專利名稱：：一種篤斯越桔根瘤試管內(nèi)直接誘導(dǎo)、快繁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物繁殖，即篤斯越桔根瘤試管內(nèi)直接誘導(dǎo)、快繁方法。
背景技術(shù)：
：在現(xiàn)有技術(shù)中，篤斯越桔(VacciniumuliginosumLinn.)，又稱篤斯、甸果、地果、龍果、訥日蘇(蒙古族語(yǔ))。篤斯越桔是杜鵑花科越桔屬落葉小灌木，《吉林省野生動(dòng)植物保護(hù)管理暫行條例》中定為省級(jí)一類重點(diǎn)保護(hù)植物。是野生觀賞植物和珍稀瀕危藥用植物，主要功能為清熱、收斂等。果可生食，酸甜可口，汁液豐富，做果酒、果醋、果醬、果汁及提取天然食用色素的原料，被國(guó)際糧農(nóng)組織定為五大健康食品之一。其分布區(qū)甚狹，長(zhǎng)白山區(qū)數(shù)量非常稀少，僅在長(zhǎng)白山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)有較大種群分布。野生產(chǎn)果量低，人工馴化栽培后生長(zhǎng)勢(shì)弱，導(dǎo)致果的產(chǎn)量極低和品質(zhì)極差，開(kāi)發(fā)和利用受到極大限制。越桔根系沒(méi)有根毛，吸收能力比具有根毛的根系小得多，但自然條件下幾乎所有的越桔細(xì)根都有EM(Eri0Cdimy0ChrriaZ，EM)內(nèi)生菌根真菌的寄生，從而克服了越桔由于沒(méi)有根毛而造成的對(duì)水分及營(yíng)養(yǎng)的吸收困難，改善植株?duì)I養(yǎng)狀況，調(diào)節(jié)宿主的代謝活性，增強(qiáng)植株的抗逆性，提高越桔的產(chǎn)量，加快移栽苗成活速度，節(jié)約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，增加經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量和效益。因而將越桔組培技術(shù)和菌根化技術(shù)相結(jié)合，生產(chǎn)生長(zhǎng)勢(shì)旺、抗逆能力強(qiáng)的越桔苗木是一項(xiàng)很有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的研究項(xiàng)目。在國(guó)外，新西蘭已經(jīng)將接種菌根真菌作為促進(jìn)越桔生長(zhǎng)、提高肥料利用率、提高產(chǎn)量的一項(xiàng)有效措施。而在國(guó)內(nèi)EM真菌的分離和研究幾乎還是一片空白。要生產(chǎn)菌根化苗木的關(guān)鍵是選用適宜當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)條件的優(yōu)良菌種用于接種，培育出優(yōu)質(zhì)的菌根化越桔種苗，在生產(chǎn)和應(yīng)用中將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。為了更好的開(kāi)發(fā)利用這一極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的野生珍貴資源，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)在成功完成叢生芽誘導(dǎo)和生根的基礎(chǔ)上，又以野生篤斯越桔根芽的嫩莖在試管內(nèi)開(kāi)展了直接誘導(dǎo)根瘤的研究，旨在建立篤斯越桔根瘤苗快繁體系，為篤斯越桔增產(chǎn)和提高品質(zhì)提供基礎(chǔ)保障。同時(shí)，應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)對(duì)篤斯越桔根瘤誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，以期縮短培養(yǎng)基的摸索周期。目前，越桔屬植物根瘤的研究大多集中在根瘤菌的分離和鑒定方面，很少達(dá)到與植物的共建并利用于栽培生產(chǎn)。本研究開(kāi)展的篤斯越桔試管內(nèi)根瘤直接誘導(dǎo)和含根瘤苗高效快繁的報(bào)道國(guó)內(nèi)外迄今未見(jiàn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)上述不足而提供一種技術(shù)可行的篤斯越桔根瘤試管內(nèi)直接誘導(dǎo)、快繁方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是篤斯越桔根瘤試管內(nèi)直接誘導(dǎo)、快繁方法，其特征在于步驟如下(1)以篤斯越桔根部分蘗的嫩芽為外植體，對(duì)外植體進(jìn)行處理，其適合的嫩芽根瘤誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為:1/4MS+IAA0.80mgI^+IBAO.04mgL_1+GA30.15mgI71。式中MS為1962年由Murashige和Skoog發(fā)明的一種常用培養(yǎng)基，IAA為吲哚乙酸，IBA為吲哚丁酸，GA3為赤霉素。(2)采用已產(chǎn)生根瘤的再生植株的莖節(jié)為材料在試管利用節(jié)增殖的方法進(jìn)行快繁，將含有根瘤的試管苗于根上部留12葉切下，并將切下的小枝條再切割成一葉一段轉(zhuǎn)接到優(yōu)化后的根瘤誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行同時(shí)腋芽萌發(fā)、生長(zhǎng)及根瘤再生培養(yǎng)，以38d為一個(gè)繼代增殖周期，每瓶增殖倍數(shù)平均達(dá)70以上。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是采用篤斯越桔根芽為試材進(jìn)行根瘤誘導(dǎo)，并在試管內(nèi)成功誘導(dǎo)出根瘤。含根瘤苗的快繁利用再生植株的莖節(jié)為材料，采取節(jié)增殖的方法，從而縮短了繼代增殖周期，提高了增殖倍數(shù)，方法簡(jiǎn)捷，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，可操作性強(qiáng)，達(dá)到了快繁的目標(biāo)，可用于含根瘤的篤斯越桔苗的工廠化育苗，且均在試管內(nèi)進(jìn)行，同時(shí)，應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)處理、分析數(shù)據(jù)和再試驗(yàn)大大縮短了培養(yǎng)基配方的摸索周期。篤斯越桔根瘤技術(shù)可為長(zhǎng)白山區(qū)野生資源的開(kāi)發(fā)利用和中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化提供技術(shù)保障。下面將結(jié)合附圖、實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。圖1是篤斯越桔根芽嫩莖段的萌發(fā)照片；圖2是篤斯越桔根瘤誘導(dǎo)初期培養(yǎng)照片；圖3是篤斯越桔根瘤誘導(dǎo)中期照片；圖4是篤斯越桔根瘤誘導(dǎo)后期照片；圖5是篤斯越桔含有根瘤的植株照片；圖6是篤斯越桔不含根瘤的植株照片。具體實(shí)施例方式篤斯越桔根瘤試管內(nèi)直接誘導(dǎo)、快繁方法包括以下步驟1材料與方法1.1外植體材料的處理8月于長(zhǎng)白山北坡海拔1400m針闊混交林林緣采矮壯且萌蘗多的篤斯越桔根芽在超凈工作臺(tái)上用70%酒精涮洗10s，用含3%次氯酸鈉溶液浸泡3min，無(wú)菌水沖洗8次。用無(wú)菌濾紙吸干表面水分，切除被殺菌消毒劑損傷部分后切割成12葉1段作為外植體備用。1.2根瘤直接誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選將外植體在培養(yǎng)基1/4MS+KT1.50mgL—1上培養(yǎng)出腋芽，待腋芽長(zhǎng)至23cm時(shí)，將腋芽從葉腋處切下轉(zhuǎn)接到以1/4MS為培養(yǎng)基，附加不同質(zhì)量濃度的IAA、IBA(由預(yù)試驗(yàn)可知，IAA和IBA質(zhì)量濃度均控制在0.100.50mgL"1之間)和GA3(由預(yù)試驗(yàn)可知，質(zhì)量濃度控制在0.301.OOmg.L—1之間)，添加蔗糖10g.L-1，瓊脂8.3(^*171，調(diào)節(jié)口11值為5.5。在溫度(20士2)°C，光照強(qiáng)度12001x條件下培養(yǎng)，光照周期14hcf1。培養(yǎng)40d統(tǒng)計(jì)并計(jì)算出根瘤誘導(dǎo)率，篩選最適宜的篤斯越桔根瘤誘導(dǎo)培養(yǎng)基。1.3根瘤苗快繁體系的建立采用已產(chǎn)生根瘤的再生植株的莖節(jié)為材料在試管內(nèi)利用節(jié)增殖的方法進(jìn)行快繁，即將含有根瘤的試管苗于根上部向下留12葉切下，并將切下的小枝條再切割成一葉一段轉(zhuǎn)接到優(yōu)化后的根瘤誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行同時(shí)腋芽萌發(fā)、生長(zhǎng)及根瘤再生培養(yǎng)。統(tǒng)計(jì)并計(jì)算出增殖周期和增殖倍數(shù)。1.4數(shù)據(jù)分析與處理為了提高篤斯越桔根瘤的誘導(dǎo)率，采用均勻設(shè)計(jì)法[8_1(1]，選用U10(IOs)均勻表，每個(gè)處理數(shù)接種腋芽數(shù)為30，重復(fù)3次，同時(shí)考察了IAA、IBA和GA3質(zhì)量濃度交叉配比對(duì)根瘤誘導(dǎo)率的影響。數(shù)據(jù)分析與處理采用均勻設(shè)計(jì)(UniformDesign)軟件。2結(jié)果與分析2.11/4MS培養(yǎng)基中不同質(zhì)量濃度IAA、IBA和GA3的交叉配比對(duì)篤斯越桔根瘤誘導(dǎo)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>試驗(yàn)數(shù)據(jù)(表1)經(jīng)均勻設(shè)計(jì)軟件處理后得回歸方程Y=75.6+45.OX1-18.0X2_23.IX3,樣本容量N=10，顯著性水平α=0.05，復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.9754，檢驗(yàn)值Ft=39.18，臨界值Ftotl5,3,6)=4.757Ft>F(aQ5,3,6)，回歸方程顯著。根據(jù)回歸方程求出Y的最優(yōu)組合為=X1=0.50，X2=0.10，X3=0.30，在此組合基礎(chǔ)上求得最優(yōu)解y=89.3，此解為回歸方程的解析解，需按公式Y(jié)=y±ua·s(其中y為最優(yōu)組合基礎(chǔ)上求得的最優(yōu)解，Ua為正態(tài)分布的雙側(cè)分位數(shù)，s為剩余標(biāo)準(zhǔn)差)計(jì)算出優(yōu)化值區(qū)間估計(jì)為Y=89.3士7.01，即82.29%96.31%。通過(guò)計(jì)算各方程項(xiàng)對(duì)回歸的貢獻(xiàn)率(U/U=38.3%，U2/U=6.70%,U3/U=28.6%)可知，IAA和GA3對(duì)篤斯越桔試管苗根瘤誘導(dǎo)率Y的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于IBA，又因IAA的質(zhì)量濃度與根瘤誘導(dǎo)率呈正相關(guān)，IBA和GA3的質(zhì)量濃度與根瘤誘導(dǎo)率呈負(fù)相關(guān)，猜測(cè)IAA質(zhì)量濃度在0.50mg·Γ1以上，IBA質(zhì)量濃度在0.50mg·Γ1以下和GA3質(zhì)量濃度在0.30mg·Γ1以下有較高根瘤誘導(dǎo)率的峰值，因此，又以IAA質(zhì)量濃度為0.50,0.60,0.70,0.80,0.90和1.OOmg·廠1，IBA質(zhì)量濃度為0.02,0.04,0.06,0.08和0.IOmg·Γ1以及GA3質(zhì)量濃度為0.03,0.06,0.09,0.12,0.15,0.18,0.21,0.24,0.27和0.30mg·L—1做了10個(gè)處理的補(bǔ)充試驗(yàn)，重復(fù)3次，發(fā)現(xiàn)IAA質(zhì)量濃度為0.80mg·L—1、IBA質(zhì)量濃度為0.04mg·L—1和GA3質(zhì)量濃度為0.15mg·L—1時(shí)篤斯越桔根瘤誘導(dǎo)率最高且誘導(dǎo)速度最快。即待篤斯越桔根芽嫩莖腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)至23cm時(shí)(見(jiàn)圖1)，將腋芽從葉腋處切下轉(zhuǎn)接到附加IAAO.80mg·Γ1、ΙΒΑ0.04mg·L-1和GA3O.15mg·L-1的1/4MS培養(yǎng)基中再次進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，每個(gè)處理數(shù)接種腋芽數(shù)為30，重復(fù)3次，腋芽培養(yǎng)至9d時(shí)發(fā)現(xiàn)腋芽切口處形成大量錐形顆粒，15d后顆粒由錐形狀逐漸伸長(zhǎng)形成白色的不定根；培養(yǎng)至27d時(shí)，不定根基部逐漸增粗且有半木質(zhì)化現(xiàn)象出現(xiàn)(見(jiàn)圖2)，35d后在主根和側(cè)根上產(chǎn)生根瘤(見(jiàn)圖3)，繼續(xù)培養(yǎng)至47d后主根和側(cè)根上的根瘤逐漸增多并形成竄狀(見(jiàn)圖4)，這樣的苗由發(fā)根處又發(fā)出35根苗形成叢生狀(見(jiàn)圖5)，較未產(chǎn)生根瘤的植株(見(jiàn)圖6)矮壯、生長(zhǎng)勢(shì)旺且根和苗的形態(tài)、發(fā)育均接近于野生植株，根瘤誘導(dǎo)率達(dá)95.6%以上。在估計(jì)區(qū)間內(nèi)，比表1所列10個(gè)處理的誘導(dǎo)率均高。可見(jiàn)，篤斯越桔根瘤誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為l/4MS+IAA0.80mg·L_1+IBA0.04mg·L_1+GA30.15mg·lA2.2根瘤苗快繁體系的建立采取1.3的方法，待含有根瘤的苗生長(zhǎng)至4.OOcm以上時(shí)，在超凈工作臺(tái)上打開(kāi)培養(yǎng)瓶將含有根瘤的試管苗于根上部留12葉切下，并將切下的小枝條再切割成一葉一段轉(zhuǎn)接到優(yōu)化后的根瘤誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/4MS+IAA0.80mg·L^+IBAO.04mg·!^+GA3O.15mg·Γ1中進(jìn)行同時(shí)腋芽萌發(fā)、生長(zhǎng)及根瘤再生培養(yǎng)。38d為1個(gè)繼代增殖周期，每瓶增殖倍數(shù)平均達(dá)70以上，隨著繼代次數(shù)的增加可適當(dāng)降低生長(zhǎng)素IAA、IBA和GA3濃度。3結(jié)論與討論實(shí)驗(yàn)證明，培養(yǎng)基1/4MS+IAA0.80mg'L^+IBAO.04mg.!^+GA3O.15mg對(duì)篤斯越桔試管苗直接誘導(dǎo)根瘤效果最好，速度快且誘導(dǎo)率高。帶有根瘤的苗由發(fā)根處又發(fā)出35根苗形成叢生狀，植株矮壯、生長(zhǎng)勢(shì)旺且根和苗的形態(tài)、發(fā)育均接近于野生植株，可能是根瘤菌產(chǎn)生一定量的細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)等原因。權(quán)利要求一種篤斯越桔根瘤試管內(nèi)直接誘導(dǎo)、快繁方法，其特征在于步驟如下(1)以篤斯越桔根部分蘗的嫩芽為外植體，對(duì)外植體進(jìn)行處理，其適合的嫩芽根瘤誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為1/4MS+IAA0.80mg·L-1+IBA0.04mg·L-1+GA30.15mg·L-1；(2)采用已產(chǎn)生根瘤的再生植株的莖節(jié)為材料在試管利用節(jié)增殖的方法進(jìn)行快繁，將含有根瘤的試管苗于根上部留1～2葉切下，并將切下的小枝條再切割成一葉一段轉(zhuǎn)接到優(yōu)化后的根瘤誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行同時(shí)腋芽萌發(fā)、生長(zhǎng)及根瘤再生培養(yǎng)，以38d為一個(gè)繼代增殖周期，每瓶增殖倍數(shù)平均達(dá)70以上。2.按照權(quán)利要求1所述的篤斯越桔根瘤試管內(nèi)直接誘導(dǎo)、快繁方法，其特征在于對(duì)外植體進(jìn)行處理是指在超凈工作臺(tái)上用70%酒精涮洗10s，用含3%次氯酸鈉溶液浸泡3min，無(wú)菌水沖洗8次；用無(wú)菌濾紙吸干表面水分，切除被殺菌消毒劑損傷部分后切割成12葉1段作為外植體備用。3.按照權(quán)利要求1所述的篤斯越桔根瘤試管內(nèi)直接誘導(dǎo)、快繁方法，其特征在于誘導(dǎo)率為95.6%。全文摘要本發(fā)明涉及一種植物繁殖，即篤斯越桔根瘤試管內(nèi)直接誘導(dǎo)、快繁方法。其特征在于步驟如下(1)以篤斯越桔根部分蘗的嫩芽為外植體，其適合的嫩芽根瘤誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為1/4MS+IAA0.80mg·L-1+IBA0.04mg·L-1+GA30.15mg·L-1。(2)采用已產(chǎn)生根瘤的再生植株的莖節(jié)為材料在試管利用節(jié)增殖的方法進(jìn)行快繁，將含有根瘤的試管苗于根上部留1～2葉切下，并將切下的小枝條再切割成一葉一段轉(zhuǎn)接到優(yōu)化后的根瘤誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行同時(shí)腋芽萌發(fā)、生長(zhǎng)及根瘤再生培養(yǎng)?？s短了繼代增殖周期，提高了增殖倍數(shù)，方法簡(jiǎn)捷，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，可操作性強(qiáng)，達(dá)到了快繁的目標(biāo)，可用于含根瘤的篤斯越桔苗的工廠化育苗。文檔編號(hào)A01H4/00GK101822219SQ20101016909公開(kāi)日2010年9月8日申請(qǐng)日期2010年5月12日優(yōu)先權(quán)日2010年5月12日發(fā)明者馮穎,姜云天,朱俊義,陳霞,顧地周,高捍東申請(qǐng)人:通化師范學(xué)院