專利名稱：一種海洋放線菌發(fā)酵提取物及其組合物和在抗生物污損的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海洋放線菌發(fā)酵提取物及其組合物和在抗生物污損方面的應用，具體來 說涉及了由海洋放線菌(5W^ispora pacj'打ca) SCSIO 00013發(fā)酵得到的提取物及含有該提 取物的組合物和該提取物在抗海洋生物污損方面的應用。
背景技術(shù)：
海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖中的水下設(shè)施，如網(wǎng)箱，船體，捕魚網(wǎng)，浮標，排水管等，常容易受到來 自于海洋細菌、海洋真菌、海洋藻類、海洋原生動物和軟體動物等海洋生物的污損，這些污 損生物還會在水下設(shè)施上最終形成污損生物群落，從而增加了水下設(shè)施的能耗和重量，降低 了效率和速度，還會堵塞管路，降低營養(yǎng)物質(zhì)和氧的輸送，甚至導致海洋養(yǎng)殖產(chǎn)品的死亡。 生物腐蝕和生物污損幾乎是同時存在的，而且還存在著相互促進的關(guān)系，即生物污損能夠加 速生物腐蝕的速度，生物腐蝕又能促使污損生物的進一步聚集，以海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖為例，生物 污損導致網(wǎng)箱、珍珠貝籠等的堵塞，養(yǎng)殖的水產(chǎn)品魚、蝦、貝等的缺氧或缺養(yǎng)料而死亡，另 外污損生物附著在船體上增加了船體的重量，加大了阻力，降低了船體的動力效率，增加了 油耗，使船體的腐蝕進一步加快，因而大大縮短了船體的使用壽命。因為海洋生物污損的巨 大破壞作用，每年導致的直接經(jīng)濟損失就達到幾十億美元。
現(xiàn)階段對海洋污損的處置措施主要是人工或機械的物理清除法和采用化學品的化學清除 法。但是物理清除法效率太低，化學清除法所用的化學品毒性又太大，勢必影響周邊的海洋 環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過海洋放線菌開發(fā)出無毒并能高效抗生物污損的物質(zhì)，另一目是提 供其組合物，進一步的目的是開發(fā)出這種物質(zhì)在抗海洋生物污損方面的應用。
我們通過將海洋放線菌(&7i/^印o/"a ; aci/ica) SCSIO 00013菌種用高氏一號培養(yǎng)基 培養(yǎng)，得到的菌絲體和發(fā)酵液用有機溶劑提取后，再經(jīng)硅膠柱梯度洗脫，得到的混合物無毒 且具有抗海洋生物污損的特性，與成膜材料混合后涂布于水下設(shè)施表面，能有效地防止海洋
生物對水下設(shè)施表面的污損，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的海洋放線菌發(fā)酵提取物，其特征是由海洋放線菌(5^J'm's/wrapaw'打ca) SCSIO 00013通過下述的步驟發(fā)酵得到的
(1)將海洋放線菌SCSIO 00013菌種接種到有高氏一號培養(yǎng)基的搖瓶中培養(yǎng)7-10天，再 轉(zhuǎn)接到種子瓶中，培養(yǎng)3-7天(后，轉(zhuǎn)接到有高氏一號培養(yǎng)基的搖瓶中，在溫度26 3(TC、速度30 50轉(zhuǎn)/分鐘下培養(yǎng)至發(fā)酵，然后將得到菌絲體和發(fā)酵液分離；
(2) 將步驟(1)的菌絲體和發(fā)酵液分別用溶劑提取，濃縮得到提取物1和提取物2，然 后將兩提取物合并，得到粗提取物。所述的菌絲體溶劑提取是用超聲波破壞細胞壁，再用甲 醇、乙醇、丙酮或正丁醇中的一種或一種以上的混合溶劑進行提取，所述的發(fā)酵液溶劑提取 是用乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷或正丁醇的一種或一種以上的混合溶劑進行提取。
(3) 將步驟(2)得到的粗提取物懸浮于水，用氯仿或乙酸乙酯萃取，濃縮得到氯仿萃取
物或乙酸乙酯萃取物；
(4) 將步驟(3)得到的氯仿萃取物或乙酸乙酯萃取物進行常壓硅膠柱層析，以氯仿-丙酮、 氯仿-乙酸乙酯、石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮溶劑系統(tǒng)為洗脫劑，按照體積比IO:O到O:IO 的梯度進行洗脫，餾分進行薄層層析分析，以體積比4:l的氯仿-丙酮為溶劑展開系統(tǒng)，收集 比移值A(chǔ) 0. 20 0. 75的餾分，合并并除去色素，得到產(chǎn)物。
步驟(l)所述的高氏一號培養(yǎng)基是通用的培養(yǎng)基，pH 7. 0 7. 2,每升水含可溶性淀粉10 30g， K2HP04 0. 5 lg，腦3 0. 5 1. 0g， MgS04 7H20 0. 5 1. 0g，海鹽l. 5% 3%，所述的分離 可以采用常規(guī)的方法例如離心分離等。
所述的海洋放線菌海洋放線菌(&"'/w'印ora/^c2'/yca) SCSIO 00013是公知的菌株(見 參考文獻Jensen P R' Mafnas C. Environmental microbiology, 2006， 8:1881-1888)，本 申請人:保證自申請日起的20年內(nèi)提供該菌種。該菌株于2006年9月分離自南海北部 (116° 19.945 E， 20° 36.012' N)，水深657米的灰色沙沉積環(huán)境，是嗜鹽菌，可以采用高 氏一號培養(yǎng)液或者其他加鹽培養(yǎng)液培養(yǎng)，屬放線菌類，其16Sr RNA基因序列與2005年發(fā)表的 海洋放線菌5". /^ci/ica+目比較，相似性達到99%以上，系統(tǒng)分析其與5: /^"YYca有最近親緣 關(guān)系。故該菌鑒定為51. / a"/Yca的一個菌株SCSI0 00013。
本發(fā)明海洋放線菌發(fā)酵提取物的制備方法同上述。
含有本發(fā)明海洋放線菌發(fā)酵提取物的組合物，其特征在于由本發(fā)明的海洋放線菌發(fā)酵提 取物和成膜材料組成。所述的成膜材料是合成樹脂，天然樹脂等。將本發(fā)明的由海洋放線菌 生產(chǎn)的混合物與成膜材料如合成樹脂，天然樹脂等混合，使之成膜，再涂布到水下設(shè)施的表 面上。
通過實驗發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的海洋放線菌發(fā)酵提取物具有很好的抗菌活性，抗藤壺幼蟲附著活 性濃度ICs。是25.61yg/mL，證明可用于抗海洋生物污損；該提取物對企鵝珍珠貝的LCJIOOO 1ig/mL，認為該提取物對企鵝珍珠貝幼苗無毒，可用于珍珠貝養(yǎng)殖中抗生物污損。
本發(fā)明通過簡單的提取方法從海洋放線菌中得到無毒的，能高效地抗海洋生物污損的提 取物，由這種混合物制得的涂料不含重金屬，對環(huán)境無害，可以應用于海洋珍珠貝的養(yǎng)殖和 船體等水下設(shè)施中的抗生物污損。
具體實施例方式
以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，但本發(fā)明不限于以下實施例。 實施例l:
將海洋放線菌(&h'm'卬ora ; aciYYca) SCSIO 00013菌種接種到2個經(jīng)過滅菌的500mL 搖瓶中，搖瓶中的培養(yǎng)基為高氏一號培養(yǎng)基(pH7.0 7.2,每升水含可溶性淀粉10 30g， K2HP04 0. 5 lg,跳0. 5 1.0g， MgS(WH20 0. 5 1.0g，海鹽1.5% 3%，)，在搖床上溫度 28°C，速度40轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)3天后，分別轉(zhuǎn)接到10個種子瓶中，經(jīng)過在高氏一號培養(yǎng)基中， 溫度28'C，速度40轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)7天后，把20個種子瓶的放線菌轉(zhuǎn)接到500mL的搖瓶中，搖瓶 盛150mL的高氏一號培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件是溫度28'C,速度40轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)10天，待放線菌大 量發(fā)酵后，用大型離心機離心分離菌絲體和發(fā)酵液。將發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯提取三次， 合并提取液，得到提取液l。用超聲波超聲處理菌絲體，再用等體積的乙酸乙酯提取三次，合 并提取液，得到提取液2。分別將提取液1和提取液2減壓濃縮，得到黑褐色物質(zhì)3.2g。
將上述黑褐色物質(zhì)懸浮于100mL重蒸水中，然后用等體積的乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙 酯萃取物。將乙酸乙酯萃取物過粒徑40 60ym， 64g的硅膠柱，以氯仿-甲醇為溶劑系統(tǒng)，從 IO:O到O:IO進行梯度洗脫，流速2滴/秒，餾分進行薄層層析分析，以體積比4:1氯仿-丙酮為 溶劑展開系統(tǒng)，收集比移值A(chǔ) 0.20 0.75的餾分，合并并用S印hadex LH-20凝膠柱除色素， 得到O. 55g本發(fā)明的提取物。
實施例2:實施例l提取物抗菌和抗污損生物幼蟲附著活性試驗
采用瓊膠擴散法測定抗菌活性。在涂布細菌的瓊膠板上放置浸有50u g目標提取物的無菌 紙片(5mmi.d.)，抑菌圈大小單位用咖表示。浸有同樣體積DMSO的紙片做空白對照，加有 利福平(3-[[(4-甲基-l-哌嗪基)亞氨基]甲基]-利福霉素)的紙片做陽性對照。然后在室溫 下培養(yǎng)24小時后，測量抑菌圈大小?？咕Y(jié)果見表l。
表l目標提取物和利福平的抗菌活性(抑菌圈L的大小單位，mm;每片含量，50ug/disc)
幼蟲附著誘導菌 實施例l提取物 利福平
Ruegeria sp. 2.7 5.0
Staphylococcus haemolyticus 4.5 6.5
Vibrio fluvialis 2.0 3.5
Pseudoalteromonas sp. 3. 3 5.5
Vibrio sp. (NAP—4) 1,5 5.0
Micrococcus luteus 1.5 4.0
Vibrio halioticoli 3.0 5.5
Vibrio alginolyticus 1.5 4.5
Rhodovulum sp. 3.0 3.5
5表1中抑菌圈L的大小由游標卡尺測量，不規(guī)則形狀大小的抑菌圈取平均值(L=R-r)。由 表1顯示可知，提取物的抗菌活性較強，特別對幼蟲附著誘導菌5Yap力j^ococc"s Ag柳(xZy"ct/5^ /^et/ofciay tero7B(m351 s/ . ， K/Ario / ah-"ico/滯朋ocfoKi/7tffl7鄰.具有較強的 抑制作用。
實施例3:實施例l提取物抗污損生物幼蟲附著活性試驗
采用24孔板分別測定實施例1提取物的抗藤壺幼蟲附著活性。每個板孔中加入lmL含有 10 15個成熟的藤壺幼蟲的培養(yǎng)液，實施例1提取物溶于DMS0中，然后用滅菌海水稀釋成不同 的濃度。每個濃度3個平行，無菌海水做空白對照。將培養(yǎng)板置于室溫下培養(yǎng)24小時，在解剖 鏡下統(tǒng)計附著的幼蟲數(shù)，用SPSS程序進行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計結(jié)果見表2:
表2實施例l提取物在不同濃度下藤壺幼蟲的附著率(％)
實施例l提取物DMS0
100u g/mL10pg/mL L0ug/mL0. 1 u g/mL
10. 2%28. 5% 55. 8%60. 0%61. 1%
從表2可以看到跟DMS0對照比對，實施例1提取物4個濃度的幼蟲的附著率只有0. 1 y g/mL 為60%，沒有明顯差異，其它3個濃度都有明顯差異。
根據(jù)幼蟲附著抑制率=(空白對照一附著率)/空白對照xiooy。計算化合物的抗幼蟲附著活性。
通過分析得到以下結(jié)論(1)實施例l提取物的抗幼蟲附著活性濃度IC5。是25.61ug/Ml; (2)目標提取物具有抗藤壺幼蟲附著的活性。 實施例4:實施例l對珍珠貝幼苗的致死試驗
采用小玻璃試管分別測定實施例1提取物對培養(yǎng)7天的珍珠貝幼苗的致死試驗。每個小燒 杯中加入2mL含有10 15個成熟的企鵝珍珠貝幼苗培養(yǎng)液，實施例1提取物溶于DMS0中，然后 用滅菌海水稀釋成不同的濃度。每個濃度3個平行，無菌海水做空白對照。將培養(yǎng)板置于室溫 下培養(yǎng)24小時，在放大鏡下統(tǒng)計死亡幼苗數(shù)，用LD5。程序進行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計結(jié)果見表3:
表3不同濃度下的實施例1目標提取物對培養(yǎng)7天的企鵝珍珠貝的致死率(％)
實施例l提取物DMS0
100ug/mL10ug/mL 1.0ug/mL0. 1P g/mL(10uL)
8. 67%4. 75% 2. 36%4. 25%4. 65%
根據(jù)校正死亡率=(對照組存活率一處理組存活率)/對照組存活率xioox計算實施例
61提取物對企鵝珍珠貝的致死率和致死濃度。
通過分析得到以下結(jié)論目標提取物對企鵝珍珠貝的LC5?！?000yg/mL，認為化合物對企
鵝珍珠貝幼苗無毒。
實施例5:用于珍珠貝養(yǎng)殖中抗生物污損的含本發(fā)明提取物的組合物的制備 采用現(xiàn)有制備涂料的技術(shù)，在涂料中加入本發(fā)明涉及的抗生物污損活性提取物。例如，
將本發(fā)明的活性提取物摻入合成樹脂，天然樹脂或者其它成膜材料中，制備，使之成膜，再
涂布到珍珠貝養(yǎng)殖過程中使用的箱籠或者其它水下設(shè)施上。
權(quán)利要求
1. 一種海洋放線菌發(fā)酵提取物，其特征是由海洋放線菌(Salinispora pacifica)SCSIO00013通過下述的步驟發(fā)酵得到的(1)將海洋放線菌SCSIO 00013菌種接種到有高氏一號培養(yǎng)基的搖瓶中培養(yǎng)7～10天，再轉(zhuǎn)接到種子瓶中，培養(yǎng)3～7天后，轉(zhuǎn)接到有高氏一號培養(yǎng)基的搖瓶中，在溫度26～30℃、速度30～50轉(zhuǎn)/分鐘下培養(yǎng)發(fā)酵，然后將得到菌絲體和發(fā)酵液分離；(2)將步驟(1)的菌絲體和發(fā)酵液分別用溶劑提取，濃縮得到提取物1和提取物2濃縮得到，然后將兩提取物合并，得到粗提取物，所述的菌絲體溶劑提取是用超聲波破壞細胞壁，再用甲醇、乙醇、丙酮或正丁醇中的一種或一種以上的混合溶劑進行提取，所述的發(fā)酵液溶劑提取是用乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷或正丁醇的一種或一種以上的混合溶劑進行提取；(3)將步驟(2)得到的粗提取物懸浮于水，用氯仿或乙酸乙酯萃取，濃縮得到氯仿萃取物或乙酸乙酯萃取物；(4)將步驟(3)得到的氯仿萃取物或乙酸乙酯萃取物進行常壓硅膠柱層析，以氯仿-丙酮、氯仿-乙酸乙酯、石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮溶劑系統(tǒng)為洗脫劑，按照體積比10∶0到0∶10的梯度進行洗脫，餾分進行薄層層析分析，以體積比4∶1的氯仿-丙酮為溶劑展開系統(tǒng)，收集比移值Rf0.20～0.75的餾分，合并并除去色素，得到產(chǎn)物。
2. —種含有權(quán)利要求l所述提取物的組合物，其特征在于由權(quán)利要求l所述的海洋放線菌 發(fā)酵提取物和成膜材料組成。
3. 權(quán)利要求l所述的海洋放線菌發(fā)酵提取物在抗海洋生物污損的應用。
4. 權(quán)利要求3所述的海洋放線菌發(fā)酵提取物的應用，是在珍珠貝養(yǎng)殖中抗海洋生物污損 的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種海洋放線菌(Salinispora pacifica)SCSIO 00013發(fā)酵提取物在抗生物污損方面的應用。其特征是通過將海洋放線菌SCSIO 00013菌種接種到高氏一號培養(yǎng)基中發(fā)酵，將得到菌絲體和發(fā)酵液分離后分別用有機溶劑提取，濃縮并合并提取物得到粗提取物，將粗提取物懸浮于水，用氯仿或乙酸乙酯萃取，將萃取物經(jīng)常壓硅膠柱層析，以氯仿-丙酮等溶劑系統(tǒng)為洗脫劑，進行梯度洗脫，餾分進行薄層層析分析，以體積比4∶1的氯仿-丙酮為溶劑展開系統(tǒng)，收集比移值R_f 0.20～0.75的餾分，合并并除去色素，得到目標提取物。本發(fā)明的發(fā)酵提取物可用于抗海洋生物污損，由該發(fā)酵提取物與成膜材料組成的涂料不含重金屬，對環(huán)境無害，可用于海洋珍珠貝的養(yǎng)殖中。
文檔編號A01N63/02GK101444228SQ20081022042
公開日2009年6月3日 申請日期2008年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月25日
發(fā)明者浩 尹, 偲 張, 漆淑華, 田新朋, 羅雄明 申請人:中國科學院南海海洋研究所