專(zhuān)利名稱(chēng)：一種禽蛋開(kāi)窗封口方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種禽蛋開(kāi)窗封口方法。
背景技術(shù)：
家禽轉(zhuǎn)基因?qū)τ讷@取特定基因類(lèi)型動(dòng)物模型及生產(chǎn)治療價(jià)值藥用蛋白具有十分重要的意義，科學(xué)與商業(yè)潛在價(jià)值巨大。由于家禽特殊的生殖、生理特點(diǎn)及受技術(shù)條件限制，目前最常用且又最實(shí)用的方法是針對(duì)禽蛋進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作。而針對(duì)禽蛋的操作必然涉及打開(kāi)蛋殼及殼膜以接近胚胎。又可分兩種情況，一是換蛋殼法，即被操作禽胚蛋較小，于鈍端打開(kāi)蛋殼轉(zhuǎn)基因操作后全蛋液移入一個(gè)較大的新鮮鈍端開(kāi)口的空蛋殼中(如用雞胚轉(zhuǎn)基因操作后，移入鵝蛋殼之中孵化)。顯然，這一方法操作復(fù)雜，試驗(yàn)材料獲取較困難，而且還需要特定的儀器設(shè)備，實(shí)際操作成功率也比較低；另一種是赤道板開(kāi)窗法，大致過(guò)程是先將蛋平放靜置幾小時(shí)，待胚胎上浮后，于平置禽蛋最高點(diǎn)(赤道板位置)處在蛋殼上打開(kāi)一個(gè)5mm見(jiàn)方的小孔，從小孔處觀察胚胎進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)基因操作，最后以特定材料封口后送孵。與換蛋殼法相比，開(kāi)窗法條件要求少，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，是比較主流的家禽轉(zhuǎn)基因操作方法。試驗(yàn)表明，禽蛋蛋殼打開(kāi)后會(huì)導(dǎo)致胚胎孵化率的大幅下降，如，Xu et al. (2009) 采用開(kāi)窗法以慢病毒注射獲得了 15%的孵化率，類(lèi)似方法Chapman et al. (2005)為4%， Harvey et al. (2002)及Mozdziak et al. (2003)采用致癌病毒制作轉(zhuǎn)基因雞的孵化率為 23%和36%，McGrew et al. (2004)采用換蛋殼方法孵化率為27%。如此低的孵化率，再考慮到較低的轉(zhuǎn)基因效率，實(shí)際每一次操作能得到的轉(zhuǎn)基因個(gè)體數(shù)十分有限，這成為限制家禽轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)的一個(gè)重要制約因素，因此，研究探討如何提高轉(zhuǎn)基因禽蛋孵化率就顯的十分必要，成為很多研究、生產(chǎn)者首要解決的問(wèn)題。就禽蛋開(kāi)窗后孵化率大幅降低的原因Ivarie團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了深入的研究其成員 Andacht et al. (2004)的試驗(yàn)結(jié)果表明，開(kāi)窗后少量空氣(氣泡)進(jìn)入禽蛋內(nèi)部既會(huì)導(dǎo)致孵化率的大幅下降(下降65%)，同時(shí)即使沒(méi)有空氣進(jìn)入，開(kāi)口長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣也會(huì)導(dǎo)致孵化率降低。由此，他們提出提高開(kāi)窗后禽蛋孵化率的關(guān)鍵就是避免操作過(guò)程中空氣的進(jìn)入，并以此為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行創(chuàng)新探索申報(bào)了兩項(xiàng)專(zhuān)利。專(zhuān)利一，禽蛋操作方法(METHODFOR MANIPULATING AVIAN EGGS, 1999, Patent Number 5, 897，998)。與常規(guī)操作方法相比，其創(chuàng)新之處在于，開(kāi)窗時(shí)先打開(kāi)蛋殼，但保留完整蛋殼膜，滴加液滴完全覆蓋開(kāi)口后，再去除蛋殼膜，過(guò)程中保持液滴形態(tài)以隔離空氣進(jìn)入蛋內(nèi)，然后透過(guò)液滴進(jìn)行相關(guān)胚胎操作并最后封口。經(jīng)過(guò)這一小小的改進(jìn)，孵化率從常規(guī)操作方法的8. 2%提高到32% (Speksnijder & Ivarie, 2000)。但這種方法也存在一些明顯的問(wèn)題如，滴加液體覆蓋開(kāi)口時(shí)，滴液量不容易控制，滴多了易流淌造成封隔空氣失敗，滴少失去封阻空氣進(jìn)入的效果(而大多蛋會(huì)吸收較多液體)，且不同蛋間外形差異大，難有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；而且，有些蛋殼表面常常有親水性，根本無(wú)法形成液滴達(dá)到封隔的目的，因此有人嘗試通過(guò)在封口周邊涂抹疏水物質(zhì)如石蠟油等，雖有一定效果，但仍然不方便操作，尤其是涂抹疏水物質(zhì)后常常影響最后封口的效果，導(dǎo)致封口不牢容易脫落而致孵化失敗。發(fā)明者也承認(rèn)通過(guò)這種方法改進(jìn)，雖然孵化率有明顯提高但仍有約40%禽蛋中進(jìn)入了氣泡，因此，在氣密性方面進(jìn)一步改進(jìn)方案仍有提高孵化效果的空間。專(zhuān)利二，蛋開(kāi)窗方法(METHODFOR WINDOWING EGGS, 2002, Patent No.US6, 397, 777 BI)針對(duì)專(zhuān)利一實(shí)施過(guò)程仍有氣泡進(jìn)入的問(wèn)題，Ivarie團(tuán)隊(duì)在專(zhuān)利一思路基礎(chǔ)之上做如下調(diào)整，首先是用低熔點(diǎn)熱熔膠代替液滴封阻空氣進(jìn)入，其次采用在蛋殼上開(kāi)兩孔方式有效排除空氣。具體過(guò)程是，除同專(zhuān)利一在禽蛋赤道板位置開(kāi)一窗口外，在禽蛋鈍端頂部再開(kāi)一窗口，但前者去除殼膜，而鈍端開(kāi)口保留完整殼膜，然后赤道板位置窗口以熱熔膠完全覆蓋，在熔膠未凝固前通過(guò)在鈍端窗口處隔蛋殼膜吹氣增壓使蛋內(nèi)氣泡通過(guò)赤道板窗口排出，胚胎操作也必須在熱熔膠凝固之前進(jìn)行。改進(jìn)后操作方法可將孵化率提高至45. 3%。但這種方法的弊端也顯而易見(jiàn)，最突出的問(wèn)題是，由于低熔點(diǎn)熱熔膠的凝固 點(diǎn)一般在60-80°C度，低于此溫度會(huì)很快凝固，在正常室溫操作環(huán)境下留給胚胎定位并操作及排出氣體的時(shí)間十分有限(而這往往是很費(fèi)時(shí)的)，常導(dǎo)致手忙腳亂，操作成功率很低。(操作成功率指能完成全部試驗(yàn)操作步驟的合格個(gè)體數(shù)，操作成功個(gè)體才進(jìn)入孵化并計(jì)算孵化率。)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種禽蛋開(kāi)窗封口方法。本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)—種禽蛋開(kāi)窗封口方法,于禽蛋赤道板位置開(kāi)直徑為O. 3cm O. 6cm窗口，保留完整蛋殼膜，以窗口中心為圓心以固體形式在蛋殼上圍成一個(gè)內(nèi)徑為O. 8cm I. 2cm的同心封閉圈，待同心封閉圈與蛋殼表面粘合牢固后滴加生理緩沖液，在緩沖液封阻條件下去除蛋殼膜，定位胚胎并進(jìn)行胚胎操作，然后用事先準(zhǔn)備好的直徑為O. 6cm I. Ocm的蛋殼膜在液面下完全覆蓋窗口，以吸水紙吸取封閉圈中的多余液體，再以熱熔膠充填封閉圈內(nèi)部進(jìn)行封口。所述的開(kāi)窗方法中，優(yōu)選以窗口中心為圓心以熱熔膠、明膠或用橡膠圈粘上粘膠在蛋殼上圍成一個(gè)內(nèi)徑為O. 8cm I. 2cm的固體同心封閉圈。所述的熱熔膠優(yōu)選低軟化點(diǎn)熱熔膠，進(jìn)一步優(yōu)選EVA熱熔膠。所述的生理緩沖液為加入抗生素的生理緩沖液，優(yōu)選加入1%0 (w/v)氨芐青霉素及鏈霉素的生理緩沖液，進(jìn)一步優(yōu)選加入1%。(lmg/1000ml)氨芐青霉素及鏈霉素的pH
7.2,0. 02M的PBS緩沖液、Hanks緩沖液、M199培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基中的任一種。所述的緩沖液中優(yōu)選加入抗氧化劑。所述的抗氧劑選自Vc、VE、槲皮素、茶多酚、沒(méi)食子酸丙酯、愈創(chuàng)樹(shù)脂、N—乙酰半胱氨酸、白藜蘆醇、a-硫辛酸或蘆丁，優(yōu)選Vc、VE、槲皮素。Vc在所述的緩沖液中的終濃度優(yōu)選為2-20 μ g/ml ；VE在所述的生理緩沖液中的終濃度優(yōu)選為5-25 μ Μ，槲皮素在所述的生理緩沖液中的終濃度優(yōu)選為0. 1-0. 5 μ M0所述的禽蛋為雞蛋、鴨蛋、鵝蛋或其它禽卵。有益效果本發(fā)明在開(kāi)窗前先使用熱熔膠、明膠等圍成固體封閉圈，再滴加生理緩沖液，在緩沖液封阻條件下去除蛋殼膜，具有如下優(yōu)點(diǎn)1、保證有足夠量的封阻空氣用液體，不會(huì)流淌，可完全避免空氣的進(jìn)入。2、由于熱熔膠、明膠等本身有疏水性，加液后可一直保持凸出狀，有放大鏡效果便于觀察蛋內(nèi)胚胎。3、由于熱熔膠封閉圈是在加液及其它操作前先粘合于蛋殼之上，完全密閉，粘結(jié)牢固不會(huì)脫落。4、孵化率高，在已知慢病毒對(duì)細(xì)胞有毒性作用的前提下孵化率仍達(dá)48. 9%。5、保證充裕試驗(yàn)操作時(shí)間。6、操作簡(jiǎn)單，過(guò)程易于控制。作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，我們對(duì)生理緩沖液的成分進(jìn)行了調(diào)整、改變，增加了新成分抗氧化劑。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)及試驗(yàn)分析，禽蛋孵化率下降與空氣進(jìn)入有關(guān)，同時(shí)禽蛋開(kāi)窗后即使沒(méi)能進(jìn)入氣泡，長(zhǎng)時(shí)間曝露于空氣中也可使孵化率下降，因此我們懷疑孵化率的下降可能與蛋清中氧分壓增大導(dǎo)致氧化應(yīng)激有關(guān)。我們選擇常見(jiàn)抗氧化劑維生素C(Vc)、維生素E(VE)、槲皮素進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)比不同濃度Vc、VE、槲皮素對(duì)開(kāi)窗禽蛋孵化率的影響， 發(fā)現(xiàn)低濃度VC可使孵化率提高約10個(gè)百分點(diǎn)，VE、槲皮素提高約3-5個(gè)百分點(diǎn)。



圖I不同處理組孵化率比較。圖2轉(zhuǎn)基因PCR驗(yàn)證圖。其中，I 8泳道分別表示檢測(cè)樣品，M為分子量標(biāo)記。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例II. I禽蛋開(kāi)窗受精雞蛋取自溫氏集團(tuán)太倉(cāng)種雞場(chǎng)。新鮮受精蛋經(jīng)75酒精表面滅菌后平置于蛋盤(pán)上，用普通墨水標(biāo)記最高點(diǎn)后，室溫過(guò)夜使胚盤(pán)上浮固定。第二天，用迷你電鉆(臺(tái)灣寶工，型號(hào)1PK-500B-2)于雞蛋側(cè)面標(biāo)記處打磨約0. 3-0. 6cm見(jiàn)方的窗口，同時(shí)注意保持蛋殼膜的完整。用軟毛筆先清掃表面殼粉，再用75%酒精棉球擦拭干凈，待干后，以熱熔膠槍(喬爾迅雷，型號(hào)XL-E20K，普通EVA熱熔膠)推膠，使熱熔膠形成以窗口中心為圓心，內(nèi)徑約Icm的同心封閉圈。熱熔膠凝固，同心封閉圈與蛋殼表面粘合牢固,在熔膠圈內(nèi)滴入含雙抗(1%。氨芐青霉素及鏈霉素，下同)的PBS(pH7. 2，0. 02M)至滿(mǎn)，以11號(hào)手術(shù)刀小心沿窗口內(nèi)緣切開(kāi)蛋殼膜，再用尖嘴鑷子將蛋殼膜取出，最后，尋找胚盤(pán)進(jìn)入下一步操作。試驗(yàn)中以Hanks或M199 (GIBCO)代替PBS有同樣的效果。以上為標(biāo)準(zhǔn)操作，作為替代改進(jìn)方案，部分試驗(yàn)中在生理緩沖液中添加了不同濃度VC，分別為IOii g/ml、50ii g/ml， 其他操作同上(各抗氧化劑購(gòu)自SIGMA)。I. 2病毒注射病毒生產(chǎn)按Invitrogen公司慢病毒包裝試劑盒(ViraPower Lentiviral Directional TOPO Expression Kit K4950-00)操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，最后病毒滴度以有酚紅DMEM調(diào)整為IO7個(gè)轉(zhuǎn)染單位/ml。一旦發(fā)現(xiàn)胚盤(pán)，以顯微注射針吸取5 10 yl 病毒注射胚下腔，以胚盤(pán)中間透明區(qū)變紅為注射成功。I. 3封口與孵化注射成功后，以尖嘴鑷子取事先準(zhǔn)備的直徑約8mm的蛋殼膜，蛋清面朝下透過(guò)PBS緩沖液緊貼并完全覆蓋窗口，然后以滅菌過(guò)的吸水紙小心吸走封閉圈內(nèi) PBS,馬上以熱溶膠注滿(mǎn)封閉圈，凝固后標(biāo)記孵化。孵化條件為1-18天37. 8°C濕度55%，90 分鐘翻蛋一次；19-21天37. 2°C濕度75%。I. 4常規(guī)方法新鮮受精雞蛋經(jīng)75%酒精表面滅菌后平置于蛋盤(pán)上，標(biāo)記最高點(diǎn)后，室溫過(guò)夜使胚盤(pán)上浮固定。第二天于雞蛋側(cè)面標(biāo)記處開(kāi)一約4_見(jiàn)方的窗口，滴入含雙抗PBS后尋找胚盤(pán)，一旦發(fā)現(xiàn)胚盤(pán)，以顯微注射針吸取5 10 μ I慢病毒液按照I. 2中所述的方法進(jìn)行病毒注射。用經(jīng)滅菌處理附帶蛋殼膜的合適大小的蛋殼封口，以醫(yī)用膠帶固定。I. 5結(jié)果分析結(jié)果如圖1，以未開(kāi)窗雞蛋為對(duì)照組，設(shè)置四組實(shí)驗(yàn)常規(guī)指以1.4常規(guī)方法進(jìn)行慢病毒注射；PBS組指按我們標(biāo)準(zhǔn)方法病毒注射，只加雙抗的PBS ；PBS+低VC組指按改進(jìn)方法病毒注射，含雙抗PBS中加10μ g/mlVC ;PBS+高VC組指按改進(jìn)方法病毒注射，含雙抗PBS中加50 μ g/mlVC0結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)方法孵化率達(dá)39. I %，而在加低濃度VC后孵化率提高了 9. 8個(gè)百分點(diǎn)達(dá)48. 9%，但高濃度VC對(duì)雞胚有毒害作用，孵化率大幅下降。I. 6轉(zhuǎn)基因檢測(cè)取出孵個(gè)體殘留在蛋殼內(nèi)的尿膜絨囊膜，用genomicDNA purification kit (Promega)抽提基因組DNA,方法參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)基因檢測(cè)用PCR方法，引物設(shè)計(jì)可特異識(shí)別慢病毒載體特定片段，序列為FPLV2:ACCTGAMGCGAAAGGGAMC (SEQ ID NO. I) ,RPLV2 CACCCATCTCTCTCCTTCTAGCC (SEQ ID NO. 2)。PCR 用 Taq 酶選擇 TaKaRa TaqTM Hot Start Version (TaKaRa 貨號(hào) DR007A)反應(yīng)程序 94°C，5min94°C,30sec60°C,30sec72°C,30sec
FPLV20.5 μ I
RPLV20.5μΙ
Taq 酶0.125μΙ反應(yīng)體系(25μI) dNTP2μΙ
IOxbuffer2.5μΙ
H2O19.375μΙ
基因組DNA IOOngPCR產(chǎn)物的電泳圖見(jiàn)圖2，I 8泳道分別表示檢測(cè)樣品，M為分子量標(biāo)記。檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)在有效提取樣品中，轉(zhuǎn)基因檢出效率為47%。實(shí)施例2受精雞蛋取自溫氏集團(tuán)太倉(cāng)種雞場(chǎng)。新鮮受精蛋經(jīng)75%酒精表面滅菌后平置于蛋盤(pán)上，用普通墨水標(biāo)記最高點(diǎn)后，室溫過(guò)夜使胚盤(pán)上浮固定。第二天，用迷你電鉆(臺(tái)灣寶工，型號(hào)1ΡΚ-500Β-2)于雞蛋側(cè)面標(biāo)記處打磨約O. 3-0. 6cm見(jiàn)方的窗口，同時(shí)注意保持蛋殼膜的完整。用軟毛筆先清掃表面殼粉，再用75%酒精棉球擦拭干凈，待干后，以明膠在蛋殼上圍成一個(gè)以窗口中心為圓心，內(nèi)徑約Icm的同心封閉圈。待凝固后,在明膠圈內(nèi)滴入含雙抗(1%。w/v氨芐青霉素及1%。w/v鏈霉素，下同)^ 2 μ g/ml的PBS (ρΗ7· 2，O. 02M)至滿(mǎn)，以11號(hào)手術(shù)刀小心沿窗口內(nèi)緣切開(kāi)蛋殼膜，再用尖嘴鑷子將蛋殼膜取出，尋找胚盤(pán)按照實(shí)施例I中I. 2 I. 3記載的方法進(jìn)行病毒注射、封口與孵化。結(jié)果顯示孵化率達(dá)43. 1%。按照I. 6中記載的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，在有效提取樣品中，轉(zhuǎn)基因檢出效率為45%。實(shí)施例3
方法同將實(shí)施例2，僅將明膠替換為熱熔膠，Vc濃度改為20ii g/ml，孵化率達(dá) 45. 2%，在有效提取樣品中，轉(zhuǎn)基因檢出效率為48%。實(shí)施例4 方法同將實(shí)施例2，僅將明膠替換為熱熔膠，Vc替換為25iiM VE，孵化率達(dá) 43. 2%，在有效提取樣品中，轉(zhuǎn)基因檢出效率為45%。實(shí)施例5方法同將實(shí)施例4，僅將VE濃度改為5 U M，緩沖液替換為Hanks緩沖液，孵化率達(dá) 42. 3%，在有效提取樣品中，轉(zhuǎn)基因檢出效率為43%。實(shí)施例6方法同將實(shí)施例2，僅將Vc替換為0. 5 ii M槲皮素，孵化率達(dá)44. 6 %，在有效提取樣品中，轉(zhuǎn)基因檢出效率為44%。實(shí)施例7方法同將實(shí)施例5，蛋殼上的同心圓以橡膠圈粘上粘膠圍成，并將槲皮素濃度改為
0.I PM槲皮素，孵化率達(dá)42.6%，在有效提取樣品中，轉(zhuǎn)基因檢出效率為42%。參考文獻(xiàn)Andacht T, Hu ff, lvarie R. Rapid and improved method for windowing eggs accessing the stage X chicken embryo. Mol Reprod Dev.69 (2004) :31-34.Chapman SC,et al. Ubiquitous GFP expression in transgenic chickens using a lentiviral vector. Development 132 (2004),935-940Harvey AJ, et al. Expression of exogenous protein in the egg white of transgenic chickens. Nat. Biotechnol. 20(2002) :396-399.McGrew MJ, et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. EMBO 5 (2004)728-733.Mozdziak PE, et al. Development of transgenic chickens expressing bacterial b-galactosidase. Dev. Dynam. 226(2003) :439-445.Speksnijder G, lvarie R. . A modified method of shell windowing for producing somatic or germline chimeras in fertilized chicken eggs. Poult Sci. 79(2000) :1430-3.Xu SY, et al.Efficient production of transgenic chickens using self-inactive HIV-based lentiviral vectors. Current Zoology 55(2009) 383-387.
權(quán)利要求
1.一種禽蛋開(kāi)窗封口方法,其特征在于于禽蛋赤道板位置開(kāi)直徑為O. 3cm O. 6cm窗口，保留完整蛋殼I旲，以窗口中心為圓心以固體形式在蛋殼上圍成Iv內(nèi)徑為O. 8cm I.2cm的同心封閉圈，待同心封閉圈與蛋殼表面粘合牢固后滴加生理緩沖液，在緩沖液封阻條件下去除蛋殼膜，定位胚胎并進(jìn)行胚胎操作，然后用事先準(zhǔn)備好的直徑為O. 6cm I. Ocm的蛋殼膜在液面下完全覆蓋窗口，以吸水紙吸取封閉圈中的多余液體，再以熱熔膠或明膠充填封閉圈內(nèi)部進(jìn)行封口。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的禽蛋開(kāi)窗封口方法，其特征在于以所述的窗口中心為圓心以熱熔膠、明膠或用橡膠圈粘上粘膠在蛋殼上圍成一個(gè)內(nèi)徑為O. 8cm I. 2cm的同心封閉圈。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的禽蛋開(kāi)窗封口方法，其特征在于所述的熱熔膠為低軟化點(diǎn)熱熔膠，優(yōu)選EVA熱熔膠。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的禽蛋開(kāi)窗封口方法，其特征在于所述的生理緩沖液為加入抗生素的生理緩沖液，優(yōu)選加入1%。(w/v)氨芐青霉素及鏈霉素的生理緩沖液，進(jìn)一步優(yōu)選加入1%。(w/v)氨芐青霉素及鏈霉素的pH 7. 2,0. 02M的PBS緩沖液、Hanks緩沖液、M199培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基中的任一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的禽蛋開(kāi)窗封口方法，其特征在于所述的生理緩沖液中加入抗氧化劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的禽蛋開(kāi)窗封口方法，其特征在于所述的抗氧劑選自Vc、VE、槲皮素、茶多酚、沒(méi)食子酸丙酯、愈創(chuàng)樹(shù)脂、N 一乙酰半胱氨酸、白藜蘆醇、a-硫辛酸或蘆丁。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的禽蛋開(kāi)窗封口方法，其特征在于所述的抗氧劑為Vc、VE或槲皮素。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的禽蛋開(kāi)窗封口方法，其特征在于所述的抗氧劑為Vc，Vc在所述的生理緩沖液中的終濃度為2-20μ g/ml，VE在所述的生理緩沖液中的終濃度為5-25 μ Μ，槲皮素在所述的生理緩沖液中的終濃度為O. 1-0. 5 μ M0
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的禽蛋開(kāi)窗封口方法，其特征在于所述的禽蛋為雞蛋、鴨蛋、鵝蛋或其它禽卵。
全文摘要
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種禽蛋開(kāi)窗封口方法。本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化操作方案，有效阻隔外來(lái)空氣進(jìn)入開(kāi)窗蛋殼內(nèi)部，有效提高轉(zhuǎn)基因禽蛋孵化率及轉(zhuǎn)基因效率。優(yōu)點(diǎn)包括1、保證有足夠量的封阻空氣用液體，不會(huì)流淌，可完全避免空氣的進(jìn)入。2、由于熱熔膠本身有疏水性，加液后可一直保持凸出狀，有放大鏡效果便于觀察蛋內(nèi)胚胎。3、由于熱熔膠封閉圈是在加液及其它操作前先粘合于蛋殼之上，完全密閉，粘結(jié)牢固不會(huì)脫落。4、孵化率高，在已知慢病毒對(duì)細(xì)胞有毒性作用的前提下孵化率仍達(dá)48.9％。5、保證充裕試驗(yàn)操作時(shí)間。6、操作簡(jiǎn)單，過(guò)程易于控制。
文檔編號(hào)A01K45/00GK102613109SQ20121010453
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月10日
發(fā)明者劉紅林, 張宏曉, 徐世永, 戴鼎震, 王憲葉, 翟樂(lè), 陳維康 申請(qǐng)人:劉紅林, 徐世永