一種電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器標記物的制備方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器標記物的制備方法及應(yīng)用，涉及納米科學(xué)、生物免疫技術(shù)、電化學(xué)傳感等領(lǐng)域。本發(fā)明利用金納米顆粒和多孔石墨相氮化碳納米片優(yōu)異的催化性能，制備了金納米顆粒負載的多孔石墨相氮化碳納米片，通過氨基封端的聚乙二醇進行修飾，實現(xiàn)了發(fā)光試劑魯米諾和生物分子的固定。納米復(fù)合物對共反應(yīng)試劑良好的催化性能極大提升了發(fā)光試劑的發(fā)光效率。多臂聚乙二醇不但提高了發(fā)光試劑和生物分子的固定量，其抗蛋白性質(zhì)降低了非特異性分子的吸附，提高了靈敏度。該標記物可以適用于多種電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備，在科研和臨床中具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器標記物的制備方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及納米科學(xué)、生物免疫技術(shù)、電化學(xué)傳感等領(lǐng)域，具體涉及一種電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器標記物的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]物標志物檢測是目前唯一無創(chuàng)的早期預(yù)警癌癥等疾病的方法，在臨床中對腫瘤的普查、診斷及判斷預(yù)后等具有十分重要的意義。在眾多的生物標志物檢測方法中，電化學(xué)發(fā)光免疫分析是目前最先進的免疫測定技術(shù)，具有操作簡便、樣品量少、快速靈敏、成本低廉且易于實現(xiàn)微型化等優(yōu)點，在臨床和科研中得到了廣泛應(yīng)用。
[0003]電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器通常通過對抗原或抗體等生物分子進行標記來檢測信號，但通常標記過程復(fù)雜，操作費時，并且信號較低。因此基于具有良好催化性能的納米材料構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光傳感器標記物引起了人們極大的研究興趣。電化學(xué)發(fā)光傳感器具有步驟簡單、方便快速、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，具有良好的應(yīng)用前景。
[0004]具有穩(wěn)定發(fā)光性能和良好生物相容性的標記物制備是構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光傳感器的關(guān)鍵。石墨相氮化碳納米片是一種具有良好催化性能的二維納米材料，近來被用于構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光傳感器，與傳統(tǒng)半導(dǎo)體發(fā)光納米材料相比，具有合成簡單，成本低廉，生物相容性好等特點。但依然存在石墨相氮化碳納米片修飾困難、缺乏簡單而有效的標記方法等問題。傳統(tǒng)的發(fā)光試劑在生物分子上的固定通常需要復(fù)雜的共價修飾過程，較低的固載量使發(fā)光性能大大降低，同時生物分子識別單元在納米載體上的固定也需要復(fù)雜的修飾過程。
[0005]本發(fā)明利用金納米顆粒和多孔石墨相氮化碳納米片優(yōu)異的催化性能，制備了金納米顆粒負載的多孔石墨相氮化碳納米片，通過氨基封端的聚乙二醇進行修飾，實現(xiàn)了發(fā)光試劑魯米諾和生物分子的固定。納米復(fù)合物對共反應(yīng)試劑良好的催化性能極大提升了發(fā)光試劑的發(fā)光效率。多臂聚乙二醇不但提高了發(fā)光試劑和生物分子的固定量，其抗蛋白性質(zhì)降低了非特異性分子的吸附，提高了靈敏度。本發(fā)明的目的之一是提供簡單通用的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器用生物標記物的制備方法，解決傳統(tǒng)標記物標記困難、信號差等問題。
[0006]本發(fā)明的目的之二是提供快速、低成本、通用的生物傳感檢測方法，為電化學(xué)發(fā)光生物傳感器在實際中的應(yīng)用提供技術(shù)基礎(chǔ)。
[0007]—種電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器標記物的制備方法及應(yīng)用，包括以下步驟:
(1)多孔石墨相氮化碳納米片的制備:用三聚氰胺和硫脲作為前驅(qū)體通過550°C高溫縮聚反應(yīng)制備多孔石墨相氮化碳，然后將100 mg多孔石墨相氮化碳在100 mL超純水中超聲剝離10?24小時，5000轉(zhuǎn)離心去掉未剝離的多孔石墨相氮化碳，制得多孔石墨相氮化碳納米片的水溶液；
(2)金納米顆粒的制備:用梓檬酸鈉還原法制備粒徑為10-14nm的金納米顆粒；
(3)將2mL金納米顆粒水溶液加入到5 1^濃度為0.5 mg.mL—1的多孔石墨相氮化碳納米片水溶液中，振蕩12小時，10000轉(zhuǎn)離心得到金納米顆粒與多孔石墨相氮化碳納米片的納米復(fù)合物； (4)在21^濃度為0.5 mg.mL—1的納米復(fù)合物水溶液中加入50 口1^濃度為0.5 mg.mL—1的氨基封端的4臂或8臂聚乙二醇水溶液，振蕩2小時后離心，重新分散到2 mL水中得到聚乙二醇包覆的納米復(fù)合物；
(5)在聚乙二醇包覆的納米復(fù)合物水溶液中加入5UL濃度為I mmol.mL—1的魯米諾水溶液，用戊二醛進行交聯(lián)，離心；
(6)將上述離心所得沉淀重新分散于2mL、0.1 mol.L—\pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，然后加入0.1 mL、10 yg.mL—1的二抗溶液，在4攝氏度下孵化2 h，離心，重新分散于2mL、0.1 mo I.L—\pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，即制得一種電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器二抗標記物溶液。
[0008]本發(fā)明的有益成果
(I)該標記物制備方法利用石墨相氮化碳納米片的多孔結(jié)構(gòu)很好地實現(xiàn)了金納米顆粒的負載，從而便于進行氨基封端聚乙二醇的修飾。
[0009](2)該方法制備的標記物結(jié)合了石墨相氮化碳納米片和金納米顆粒對雙氧水的雙重催化作用，使魯米諾的電化學(xué)發(fā)光效率大大提升。
[0010](3)該方法制備的標記物由于聚乙二醇的抗蛋白作用，避免了生物分子在標記物上的非特異性吸附，標記后可以直接進行傳感器的構(gòu)建。
【具體實施方式】
[0011]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0012]實施例1
前列腺特異性抗原二抗標記物的制備
(1)多孔石墨相氮化碳納米片的制備:用三聚氰胺和硫脲作為前驅(qū)體通過550°C高溫縮聚反應(yīng)制備多孔石墨相氮化碳，然后將100 mg多孔石墨相氮化碳在100 mL超純水中超聲剝離24小時，5000轉(zhuǎn)離心去掉未剝離的多孔石墨相氮化碳，制得多孔石墨相氮化碳納米片的水溶液；
(2)金納米顆粒的制備:用梓檬酸鈉還原法制備粒徑為10-14nm的金納米顆粒；
(3)將2mL金納米顆粒水溶液加入到5 1^濃度為0.5 mg.mL—1的多孔石墨相氮化碳納米片水溶液中，振蕩12小時，10000轉(zhuǎn)離心得到金納米顆粒與多孔石墨相氮化碳納米片的納米復(fù)合物；
(4)在21^濃度為0.5 mg.mL—1的納米復(fù)合物水溶液中加入50 口1^濃度為0.5 mg.mL—1的氨基封端的分子量為10 kDa的8臂聚乙二醇水溶液，振蕩2小時后離心，重新分散到2 mL水中得到聚乙二醇包覆的納米復(fù)合物；
(5)在聚乙二醇包覆的納米復(fù)合物水溶液中加入5UL濃度為I mmol.mL—1的魯米諾水溶液，用戊二醛進行交聯(lián)，離心；
(6)將上述離心所得沉淀重新分散于2mL、0.1 mol.L—\pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，然后加入0.1 mL、10 yg ^mL-1的前列腺特異性抗原二抗溶液，在4攝氏度下孵化2 h，離心，重新分散于2 mL、0.1 mo I.L—\pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，即制得前列腺特異性抗原二抗標記物溶液。
[0013]實施例2
前列腺特異性抗原電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的構(gòu)建
(1)用移液槍將5UL濃度為1.0 mg.mL.1的氨基化石墨烯溶液滴涂在處理、活化好直徑為4 mm的玻碳電極表面，室溫瞭干；
(2)用移液槍將5UL前列腺特異性抗原捕獲抗體溶液(10 Hg mL—1)滴涂在步驟(I)制得的電極表面，4°C條件下晾干。
[0014](3)非特異性位點封閉:用超純水多次沖洗步驟(2)制得的電極，用移液槍將6 pL質(zhì)量分數(shù)為1%的牛血清白蛋白溶液滴涂在步驟(2)制得的電極表面，4°C條件下晾干，超純水沖洗。
[0015](4)用移液槍滴涂5 UL前列腺特異性抗原標準溶液或未知樣品溶液至電極表面，4°C下晾干，超純水沖洗。
[0016](5)將4 yL前列腺特異性抗原二抗標記物溶液滴至電極表面，置于40C冰箱中孵化I h，清洗后，晾干。
[0017](6)以步驟(5)制得的電極為工作電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，Pt電極為對電極，用pH為7.4的PBS緩沖溶液配制的20 mmol.mL—1的H2O2溶液作為底液，在電化學(xué)發(fā)光工作站上以循環(huán)伏安模式測定0.2?0.8 V電勢下的發(fā)光信號，制得一種前列腺特異性抗原的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器。
【主權(quán)項】
1.一種電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器標記物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)多孔石墨相氮化碳納米片的制備:用三聚氰胺和硫脲作為前驅(qū)體通過550°C高溫縮聚反應(yīng)制備多孔石墨相氮化碳，然后將100 mg多孔石墨相氮化碳在100 mL超純水中超聲剝離10?24小時，5000轉(zhuǎn)離心去掉未剝離的多孔石墨相氮化碳，制得多孔石墨相氮化碳納米片的水溶液； (2)金納米顆粒的制備:用梓檬酸鈉還原法制備粒徑為10-14nm的金納米顆粒； (3)將2mL金納米顆粒水溶液加入到5 1^濃度為0.5 mg.mL—1的多孔石墨相氮化碳納米片水溶液中，振蕩12小時，10000轉(zhuǎn)離心得到金納米顆粒與多孔石墨相氮化碳納米片的納米復(fù)合物； (4)在21^濃度為0.5 mg.mL—1的納米復(fù)合物水溶液中加入50 口1^濃度為0.5 mg.mL—1的聚乙二醇水溶液，振蕩2小時后離心，重新分散到2 mL水中得到聚乙二醇包覆的納米復(fù)合物； (5)在聚乙二醇包覆的納米復(fù)合物水溶液中加入5UL濃度為I mmol.mL—1的魯米諾水溶液，用戊二醛進行交聯(lián)，離心； (6)將上述離心所得沉淀重新分散于2mL、0.1 mol.Γ\ρΗ 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，然后加入0.1 mL、10 yg.mL—1的二抗溶液，在4攝氏度下孵化2 h，離心，重新分散于2 mL、0.1 mo I *L—\pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，即制得一種電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器二抗標記物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器標記物的制備方法，其特征在于，所述的聚乙二醇為氨基封端的4臂或8臂聚乙二醇，分子量為10?40 kDa。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器標記物的制備方法，其特征在于，所述制備的標記物用于構(gòu)建一抗/抗原/ 二抗標記物的雙抗體夾心型生物傳感器，通過所制備的二抗標記物的電致化學(xué)發(fā)光信號實現(xiàn)目標物的檢測。
【文檔編號】G01N21/76GK106066324SQ201610369739
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2016年5月30日 公開號201610369739.9, CN 106066324 A, CN 106066324A, CN 201610369739, CN-A-106066324, CN106066324 A, CN106066324A, CN201610369739, CN201610369739.9
【發(fā)明人】馬洪敏, 魏琴, 吳丹, 張勇, 龐雪輝, 胡麗華, 杜斌, 范大偉
【申請人】濟南大學(xué)