca2+濃度加倍的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有6-芐氨基嘌呤0. 2mg/L、萘こ酸0. 05mg/L、赤霉素0. lmg/L的培養(yǎng)基，其他各組類推。各組培養(yǎng)基除激素種類與濃度不同外，均添加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，其他添加物及pH (5. 6-6. O )均相同。
溫度25 ± 2 °C，光照時(shí)間14小吋/天，光照強(qiáng)度1500-2000Ix條件下，常規(guī)培養(yǎng)30天。去除了種皮和胚乳的種胚接種一周左右，子葉就逐漸的展開，30天后子葉已完全展開，由原先的白色或紅色逐漸變成緑色，在兩片子葉中間有莖挺抽出，很多胚也直接長出主根,但也有部分底部長出愈傷組織。培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計(jì)種胚的發(fā)芽率、成苗率、生根率(表I)其中，b組培養(yǎng)基(發(fā)芽率70. 00%,成苗率30. 68%,生根率6. 67%)。和d組培養(yǎng)基(發(fā)芽率60. 00%,成苗率達(dá)到40. 00%,生根率13. 31%)經(jīng)驗(yàn)證，比其它培養(yǎng)基更適宜用來做芍藥胚培養(yǎng)的啟動(dòng)培養(yǎng)基。表I.啟動(dòng)培養(yǎng)基對芍藥品種粉玉奴胚啟動(dòng)培養(yǎng)的影響
權(quán)利要求
1.一種芍藥胚培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟 1)胚的啟動(dòng)培養(yǎng)獲得經(jīng)滅菌消毒的芍藥胚，接種到以Ca2+濃度加倍的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有6-芐氨基嘌呤的濃度為0. 2-0. 5mg/L、萘こ酸的濃度為0-0. 05mg/し赤霉素的濃度為0. lmg/L的培養(yǎng)基上，常規(guī)培養(yǎng)； 2)將步驟I)中獲得的胚苗，先后進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、叢生芽増殖培養(yǎng)、壯苗生根培養(yǎng)，獲得芍藥組培苗。
2.如權(quán)利要求I所述ー種芍藥胚培養(yǎng)的方法，其特征在于，步驟I)所述胚的啟動(dòng)培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為以Ca2+濃度加倍的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有6-芐氨基嘌呤的濃度為0. 2mg/L、萘こ酸的濃度為0. 05mg/L、赤霉素的濃度為0. lmg/L的培養(yǎng)基上，或者以Ca2+濃度加倍的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有6-芐氨基嘌呤的濃度為0. 5mg/L、萘こ酸的濃度為Omg/L、赤霉素的濃度為0. lmg/L的培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求I所述ー種芍藥胚培養(yǎng)的方法，其特征在于，步驟I)所述獲得經(jīng)滅菌消毒的芍藥胚，具體方法為將芍藥種子剝除種皮后，用洗潔精清洗種子表面的污潰，用1-3%的NaClO浸泡20-30min，流水沖洗30_40min，用75%的酒精消毒30s，無菌水沖洗至少一次，再用0. 1%的HgCl2消毒lOmin，無菌水沖洗至少一次，去除胚乳，獲得經(jīng)滅菌消毒的芍藥胚。
4.如權(quán)利要求I所述ー種芍藥胚培養(yǎng)的方法，其特征在于，步驟2)所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為以Ca2+濃度加倍的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有6-芐氨基嘌呤I. Omg/L、赤霉素0. 5mg/L的培養(yǎng)基。
5.如權(quán)利要求I所述ー種芍藥胚培養(yǎng)的方法，其特征在于，步驟2)所述叢生芽増殖培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為以Ca2+濃度加倍的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有6-芐氨基嘌呤I.Omg/L、赤霉素0-1. Omg/L、激動(dòng)素0-1. 5mg/L的培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求I所述ー種芍藥胚培養(yǎng)的方法，其特征在于，步驟2)所述叢生芽増殖培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為以Ca2+濃度加倍的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有6-芐氨基嘌呤的濃度為I. 0mg/L、赤霉素的濃度為I. 0mg/L的培養(yǎng)基。
7.如權(quán)利要求I所述ー種芍藥胚培養(yǎng)的方法，其特征在干，步驟2)所述壯苗生根培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為以Ca2+濃度加倍的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有吲哚こ酸2. Omg/し活性炭質(zhì)量百分含量0. 2%的培養(yǎng)基。
8.如權(quán)利要求I所述ー種茍藥胚培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述胚的啟動(dòng)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為30天；所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為30-40天；所述叢生芽増殖培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為30-40天；所述壯苗生根培育，培養(yǎng)時(shí)間為30天。
9.如權(quán)利要求I所述ー種芍藥胚培養(yǎng)的方法，其特征在干，芍藥胚取材時(shí)間為9月上旬。
10.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的一種茍藥胚培養(yǎng)的方法,在茍藥繁育中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種芍藥胚培養(yǎng)的方法，包括如下步驟通過對芍藥種胚的啟動(dòng)培養(yǎng)、叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、叢生芽增殖培養(yǎng)、壯苗生根培養(yǎng)，得到完整的芍藥組培苗植株。本發(fā)明所提供的芍藥胚培養(yǎng)方法操作簡單，成本廉價(jià)，能夠廣泛適用于多數(shù)芍藥品種，有效解決了芍藥傳統(tǒng)分株繁殖不能滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)需求，芍藥地下芽組培均存在困難的問題。本發(fā)明還提供所述芍藥胚培養(yǎng)的方法在芍藥繁育中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102763592SQ201210241719
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月12日
發(fā)明者于曉南, 張啟翔, 沈苗苗 申請人:北京林業(yè)大學(xué)