專利名稱：用于測定液體中鈉離子的方法和組合物的制作方法
本申請是CN88102781.2的分案申請。原申請的申請日為1988年4月9日，發(fā)明名稱為“測定液體中離子的方法”。
本發(fā)明涉及生物或非生物液體中的離子(下面稱為分析物)測定的方法和試劑。
本發(fā)明的理論根據(jù)是許多分析物有激活或抑制敏感酶的作用。分析物可以是陽離子、陰離子、金屬或非金屬、單質(zhì)或化合物。在實(shí)踐中，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)樣本中的分析物濃度超過相關(guān)分析指示酶的敏感性范圍，或存在有其它離子對酶的敏感性產(chǎn)生干擾。本發(fā)明從多種途徑提出并解決這些問題的方案。
在生物化學(xué)的臨床實(shí)踐中，血清電解質(zhì)測量是醫(yī)院里使用最普遍的分析方法。這些測量不論對于常規(guī)試驗(yàn)還是對于急診，甚至對于生命處于危急中的狀態(tài)(此時(shí)分析速度是極為重要的)都是必需的。由于醫(yī)院里產(chǎn)生拖延的主要原因是要把樣本從病房送到診斷實(shí)驗(yàn)室，因此，在緊急情況下，一種易于在床邊進(jìn)行的方法變得特別重要。
在生物化學(xué)的臨床實(shí)踐中，鉀和鈉的普通分析方法是火焰光度法。該方法的原理是，某些原子通過加熱刺激被激發(fā)，當(dāng)原子回到基態(tài)時(shí)則發(fā)出具有特征波長的光?；鹧嬷杏稍赢a(chǎn)生的特征波長輻射能的強(qiáng)度直接與火焰中激發(fā)原子的數(shù)量成正比，而原子數(shù)量直接與樣本中所關(guān)心物質(zhì)的濃度成正比。這種方法需要的裝置復(fù)雜而且昂貴，并且要使用可燃?xì)怏w。
另一種特別適于鈉、鉀和氯的方法是使用離子選擇電極。理想的情況是，每個(gè)電極都具有單離子選擇特性，使電極只對一種離子有反應(yīng)。實(shí)際情況卻不是這樣，所有的離子選擇電極都存在有干擾離子。況且，盡管能對離子特異性電極進(jìn)行校正，但通常特異性仍不是絕對的。電極可測量由于特異離子的存在而產(chǎn)生的電位，但儀器比較昂貴。這兩種方法都不能進(jìn)行分光光度分析，因此臨床上對于離子測定的需要，大大提高了市售可得的臨床分析儀器的復(fù)雜性，其中大部分都是為分光光度法而設(shè)計(jì)的。兩種方法都需要相當(dāng)程度的技藝和知識才能成功地實(shí)施。
同樣，用庫侖法對氯離子進(jìn)行常規(guī)測定需要特殊的儀器。此滴定過程的終點(diǎn)通過難溶氯化銀產(chǎn)物的形成而增加的電流量確定。換句話說，可能利用的電位測定也是很費(fèi)時(shí)間的，還需要另外的儀器設(shè)備。
另外，對于氯離子而言，有許多電位法和滴定法，例如其中包括通過二苯卡巴腙絡(luò)合物滴定游離Hg2 +鐵離子的硫氰酸鹽絡(luò)合物的比色測定，它是在由于HgCl2的沉淀而發(fā)生的汞絡(luò)合物的解離之后形成的(Skeggs，Clin.Chem. 10，1964，918f.;Schmidt，Zentralblatt Pharm.124(9)，1985，527f)用相應(yīng)的汞鹽(Renschler)比色測定氯冉酸由無色汞鹽比色測定二乙基二硫代氨基甲酸的Cu2+絡(luò)合物(DE2137146)頗為普遍的TPTZ法(tripyridile-s-triazine)(R.Fried，Zeitschr.Klin.Chem.，Klin.Bioch.10，1972，280f;DOS 215 3387)，它的基礎(chǔ)也是隨著汞絡(luò)合物的解離而形成有色的金屬絡(luò)合物。
這些方法的主要缺點(diǎn)是使用了劇毒物質(zhì)的溶液。有些方法復(fù)雜而不精確(如滴定法)。許多試劑不穩(wěn)定，標(biāo)定曲線不成直線(如硫氰酸鹽法)。另外，為了避免試樣中蛋白質(zhì)含量的干擾，某些方法需進(jìn)行預(yù)處理。
WO83/002670公開了一種改進(jìn)的TPTZ法，但其不利之處是仍然使用了毒性汞化合物。唯一沒有使用汞離子的比色法是在高氯酸溶液中測定Fe(Ⅲ)的六氯絡(luò)合物(F.Hoppe.，Ther.Ggw.110(4)，1971，554f.;H.Mahner，zeitschr.Klin.Chem.，Klin.Biochem.11(11)，1973，451f.;W.T.Law，Clin.Chem.26(13)1980，1874f.;US4278440)。此方法最大的局限性是使用了侵蝕性的強(qiáng)酸試劑，因而不適于機(jī)械的吸管系統(tǒng)。另一不足之處是受到試樣中膽紅素的干擾。
鈣是臨床實(shí)驗(yàn)室中電解質(zhì)測定的另一個(gè)例子。人體液中此金屬離子的濃度被調(diào)控在很窄的范圍內(nèi)。病理上的高或低濃度都可能導(dǎo)致危及生命的紊亂，如腎功能不全、胰腺炎、痙攣和充血性心力衰竭。
Tisdall介紹的方法是一種測定鈣的最早的方法(J.Biol.Chem.，63461-465，1925)。其中，鈣由草酸沉淀，然后進(jìn)行比色測定。該方法包括離心步驟，因此也是很費(fèi)時(shí)間的;它并不具有鈣特異性，而是取決于對試樣的細(xì)心操作。通過滴定后直接進(jìn)行比色的方法在許多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)獲得成功。前一過程的不足仍然是試驗(yàn)復(fù)雜繁瑣，并且需要大量試樣。在后一過程中，鈣影響染料如鄰甲酚酞配位酮的顏色，它可通過光度儀測量。由于此方法很簡單，它在臨床實(shí)驗(yàn)室里有自動(dòng)化趨勢。但是，這種方法仍然使用了侵蝕性的高堿性溶液和毒性物質(zhì)。還特別易于受到許多血清成份的干擾，例如脂類、蛋白質(zhì)、磷酸鹽和膽紅素等，其結(jié)果與原子吸附法和火焰光度法不很一致。比色分析的另一個(gè)缺點(diǎn)是標(biāo)定曲線不成直線，顏色在很大程度上取決于溫度。
W.H.Outlaw和O.H.Lowry介紹了測定組織中鉀離子的酶介法(Analytical Biochemistry 92370-374，1979)。該方法采用兔肌肉中由鉀鈉離子活化的丙酮酸激酶，前者的激活效力大約高出40倍。由于這種非特異性，此方法可能適用于植物材料，其中鉀離子是主要的陽離子，但它不適于測量人體液如血清，因?yàn)槠渲锈c離子的含量超過30倍。因此使用Lowry等人介紹的酶光度技術(shù)測量血漿或血清中的鉀時(shí)，鈉離子的存在將引起不可接受的干擾。另一問題是銨離子也具有與鉀離子相似的活化作用。以上出版物既沒有提出并解決與分析生物液體如血清中鉀離子有關(guān)的關(guān)鍵問題，也沒有提出任何測定鈉離子的方法。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種方法和試劑以避免上述問題。本發(fā)明通過液體中離子(分析物)的測定方法解決了這些問題，即測定液體中這些離子對酶活性的影響。
本發(fā)明的一個(gè)關(guān)鍵特征是使用了選擇性結(jié)合試劑，以將分析酶的分析物的游離濃度調(diào)整在最佳范圍內(nèi)，尤其是在液體不能稀釋時(shí)。本發(fā)明的另一方面是，使用了分析酶的競爭性抑制劑以降低它對分析物的敏感性，從而能在更高濃度下測定分析物。例如，在不易得到選擇性結(jié)合試劑或費(fèi)用過于昂貴時(shí)，用這種方法是極其合適的。
本發(fā)明的另一特征是使用選擇性結(jié)合試劑以降低干擾離子的游離濃度，使得干擾水平可以忽略。還利用了這一事實(shí)即競爭性抑制劑與干擾離子的競爭性比與分析物的競爭性更強(qiáng)，從而相對于干擾離子來說，增加了酶對分析物的敏感性。
選擇最佳反應(yīng)條件是一個(gè)重要方面，包括選擇適當(dāng)?shù)耐っ?，要使得分析物的促進(jìn)或抑制效應(yīng)比干擾離子的強(qiáng)得多。另外，分析物和干擾離子對分析酶活性的作用應(yīng)該可以迭加，以便在已知干擾離子濃度時(shí)，能夠通過差別方便地確定分析物濃度。已知分析液體中某干擾離子以相當(dāng)恒定的濃度存在時(shí)，通過使標(biāo)準(zhǔn)(校正)溶液中含有適當(dāng)濃度的干擾離子便可進(jìn)行測定。測定這種分析物的另一種方法是使用競爭性結(jié)合法，其中，分析物從結(jié)合試劑中置換出其他離子，然后測定釋放離子對適當(dāng)?shù)拿富钚缘男?yīng)。
通過在測定血漿或血清中的鉀、鈉、鈣、氯和碳酸氫根離子中的應(yīng)用，可以最好地詳細(xì)闡述這些基本原理。但它們可應(yīng)用于范圍很寬的離子譜，例如陽離子如鎂、錳、鋰、鉛、鋅、銅、鐵或其他重金屬?？梢詼y定的非金屬離子為質(zhì)子或銨。還可測定產(chǎn)生銨的物質(zhì)如尿素。
可以使用的酶如(H.J.Evans et al.，Ann.Rev.Plant Physiol.17∶47，1966)轉(zhuǎn)移酶如磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶。這類轉(zhuǎn)移酶可以是丙酮酸激酶。還可用其他激酶如腺苷酸激酶或已糖激酶等代替丙酮酸激酶，它們對鎂離子或錳離子敏感。另一種轉(zhuǎn)移酶是乙酸激酶(來自大腸桿菌)。另外一個(gè)例子是對鋅離子敏感的來自大腦的吡哆醛激酶。
水解酶如糖苷酶類，例如α-或β-D-半乳糖苷酶(來自大腸桿菌)、羧基肽酶A(來自牛胰臟)、膠原酶(來自Clostridium hystolicum)、淀粉酶(來自唾液或胰臟)或磷酸甘油磷酸酶。
肽水解酶如依賴半胱氨酸或硫醇的蛋白酶，具體例子有Sasaki等人介紹的(J.Biol.Chem.25912489-12494，1984)Calpain Ⅰ和Ⅱ(也稱為鈣活化的中性蛋白酶)。后者可以根據(jù)A.Kitahara等人介紹的方法(J.Biochem.951759-1766，1984)，從各類動(dòng)物組織如大鼠的肝和腎、人和豬的紅細(xì)胞、牛腦、兔骨骼肌中分離和純化。另一個(gè)例子是二肽氨基肽酶Ⅰ(E.C.3.4.14.1，Cathepsin C)(J.Ken Mc Donald，Biochem.Biophys.Res.Commun.24(5)∶66，771f)。酶的另一來源是由基因重組技術(shù)得到的蛋白質(zhì)。
氧化還原酶如甘油脫氫酶(來自產(chǎn)氣腸桿菌)、乙醛脫氫酶(來自酵母)或酪氨酸酶(兒茶酚氧化酶)。
裂解酶如醛縮酶(來自酵母)或碳酸脫水酶(來自牛紅細(xì)胞)。
其它適宜的酶是來自嗜鹽性生物中的各種酶。另一些酶源是由基因重組技術(shù)得到的蛋白質(zhì)。
選擇性結(jié)合試劑可得到大量適于結(jié)合分析物或干擾離子的結(jié)合試劑。這種結(jié)合試劑或掩蔽物質(zhì)為穴狀配體、冠醚配體、冠醚、足狀配體、球狀配體、半球狀配體、萼狀配體及它們的組合、天然離子載體如抗生素、環(huán)肽如纈氨霉素、配位酮和螯合劑如亞氨基二乙酸、EDTA、硝基三乙酸及其衍生物。這類化合物見于下列文獻(xiàn)的記載Kontakte(Merck)，1977，No.l，p.ll ff and p.29 ff; Kontakte(Merck)，1977，No.2，p.16 ff; Kontakte(Merck).1977，No.3，p.36 ff; Phase Transfer Catalysts，Properties and Applications(Merck-Schuchardt)1987，Thermodynamic and Kinetic Data for Cation-Macrocycle Interaction; R.M. Izatt et al.，Chemical Reviews 85，271-339(1985);Data for Biochemical Research，1986，R.M.C. Dawson et al.，Eds.，3rd edit.，399-415(Clarendon Press)Oxford; F.V gtle et al.，Chem.Macrocycles，Springer Verlag，NewYork，1985; G.W. Gokel et al.，Eds.，Macrocyclic Polyether Synthesis，Springer Verlag，New York，1982;M. Hiraoka，Ed.，Crown Compounds，Elsevier，Amsterdam，Oxford，New York，1982; J.M. Lehn et al.，J.Am.Chem.Soc.97，67006707(1975);G. Schwarzenbach et al.，Helv.Chim.Acta 28，828(1945);S.F.A. Kettle，Koordinationsverbindungen，Taschentext 3，Verlag Chemie，Weinheim/Bergstr.1972;A.E.Martell et al.，Die Chemie der Metallchelatverbindungen，Verlag Chemie，Weinheim/Bergstr. 1958;M. Becke-Goehring et al.，Komplexchemie，Springer Verlag，1970;F. Kober，Grundlagen der Komplexchemie，Otto Salle Verlag，F(xiàn)rankfurt/Main 1979;G. Schwarzenbach et al.，Helv. Chim. Acta 31，1029(1948);R.G. Pearson et al.，Science 151，172(1966).
可以結(jié)合多價(jià)離子，特別是二價(jià)陽離子的螯合劑有例如乙二醇-二-(2-氨基乙醚)-N，N，N′，N′-四乙酸(簡寫為EGTA)和(乙二胺)四乙酸(EDTA)。
雖然有許多結(jié)合試劑可以結(jié)合多價(jià)離子，如EDTA及其衍生物，但結(jié)合單價(jià)離子的試劑比較少見。四苯硼結(jié)合鉀離子。但是，一種具有更大可能性的化合物是穴狀配體，它們是能夠在水溶液中選擇性結(jié)合單價(jià)陽離子的試劑的例子(R.M.Izatt et al.，Chem. Reviews 85∶271-339)。穴狀配體的突出例子是Kryptofix ，Merck-Schuchardt公司的化合物，例如4，7，13，16，21-五噁-1，10-二氮二環(huán)[8.8.5]-二十三烷，Kryptofix 221，p.438，Merck-Schuchardt catalogue，dated 1987/88，no.810646(K221)。
4，7，13，16，21，24-六惡-1，10-二氮二環(huán)[8.8.8]二十六烷，Kryptofix 222，p.438，Merck-Schuchardt catalogue，dated 1987/88，no.810647(K222)。
可用下面所列的物質(zhì)作為排除干擾離子的掩蔽化合物陰離子穴狀配體、雜環(huán)烷(heterocyclophanes)、catapinands和無機(jī)金屬絡(luò)合物或難溶鹽類。文獻(xiàn)中公開了陰離子絡(luò)合化合物的特殊例子，如氮雜單環(huán)或氮雜聚環(huán)、大環(huán)四級四面體化合物、大環(huán)雙金屬絡(luò)合物、共價(jià)結(jié)合有路易斯酸中心的大環(huán)、質(zhì)子化或烷基化的四級穴狀配體或catapinands(F.P.Schmidtchen，Nachrichten Chem.Techn.lab.36(1)，1988，S.8f;E.Graf，J.Amer.Chem.Soc.98(20)，1976，6403f;C.H.Park，J.Amer.Chem.Soc.90(9)，1968，2431f)以及Fe(Ⅲ)的六氯絡(luò)合物或硝酸銀。
結(jié)合試劑的功能這些結(jié)合試劑用于下述目的1.干擾離子的選擇性結(jié)合。
2.如果樣本不能稀釋，則將分析物的濃度降到最佳的測定水平。
3.本發(fā)明的具體方案是一種方法，其中，存在有結(jié)合試劑并與“指示”離子絡(luò)合，分析離子以化學(xué)計(jì)量方式取代絡(luò)合物中的指示離子，測定被取代的指示離子對酶活性的影響，從而間接測得分析離子的濃度。例如，在此方法中，酶是丙酮酸激酶、指示離子是鉀、結(jié)合試劑是Kryptofix 221、待測離子是鈉;或者酶是激酶、指示離子是Mg2+、結(jié)合試劑是螯合劑如EDTA、離子是金屬;或者酶是吡哆醛激酶、指示離子是Zn2+、結(jié)合試劑是Kryptofix 221、離子是重金屬;或酶是α-淀粉酶、結(jié)合試劑是Ag或Hg、待測離子是氯;或酶是膠原酶、結(jié)合試劑是螯合劑如EDTA、待測離子是鈣。
分析液體進(jìn)行分析物測定的生物液體有例如血液、血清、血漿、汗、滲出液或滲出物或尿。其他的液體例子有自來水或食品提取物，或水果或發(fā)酵液體如葡萄酒。
應(yīng)用一般原理測定鉀離子和鈉離子基于丙酮酸激酶對鉀離子的敏感性而測定血清或血漿中鉀離子時(shí)，對于成功的測定的基本要求是克服鈉離子和銨離子的干擾。根據(jù)本發(fā)明的一般原理，這些要求可由下面一個(gè)或多個(gè)步驟實(shí)現(xiàn)1.用適宜的結(jié)合試劑(如Kryptofix 221)選擇性結(jié)合鈉離子。
2.選擇脂嗜熱桿菌(Bacillus stearothermophilus)，而不是選擇兔肌肉作為丙酮酸激酶的來源，因?yàn)橄鄬τ阝c離子而言，細(xì)菌酶對鉀離子的敏感性是肌肉酶的兩倍。
3.在測定中加入敏感性指示酶的競爭性抑制離子，如用鋰離子與鈉離子和鉀離子競爭。
4.酶促除去銨離子。
由于鋰離子作為競爭劑對鉀離子的影響較小，因此與鈉離子相比較，其凈效應(yīng)是丙酮酸激酶對鉀離子的相對敏感性進(jìn)一步增加了50%。而且，有鋰離子存在時(shí)，鉀離子和鈉離子對丙酮酸激酶的影響變?yōu)榭傻拥?，而不是協(xié)同作用的。這樣，如果已知其他離子的濃度，便能夠任意測定鉀離子或鈉離子的濃度。
在沒有結(jié)合試劑時(shí)，采用步驟2和3便可得到丙酮酸激酶對鉀離子比對鈉離子的相對敏感性為100∶1。這意味著，即使鈉離子的濃度極為不正常，如110或170mmol/L，測定鉀離子的誤差相對于正常血漿中鈉離子濃度為140mmol/L來說(實(shí)例A)將不會(huì)超過0.3mmol/L。對于許多臨床試驗(yàn)來說這不能算是很精確的。但是，如果已知血漿中鈉離子的真實(shí)濃度，那么鉀離子的精確測定能夠降至±0.05mmol/L(實(shí)例B)。如果把步驟1-3結(jié)合起來，并包括進(jìn)結(jié)合試劑Kryptofix 221，那么相對于鈉離子而言，丙酮酸激酶對鉀離子的相對敏感性增加到500∶1。在這些情況下。不需知道鈉離子濃度，便可測定血漿中鉀離子的濃度至0.05mmol/L(實(shí)例C)。
測定鉀離子的這些方法證實(shí)了本發(fā)明減少干擾的一般原理的實(shí)用性。另一方面，血清或血漿中鈉離子的測定，可更好地闡述這些原理在調(diào)節(jié)有效分析物濃度方面的應(yīng)用。本發(fā)明中測定鈉離子的方法是利用其活性對鈉離子敏感的酶。這類酶的一個(gè)實(shí)例是β-半乳糖苷酶(Kuby et al.，J.Amer.Chem.Soc.75∶890，1953)。然而，酶最敏感的鈉離子濃度的范圍比沒有稀釋時(shí)一般血漿樣本中的值低得多。
根據(jù)本發(fā)明的原理，采用下面步驟可將試樣不能稀釋時(shí)的有效鈉離子濃度降至最佳水平。
1.使用鈉離子結(jié)合試劑如Kryptofix 221。
2.使用鋰離子作為β-半乳糖苷酶的競爭性抑制劑，從而降低酶對鈉離子的敏感性。
結(jié)合步驟1和2，能方便地用β-半乳糖苷酶測定血漿或血清中的鈉離子濃度，并可控制結(jié)合試劑的用量以將鈉離子濃度的信號降至最低，即在110mmol/L以下，而加強(qiáng)通常的分析范圍(110-170mmol/L)的信號(實(shí)例D)。
由丙酮酸激酶也可測定鈉離子濃度，前提是選擇這樣的條件降低鉀離子對酶活性的促進(jìn)，并在反應(yīng)混合物中加入鉀離子結(jié)合試劑如Kryptofix 222(實(shí)例E)。
測定血漿鈉離子濃度的另一種方法是用鈉離子取代Kryptofix 221中的鉀離子;釋放的鉀離子促進(jìn)的丙酮酸激酶的活性與血漿鈉離子的濃度成正比(實(shí)例F)。
本發(fā)明另外的具體方案是測定生物液體和非生物液體的組合物和試劑。
本發(fā)明的試劑可以溶解或干燥形式存在。還可使試劑浸漬到適宜的載體中。一種試驗(yàn)條形式的診斷劑可在揮發(fā)性溶劑如丙酮中，用常規(guī)制備試驗(yàn)條必需的試劑的溶液浸漬載體材料，如濾紙、纖維素或合成纖維毛而制得。此浸漬過程可進(jìn)行一次或多次。完成的試紙可以這種形式使用，或以已知方式貼在手柄上，或最好密封在合成樹脂和細(xì)網(wǎng)之間。
本發(fā)明的實(shí)施方案在下文中作出詳細(xì)的描述，但不能以任何一種詳細(xì)描述或其結(jié)合來限制本發(fā)明，尤其是除了本實(shí)施方案中描述的以外，還可使用各種機(jī)械或化學(xué)的改變。
鉀離子分析方法的詳細(xì)說明這一部分用本發(fā)明所述原理更詳細(xì)地介紹測定鉀離子的方法。為了測定液體如血漿中的鉀離子，將體液與含有腺苷二磷酸(ADP)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、丙酮酸激酶(PK)和乳酸脫氫酶(LDH)的緩沖混合物保溫?；旌衔镏型ㄟ^PK和LDH催化的反應(yīng)形成的丙酮酸鹽和隨之形成的乳酸，完全取決于所存在的適宜的陽離子，沒有它們的存在PK則幾乎沒有活性。NADH在340nm處有強(qiáng)烈吸收，而NAD沒有。
在選擇的分析條件下(包括細(xì)菌PK所需的錳離子的存在)，NADH的氧化速率與鉀離子的濃度成正比(參見實(shí)例A～C)。
在這些條件下，發(fā)生下列反應(yīng)
體系中鉀離子的濃度決定反應(yīng)式(1)的速率，而它又限制反應(yīng)(2)的速率。有幾種可以測定反應(yīng)速率的方法。一種標(biāo)準(zhǔn)方法是用分光光度計(jì)測量反應(yīng)(2)中NADH的消失速率。NADH在340nm處有強(qiáng)烈吸收，而NAD沒有。因此，通過反應(yīng)混合物在340nm(或另一個(gè)波長)處的吸收降低能夠直接測定反應(yīng)速率，由此可計(jì)算出混合物中的鉀離子濃度。另外，可以利用這一事實(shí)，即反應(yīng)(1)和(2)都消耗H+，因而降低反應(yīng)混合物中質(zhì)子的濃度。用PH計(jì)可以測量質(zhì)子濃度下降的速率，或者用滴定法測定。在用PH計(jì)或滴定法時(shí)，所用緩沖液的濃度比分光光度技術(shù)中要小得多?？捎闷渌麅x器如熒光儀或光度計(jì)監(jiān)測丙酮酸激酶的活性。
還有許多其他方法可以測定與PK活性相關(guān)的聚積的丙酮酸鹽。它們包括測定無機(jī)磷酸鹽或氧耗或過氧化氫;由丙酮酸氧化酶催化產(chǎn)生的乙?；姿猁}或二氧化碳;腙的形成(與2，4-二硝基苯肼);測量丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)物或產(chǎn)物;丙酮酸脫羧酶或丙酮酸脫氫酶;黃素偶聯(lián)系統(tǒng)的使用;及測量微量物質(zhì)濃度的同位素法(M.N.Berry et al;Analytical Biochem.118∶344-352，1981)。
在200份血清樣本的測量中，與用其他方法如火焰光度法或離子選擇電極得到了一致的結(jié)果。本方法的重要干擾離子是銨離子，它通常存在于血清中或在放置過程中聚積。在反應(yīng)混合物中加入α-酮戊二酸(KG)和谷氨酸脫氫酶可以完全避免銨離子的干擾。根據(jù)下述反應(yīng)通過預(yù)保溫可以除去銨離子
在銨離子含量高的溶液如尿中，可以使用偶聯(lián)反應(yīng)
偶聯(lián)法使用了葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。假如加入的葡萄糖-6-P和KG對于存在的任何銨離子是過量的，則當(dāng)試劑中保存有NADH時(shí)，可以除去所有的銨離子。
采用10μl血漿或血清樣本，在37℃時(shí)酶法測定鉀離子的主要試劑的典型濃度范圍如下PK(脂嗜熱桿菌)50-10000U/LPEP(中性Tris鹽)0.3-30mmol/LKryptofix 221 0-30mmol/LNADH0.01-0.8mmol/L緩沖液PH7-850-500mmol/L
Mn2+或Mg2+1-10mmol/LLiCl2-100mmol/LADP(游離酸)0.5-10mmol/LLDH(于25℃測定)5000-100000U/L血清清蛋白0-5g/LGDH(于25℃測定)2500-20000U/LKG(游離酸)1-10mmol/L另一個(gè)對鉀離子敏感的例子是甘油脫氫酶(E.C.C.Lin et al.，B235，1820，1960)。采用甘油脫氫酶在37℃時(shí)酶法測定鉀離子的主要試劑的典型濃度范圍如下甘油脫氫酶50-1000U/L甘油0.3-3mol/LKryptofix 221 0-30mmol/LNAD0.1-5.0mmol/L緩沖液pH920-500mmol/L血清清蛋白0-5g/LGDH(于25℃測定)2500-20000U/LKG(游離酸)1-10mmol/L對鉀離子敏感的另一種酶是乙醛脫氫酶(S.Black，Arch.Biochem.Biophys.34∶86，1951)。采用乙醛脫氫酶在37℃時(shí)酶法測定鉀離子的主要試劑的典型濃度范圍如下乙醛脫氫酶50-10，000U/L乙醇醛0.3-30mmol/LKryptofix 221 0-30mmol/L
NAD0.05-2.0mmol/L緩沖劑PH7-850-500mmol/L二硫蘇糖醇0.1-2mmol/L血清清蛋白0-5g/LGDH(于25℃測定)2500-20000U/LKG(游離酸)1-10mmol/L可用乙醛(0.02-1mmol/L)代替乙醇醛。
乙醛脫氫酶還抑制酯酶的活性，因此，監(jiān)測從4-硝基苯乙酸中釋放的4-硝基苯酚能夠測定鉀離子的濃度?；谝胰┟摎涿傅孽ッ富钚裕?7℃時(shí)酶法測定鉀離子的主要試劑的典型濃度范圍如下乙醛脫氫酶50-10000U/L4-硝基苯乙酸鹽0.1-2mmol/LKryptofix 221 0-30mmol/LNADH0.001-0.1mmol/L緩沖液PH7～850-500mmol/L二硫蘇糖醇0.1-2.0mmol/L血清清蛋白0-5g/LGDH(于25℃測定)2500-20000U/LKG(游離酸)1-10mmol/L鈉離子的測定使用PK測定鈉離子的原理與測定鉀離子類似，但仍存在著關(guān)鍵性的差異。首先，PK對鉀離子的敏感性是對鈉離子的大約40～100倍之多，取決于上面所述的保溫條件。因此，即使血漿鈉離子濃度是鉀離子的30倍，鉀離子也能干擾鈉離子的測定。
根據(jù)本發(fā)明的一般原理，省去鋰離子，優(yōu)選來自兔肌肉的PK而不是細(xì)菌酶，并用鎂離子代替錳離子。在一種方法中，使鉀離子與Kryptofix 222特異性結(jié)合，并直接測定鈉離子對PK活性的影響(實(shí)例E)。
采用丙酮酸激酶，在37℃時(shí)酶法測定鈉離子的主要試劑的典型濃度范圍如下PK(兔肌肉)50-10000U/LPEP(中性Tris鹽)0.3-30mmol/LKryptofix 222 0.4-4mmol/LNADH0.01-0.8mmol/L緩沖液PH7-950-500mmol/LMg2+1-10mmol/LADP(游離酸)0.5-10mmol/LLDH(于25℃測定)5000-100000U/L血清清蛋白0-5g/LGDH(于25℃測定)2500-20000U/LKG(游離酸)1-10mmol/L在另一方法中，用鈉離子置換Kryptofix 221中的鉀離子時(shí)，釋放的鉀離子促進(jìn)PK活性的程度取決于鈉離子的濃度(實(shí)例F)。
通過丙酮酸激酶測定從Kryptofix 221中置換出的鉀離子時(shí)，從而在37℃下酶法測定鈉離子的主要試劑的典型濃度范圍如下PK(兔肌肉)50-10，000U/LPEP(中性Tris鹽)0.3-30mmol/LKryptofix 221 1-10mmol/L
NADH0.01-0.8mmol/L緩沖液PH9-1050-500mmol/LMg2+1-10mmol/LADP(游離酸)0.5-10mmol/LLDH(于25℃測定)5000-100000U/LKCl2-10mmol/L血清清蛋白0-5g/LGDH(于25℃測定)2500-20000U/LKG(游離酸)1-10mmol/L更精確的測定方案使用依賴鈉離子的酶如β-半乳糖苷酶(實(shí)例D)。
使血漿與含有2-硝基苯-β-D吡喃半乳糖(NPG)和β-D-半乳糖苷酶的緩沖液一起保溫。β-D-半乳糖苷酶催化的反應(yīng)取決于存在的鈉離子，因此通過酶活速率便可測定鈉離子濃度。這個(gè)方法的關(guān)鍵特征是在測定鈉離子濃度可能超過100mmol/L的血清或其他生物體液時(shí)，使用適量的鈉離子選擇性結(jié)合試劑(如Kryptofix 221)以降低鈉離子濃度。使酶在通常的分析范圍內(nèi)(110-170mmol/L)對鈉離子濃度的微小變化最敏感。在選擇的分析條件下(包括存在有高濃度的鎂離子和鋰離子)，2-硝基苯酚和半乳糖的形成速率基本上與待測鈉離子的濃度成正比。β-半乳糖苷酶的最佳活性需要有鎂離子。鋰離子與鈉離子具有競爭性，因而提高了酶對鈉離子的Km值。
許多其他化合物都適于作為β-D-半乳糖苷酶的底物。通常，把含有半乳糖苷酶的樣本與適當(dāng)?shù)摩?D-半乳糖苷酶底物混合，底物被酶裂解，然后以適當(dāng)?shù)姆绞綔y定裂解的產(chǎn)物之一?？梢詼y定由酶解釋放出來的糖苷或糖苷配基中的任一種。通常是測定糖苷配基。作為底物，可用天然底物乳糖，但最好是用生色半乳糖苷。例如，在Biochem.Z.333∶209(1960)中，公開了苯基-β-D-半乳糖苷，以及在芳環(huán)上有取代基的進(jìn)一步的衍生物，如2-硝基苯-β-D-半乳糖苷(NPG)和3-硝基苯-β-D-半乳糖苷，作為β-D-半乳糖苷酶的底物。用光度法在紫外范圍內(nèi)測定水解釋放的酚或在硝基酚的情況下在可見波長范圍內(nèi)測定。與氨基交替比林偶聯(lián)的氧化物也可用作隨后的指示反應(yīng)(Analytical Biochem.40∶281，1971)。在DE33 45 748和DE34 11 574中公開了其他底物。
采用10μl血漿或血清樣本，在37℃時(shí)酶法測定鈉離子的主要試劑的典型濃度范圍如下β-D-半乳糖苷酶25-7500U/LNPG0.25-5mmol/LKryptofix 221 0-10mmol/L緩沖液PH7-9.5200-500mmol/LMg2+0.01-10mmol/LEGTA(鋰鹽)0-20mmol/L血清清蛋白0-5g/LEGTA即亞乙基二(氧亞乙基次氮基)四乙酸。也可用雙試驗(yàn)的形式在同一比色杯中，用酶法分析鈉離子和鉀離子(實(shí)例G)。
鈣離子的測定測定鈣離子時(shí)，將血漿樣本(或其他體液)與緩沖混合物一起保溫，此緩沖混合液含有肽底物琥珀酰-亮氨酰-甲硫氨酰-P-硝基苯胺和酶Calpain I。由Calpain I催化的反應(yīng)依賴于鈣離子的存在，以活性速率可測得鈣離子濃度。此法的主要特征是利用了螯合物，它能與鈣離子特異性結(jié)合，使鈣離子的濃度降至酶的最敏感范圍內(nèi)。在選擇的分析條件下，有L-半胱氨酸和2-巰基乙醇的存在，P-硝基苯胺的形成速率與待測鈣離子的濃度基本上成正比。
優(yōu)選的肽底物可用下面的通式表示
這里R代表乙酰基、苯甲酰基、芐氧羰基、琥珀?；?、叔丁氧羰基或3-(2-呋喃基)丙烯?；?Pn-P2-P1代表不少于2個(gè)氨基酸殘基的肽鏈，在P1位置上的優(yōu)選氨基酸為Tyr、Met、Lys和Arg，P2位置上的優(yōu)選氨基酸為Leu或Val;X代表一個(gè)生色或產(chǎn)熒光基團(tuán)，它在酶的作用下能釋放產(chǎn)生可檢測的顏色或熒光變化。X可以是硝基苯基、萘酚基或硫苯甲酰酯，也可以是進(jìn)一步帶有或不帶有芳環(huán)取代基的硝基苯胺、萘酚胺或甲基香豆素基團(tuán)。T.Sasaki等人(J.Biol.Chem.259∶12489-12494)也記述了一些適宜的肽衍生物，例如琥珀酰-Leu-Met-MCA(MCA＝4-甲基香豆素-7-酰胺)、琥珀酰-Leu-Tyr-MCA、琥珀酰-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA和叔丁氧羰基-Val-Leu-Lys-MCA。Bergmeyer HU編《酶法分析》，第3版第5卷，84-85頁中記述了進(jìn)一步的合成底物。
本測定方法所用化合物和試劑的濃度范圍如下Calpain I 1000-40000U/L＊琥珀酰-Leu-Met-P-硝基苯胺1-20mmol/L
螯合劑0.01-1mmol/LL-半胱氨酸1-10mmol/L2-巰基乙醇1-10mmol/L咪唑-HCl緩沖液10-100mmol/LPH6-8(優(yōu)選范圍7-7.5)星號＊表示的單位定義為用酪蛋白作為底物于30℃保溫30分鐘，使750nm處的光吸收增加1.0的酶量(N.Yoshimura et al.，J.Biol.Chem.258∶8883-8889，1983)。
只要PK值在要求的PH值范圍內(nèi)，并且與鈣的結(jié)合能力可以忽略不計(jì)的任何緩沖液本法均可采用。許多Good型緩沖液(N.E.Good et al.，Biochem.5∶467-477，1966)，例如Tris、HEPES、MOPSO、BES、TES和咪唑可以滿足要求(實(shí)例H)。可用膠原酶取代CalpainI，此時(shí)則于PH6.5-7.5，0.02-0.2mmol/L的L-異亮氨酸-L-丙氨酰甘氨酰乙酯的條件下進(jìn)行熒光定量測定。
氯離子的測定測定血液中的氯離子時(shí)，將血漿與含有0.01mol/L半胱胺、4mmol/L Gly-Phe-p-硝基苯胺酰和0.02U/ml Cathepsin C的緩沖混合物一起保溫。p-硝基苯胺的形成完全依賴于氯離子的存在。另外，可以加入選擇性結(jié)合試劑以減小鋇離子的干擾或減小氯離子的活性，使其濃度調(diào)整至酶的最優(yōu)范圍。在選擇的分析條件下(見實(shí)例5)，p-硝基苯胺的形成速率Gly-Arg-NH- -NO2(Cathepsin C)/() Gly-Arg+H2N- -NO2
與樣本中氯離子濃度成正比。本例中通過測定405nm處光吸收的增加值來計(jì)算反應(yīng)速率。
本測定方法化合物的濃度范圍為檸檬酸緩沖液0.01-0.2mmol/LPH4-7(優(yōu)選5.0-5.5)半胱胺1-20mmol/LGly-Arg-p-硝基苯胺酰1-20mmol/LCathepsin C2-100mU/ml任何PK值在要求的PH范圍內(nèi)且僅含可忽略不計(jì)的氯離子濃度的緩沖液，本法均能采用?，F(xiàn)有文獻(xiàn)表明，上文中列出的所有酶類(轉(zhuǎn)移酶、水解酶、氧化還原酶和裂解酶)中的酶的實(shí)例均依賴于氯，特別是當(dāng)這些酶是從嗜鹽性生物中提取時(shí)是這樣。依賴于氯離子的肽酶類型已有廣泛記述。例如二肽肽酶I(Cathepsin C)，E.C.3.4.14.1(J.Ken Mc Donald，Biochem.Biophys.Res.Commun.24(5)，1966，771f)或二肽肽酶Ⅲ，E.C.3.4.14.3(J.Ken Mc Donald，J.Biol.Chem.241(7)1966，1494f)，兩者均從寡肽衍生物的氨基末端催化水解。另一例為血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶E.C.3.4.15.1，它為二肽羧基肽酶，從多種寡肽的羧基末端開始催化水解釋放出二肽(P.Bunning et al.，Biochem.26，1987，3374f;R.Shapiro et al.，Biochem.22，1983，3850f)。
其他不同的二肽或寡肽底物可用來取代Gly-Arg-p-硝基苯胺。優(yōu)選的肽底物可用下列通式表示
這里對于二肽肽酶來說R＝H，Pn-P1代表該肽至少有2個(gè)氨基酸殘基。X表示一個(gè)生色或產(chǎn)熒光集團(tuán)，當(dāng)酶作用時(shí)，它能被釋放出來產(chǎn)生可檢測的顏色或熒光的變化。X可以是硝基苯基、萘酚基或硫苯甲酰酯，也可以是進(jìn)一步有或無芳環(huán)取代基的硝基苯胺、萘酚胺或甲基香豆素基團(tuán)。對于二肽羧基肽酶來說，X表示肽鏈的氨基末端，R表示酶作用時(shí)可釋放的生色或產(chǎn)熒光基團(tuán)。R可以是有或無進(jìn)一步取代基的N-2-呋喃丙烯?；虮郊柞；鶊F(tuán)(實(shí)例Ⅰ)。
作為酶學(xué)測定氯離子的進(jìn)一步的實(shí)例(實(shí)例J)，將血漿與含有4，6-亞乙基(G7)-p-硝基苯(G1)、D-麥芽七糖苷(4，6-亞乙基G7PNP)(5mmol/L)、α-淀粉酶(0.60U/ml)和α-葡萄糖苷酶(＝30U/ml)的緩沖混合物一起保溫。p-硝基苯酚的產(chǎn)生完全依賴于氯離子的存在，再次使用預(yù)稀釋、少量樣本或選擇性結(jié)合試劑來調(diào)整氯離子濃度，使其處于酶作用的最佳范圍內(nèi)。試驗(yàn)原理總結(jié)如下，反應(yīng)速率通過測定405nm處吸光率的增加量來推算。
本測定方法的化合物濃度范圍如下Hepes或無氯的緩沖液0.01-0.5mmol/LPH6.5-7.5α-淀粉酶60-6000U/Lα-葡萄糖苷酶3000-300，000U/L4，6-亞乙基-G7PNP 0.5-10mmol/L上面關(guān)于在Cathepsin C(實(shí)例Ⅰ)所討論的測試中的改變也適用于實(shí)例J。
重金屬離子測定這些重金屬緊密地結(jié)合于如Kryptofix 221和Kryptofix 222這樣的穴狀配體。因此，它們會(huì)取代其他結(jié)合松散的金屬。例如一個(gè)易被取代的金屬離子為鋅。鋅在血漿中的濃度是很低的。于是，可以將已與K221絡(luò)合的鋅離子加入緩沖的血清混合物中。假如混合物中有重金屬，鋅離子則被取代而釋放，釋放后的鋅離子濃度可用吡哆醛激酶(取自羊腦)的激活作用來檢測，吡哆醛激酶對鋅離子是高度敏感的。許多其他相似的競爭性結(jié)合測試法也可以應(yīng)用，這里只是通過舉例說明并非限制。
碳酸氫根離子的測定利用本發(fā)明原理的變化形式可以測定碳酸氫根離子。許多配體(如穴狀配體)對PH敏感，這個(gè)性質(zhì)可用來測定碳酸氫鹽。主要是利用碳酸氫鹽能中和質(zhì)子的特性。在緩沖能力極小的血清樣本中加鹽酸，我們將會(huì)看到PH值將作為碳酸氫鹽濃度的函數(shù)而變化。最終PH值通過游離鈉離子的量(如用β-半乳糖苷酶來測定)來測定，此時(shí)存在有類似Kryptofix 221這樣的PH敏感的離子結(jié)合試劑，這是最初的碳酸氫鹽濃度的作用。簡而言之，將血清酸化至pH4.5左右，采用等體積HCl(75mmol/L)把所有碳酸氫鹽變成氫氧根離子，然后于PH7.5-7.8與一種檢測系統(tǒng)反應(yīng)，此檢測系統(tǒng)采用稀釋的Tris緩沖液(5mmol/L)與一種離子選擇性酶，如β-半乳糖苷酶和適宜的PH敏感的離子結(jié)合試劑。由于必須根據(jù)樣本中的鈉離子含量進(jìn)行校正，因此，要得到正確的結(jié)果，樣本中的鈉離子濃度必須是已知的。此法實(shí)際上比利用生色指示劑作為PH測定(實(shí)例K)靈敏得多。
采用10μl的血漿或血清樣本，在37℃時(shí)，酶法測定碳酸氫根離子的主要試劑的典型濃度范圍如下β-D-半乳糖苷酶250-7500U/LNPG0.25-5mmol/LKryptofix 221 0.2-5mmol/L緩沖液PH7.5-7.81-10mmol/LMg2+0.01-10mmol/LEGTA(鋰鹽)0.1-5mmol/L血清清蛋白0-5 g/L使用對通常以微摩爾濃度存在于血漿中的痕量金屬(如鋅離子)敏感的酶(如吡哆醛激酶)，可以免去對鈉離子濃度的校正。假如痕量金屬與其結(jié)合試劑的結(jié)合是PH敏感的，且親和力與鈉離子和Kryptofix 221之間的親和力相似，那么，通過在反應(yīng)混合物中加入鋅離子(其濃度足以超過血漿中固有的濃度)能夠測定碳酸氫根離子，因此，內(nèi)源鋅離子不會(huì)干擾。
上面描述的方法簡便、快速、準(zhǔn)確和精確，使用的儀器價(jià)格低廉?？梢员苊庥梢兹?xì)怏w引起的事故，以及與離子選擇電極相關(guān)的許多問題。此法不僅適合于大規(guī)模設(shè)備進(jìn)行多種分析，而且還適于價(jià)格低廉的簡單儀器進(jìn)行床邊的緊急測定。此方法藥盒形式的試劑十分簡便。另外，鉀和鈉離子的濃度可在同一比色杯中依次測定(實(shí)例G)。此方法無疑還可用于備有能利用干燥化學(xué)試劑的儀器的大夫辦公室。盡管這些方法已發(fā)展為利用自動(dòng)色譜儀，但也容易適于自動(dòng)化或人工操作的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，如熒光計(jì)、光度儀、同位素計(jì)數(shù)器等。
本發(fā)明將以下述實(shí)例進(jìn)行更詳細(xì)的說明，以10μl血清或血漿樣本為基礎(chǔ)。這些實(shí)例僅僅是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明而不是限制。
下述實(shí)例中的少量樣本(10μl，除非對血清或血漿有特別說明)與試劑1混合(試劑1包括緩沖底物和一些輔助因子)，保溫一段時(shí)間，通常為0.1-5分鐘，在保溫期間通常以一定時(shí)間間隔讀取吸光率。然后加入試劑2(含指示酶)，監(jiān)視反應(yīng)速率。在某些實(shí)例中，試劑1包含指示酶而試劑2含有合適底物。實(shí)例中所指的最終反應(yīng)混合物是指樣本、試劑1和試劑2的混合物。
實(shí)例A利用丙酮酸激酶測定鉀離子濃度，其中不含鈉離子結(jié)合試劑，鈉離子濃度未知。
最終的保溫混合物包含Tris-HCl 緩沖液PH7.4175mmol/LLi+(17mmol/L LiOH，3mmol/L Licl) 20mmol/LMnCl23.0mmol/LADP(游離酸)2.6mmol/LPEP(中性Tris鹽)2.9mmol/L
NADH0.4mmol/L (25℃測定) 17000U/LPK(提自脂嗜熱桿菌)890U/LKG4.0mmol/LGDH(于甘油中;25℃測定)8600U/L人血清清蛋白140mg/L鉀離子標(biāo)準(zhǔn)液(校準(zhǔn)溶液)中含140mmol/L鈉離子以補(bǔ)償血漿中鈉離子對丙酮酸的激活效應(yīng)。
實(shí)例B利用丙酮酸激酶測定鉀離子濃度，其中無鈉離子結(jié)合試劑，鈉離子濃度已知。
保溫混合物和校準(zhǔn)溶液同實(shí)例A。
在鈉離子濃度低于(或高于)140mmol/L時(shí)，以每10mmol/L鈉離子濃度加上(或減去)0.1mmol/L鉀離子，以此校正混合物中的鈉離子濃度。但是，這個(gè)校正必須由分析含已知鈉和鉀濃度的水溶液來驗(yàn)證。
實(shí)例C 利用丙酮酸激酶測定鉀離子濃度，其中含有鈉離子結(jié)合試劑同實(shí)例B，但減去人血清清蛋白，每次測定額外加上6μmol Kryptofix 221。選擇PH7.8，以使由于各個(gè)樣本中鉀離子含量不同而引起的鈉離子從Kryptofix 221中被取代的變化減少到最小。
實(shí)例D 利用β-D-半乳糖苷酶測定鈉離子濃度變化a最后的保溫混合物含有Tris-HCl PH8.7(37℃)300mmol/L二硫蘇糖醇4mmol/L
硫酸鎂7.5mmol/L氯化鋰16mmol/LEGTA(鋰鹽)0.44mmol/L人血清清蛋白460mg/Lβ-半乳糖苷酶760U/LNPG1.5mmol/LKryptofix 221 1.25μmol/測定在420nm(或附近)波長下監(jiān)測反應(yīng)，以測定游離硝基苯酚的形成速度，從而測得原始樣本中鈉離子的濃度。
變化b為變化a的替代方法，通過預(yù)稀釋或使用少量樣本將樣本濃度降低十倍，這里可以減去穴狀配體。
變化c測定低含量鈉離子(例如小于20mmol/L)的液體，這里可以減去穴狀配體。
實(shí)例E 利用丙酮酸激酶測定鈉離子(當(dāng)鉀離子敏感性消失時(shí)，由鈉離子直接激活酶)。
變化a10μl血漿樣本的保溫混合物含有Tris-HCl PH8.7(37℃)300mmol/LMgCl25mmol/LADP(游離酸)2.6mmol/LPEP(中性Tris鹽)2.9mmol/LNADP0.34mmol/LLDH(25℃測定)17000U/LPK(取自兔肌肉，37℃測定)2000U/LKG4mmol/L
GDH(在甘油中，25℃測定)8600U/LKryptofix 222 1.25μmol/測定鈉離子校準(zhǔn)溶液中含有4mmol/L鉀以補(bǔ)償血清中鉀離子對丙酮酸激酶的激活效應(yīng)。
實(shí)例F 利用丙酮酸激酶測定鈉離子(競爭性結(jié)合測試)，鉀離子濃度已知最終與10μl血漿樣本一起保溫的混合物包含甘氨酸PH9.8300mmol/LMgCl25mmol/LADP(游離酸)2.6mmol/LPEP(中性Tris鹽)2.9mmol/LNADH0.34mmol/LLDH(25℃測定)17000U/LPK(取自兔肌肉，37℃測定) 890U/LKG4mmol/LGDH(25℃測定)8500U/LKCl5mmol/LKryptofix 221 2.5μmol/測定將氯化鉀加入此試劑，并使其以化學(xué)計(jì)量方式被鈉離子從Kryptofix 221中取代，從而使樣本中的鈉離子濃度得以定量化。
實(shí)例G 在同一比色杯中測定鉀和鈉離子濃度(雙試驗(yàn))鈉離子濃度測定首先同實(shí)例D，但測定時(shí)另外還包含ADP(游離酸)2.6mmol/LPEP(中性Tris鹽)2.9mmol/L
NADH0.4mmol/LKG4.0mmol/LGDH8600U/L通過測定反應(yīng)速度而測定鈉離子后，加入鹽酸使保溫混合物的PH降至7.4。
然后加入下列成分以達(dá)到指出的最終濃度LDH1700U/LPK(來自脂嗜熱桿菌)890U/LMnCl23.0mmol/LLiCl20.0mmol/L然后在340nm波長處監(jiān)測反應(yīng)速度，但是也可在稍高一些的波長下測定，以使鈉離子指示反應(yīng)所釋放的2-硝基苯酚的可能干涉降至最低。
實(shí)例H 利用CalpainⅠ測定鈣離子濃度在本實(shí)例中，離心少量血液樣本得到血漿。測定鈣離子時(shí)，將樣本與含有50mmol/L咪唑-HCl緩沖液PH7.3，5mmol/L L-胱氨酸，2.5mmol/L2-巰基乙醇，0.1mmol/L EGTA和5mmol/L Suc-Leu-Met-p-硝基苯胺酰的混合物于30℃保溫。以5分鐘為間隔監(jiān)測405nm波長處的吸光率的增加值。增加速率與樣本中的鈣離子濃度成正比。
實(shí)例Ⅰ 利用Cathepsin C測定氯離子濃度在本實(shí)例中，離心少量血液樣本得到血漿(5μl)。測定氯離子時(shí)，保溫混合物包含0.05mmol/L檸檬酸鹽緩沖液PH5.0，10mmol/L半胱胺，4mmol/L Gly-Arg-p-硝基苯胺酰和0.01U/ml Cathepsin C。后者已用10mmol/L硫酸鈉鹽緩沖液(PH6.8)及43%(V/V)甘油透析出以除去氯離子。用此法得到的典型的標(biāo)準(zhǔn)曲線如

圖1所示。
實(shí)例J 利用α-淀粉酶測定氯離子濃度5μl血漿樣本的抑制混合物包含Hepes或無氯的緩沖液100mmol/LPH7.1α-淀粉酶600U/Lα-葡萄糖苷酶30000U/L4，6-亞乙基-G7PNP 5mmol/L于405nm(或附近)波長監(jiān)測反應(yīng)來測定游離4-硝基苯酚的形成速率，從而測得原始樣本中的氯離子濃度。
實(shí)例K 利用β-D-半乳糖苷酶測定碳酸氫根離子的濃度變化a最終保溫混合物包含Tris-HCl PH7.8(37℃)5mmol/L二硫蘇糖醇4mmol/L硫酸鎂7.5mmol/L氯化鋰16mmol/LEGTA(鋰鹽)0.44mmol/L人血清清蛋白460mg/Lβ-半乳糖苷酶1500U/LNPG1.5mmol/LKryptofix 221 2.0μmol/測定EGTA是指亞乙基雙(氧亞乙基次氮基)-四乙酸。樣本先與等體積HCl(對于血漿，75mmol/L)保溫使樣本PH降至4.5。然后在420nm波長處(或附近)測定游離2-硝基苯酚的形成速率，從而測得原始樣本中碳酸氫鹽濃度。對原始樣本中的鈉離子濃度進(jìn)行校正。
變化b用吡哆醛激酶、吡哆醛和鋅離子替代β-半乳糖苷酶和NGP。
權(quán)利要求
1.一種測定液體中鈉離子的方法，其特征在于測定這鈉離子對酶活性的影響。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所用液體是指生物或非生物液體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中生物液體是指血液、血清、血漿、尿、汗、脊髓液、淋巴或消化道分泌物、浸出液或滲出液，非生物液體是指水或含水提取液或混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中之一的方法，其中所用的酶是轉(zhuǎn)移酶、水解酶或氧化還原酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中轉(zhuǎn)移酶是轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的，水解酶是糖苷酶或作用于肽鍵的酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中水解酶是α-或β-D-半乳糖、苷酶、羧基肽酶A、膠原酶、淀粉酶、Calpain Ⅰ、CalpainⅡ、二肽氨基肽酶Ⅰ(組織蛋白酶C)或磷酸甘油磷酸酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中轉(zhuǎn)移酶是指丙酮酸激酶、已糖激酶、腺苷酸激酶、吡哆醛激酶或乙酸激酶，水解酶是指α-或β-D-半乳糖苷酶或羧基肽酶A。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中氧化還原酶作用于供體分子的CH-OH基團(tuán)或供體上的醛或氧代基團(tuán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中氧化還原酶是指甘油脫氫酶、乙醛脫氫酶或酪氨酸酶(兒茶酚氧化酶)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中之一的方法，其中用丙酮酸激酶或β-D-半乳糖糖苷酶測定鈉離子。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中之一的方法，其中干擾離子用結(jié)合試劑掩蔽。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-12中之一的方法，其中如果樣本不能稀釋和/或酶對待測離子的親和力需要減小時(shí)，那么用結(jié)合試劑結(jié)合被測鈉離子，使其濃度減至最佳水平。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的方法，其中與干擾離子或分析物結(jié)合的結(jié)合試劑為穴狀配體、冠醚配體、足狀配體、冠醚、球狀配體、半球狀配體、萼狀配體和它們的組合、天然離子載體、環(huán)肽、配位酮和螯合劑、和它們的衍生物。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中之一的方法，其中測定鈉離子時(shí)用Kryptofix 222結(jié)合干擾離子鉀。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中用β-半乳糖苷酶測定鈉離子，用結(jié)合試劑降低游離鈉離子的濃度和/或用鋰離子減小酶對鈉離子的親和力。
16.根據(jù)權(quán)利要求12或15的方法，其中結(jié)合試劑為Kryptofix 221。
17.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中存在有權(quán)利要求13中的結(jié)合試劑，它與指示離子形成絡(luò)合物，再由待測的鈉離子以化學(xué)計(jì)量方式取代指示離子，再測定被取代的指示離子對酶活的影響，從而間接測出鈉離子的濃度。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所用的酶是丙酮酸激酶，指示離子是鉀，結(jié)合試劑是Kryptofix 221和被測離子是鈉。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中被測離子引起pH值的改變，從而使已與pH敏感的結(jié)合試劑絡(luò)合的指示離子被取代。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19中之一的方法，其中在測定中包括作為敏感指示酶的競爭性抑制劑的離子。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中被測離子是鈉，競爭性抑制劑為鋰離子。
22.一種用于測定液體中鈉離子的組合物，該組合物包括活性受鈉離子影響的酶。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的組合物，該組合物包括活性受鈉離子影響的酶，結(jié)合試劑結(jié)合液體中的干擾離子和/或降低鈉離子的濃度，使其達(dá)到最佳測定范圍。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的組合物，其中在測定鈉離子時(shí)，包括丙酮酸激酶和一種穴狀配體。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的組合物，其中的穴狀配體是Kryptofix 222。
26.根據(jù)權(quán)利要求23的組合物，其中在測定鈉離子時(shí)，包括β-D-半乳糖糖苷酶和一種穴狀配體。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的組合物，其中的穴狀配體是Kryptofix 221。
28.用于測定鈉離子的組合物，該組合物包括β-D-半乳糖糖苷酶25-7500U/LNPG0.25-5mmol/LKryptofix 221 0-10mmol/L緩沖液，pH7-9.5200-500mmol/LMg2+0.01-10mmol/LEGTA(鋰鹽)0-20mmol/L血清清蛋白0-5g/L
29.優(yōu)選使用于37℃時(shí)測定鈉離子的組合物，該組合物包括PK(兔肌肉)50-10000U/LPEP(中性Tris鹽)0.3-3mmol/LKryptofix 221 1-10mmol/LNADH0.01-0.8mmol/L緩沖液，pH9-1050-500mmol/LMg2+1-10mmol/LADP(游離酸)0.5-10mmol/LLDH(25℃測定)5000-100000U/LKCl2-10mmol/L血清清蛋白0-5g/LGDH(25℃測定) 2500-20000U/LKG(游離酸)1-10mmol/L
30.優(yōu)選使用于37℃時(shí)測定鈉離子的組合物，該組合物包括PK(兔肌肉)50-10000U/LPEP(中性Tris鹽)0.3-30mmol/LKryptofix 221 0.4-4mmol/LNADH0.01-0.8mmol/L緩沖液，pH9-1050-500mmol/LMg2+1-10mmol/LADP(游離酸)0.5-10mmol/LLDH(25℃測定)5000-100000U/LKCl2-10mmol/L血清清蛋白0-5g/LGDH(25℃測定)2500-20000U/LKG(游離酸)1-10mmol/L
31.測定同一容器中鉀和鈉離子濃度的方法，其特征在于通過反應(yīng)速率測定方法測定鈉離子濃度，降低保溫混合物的pH值，然后測定鉀離子濃度。
32.測定同一容器中鉀和鈉離子濃度的方法，其特征在于通過反應(yīng)速率測定法測定鈉離子濃度，降低下列物質(zhì)的保溫混合物的pH值，并加入成分LDH、PK、MnCl2和LiCl;所說的物質(zhì)為Tris HCl，pH8.7(37℃)二硫蘇糖醇硫酸鎂氯化鋰EGTA(鋰鹽)人血清清蛋白β-半乳糖苷酶NPGKryptofix 221ADP(游離酸)PEP(中性Tris鹽)NADHKGGDH。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物或非生物液體中的離子(下面稱為分析物)測定的方法和組合物。本發(fā)明的理論根據(jù)是許多分析物有激活或抑制敏感酶的作用。分析物可以是陽離子、陰離子、金屬或非金屬、單質(zhì)或化合物。在實(shí)踐中，經(jīng)常遇到分析物在樣本中的濃度超過相關(guān)分析指示酶的敏感性范圍，或存在其他離子對酶的敏感性產(chǎn)生干擾。本發(fā)明從多種途徑提出并解決這些問題的方案。
文檔編號H01L21/36GK1104772SQ9410082
公開日1995年7月5日 申請日期1994年1月22日 優(yōu)先權(quán)日1987年4月10日
發(fā)明者邁克爾·納撒尼爾·貝里, 邁克爾-哈羅德·湯恩, 格奧爾格-布爾克哈德·克爾塞, 烏韋·赫爾曼 申請人:曼海姆泊靈格股份公司, 南澳大利亞弗林德斯大學(xué)