一種定量糖蛋白上n-連唾液酸化糖鏈占有率的方法及其在肝癌標志物篩選中的應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種定量糖蛋白上N-連唾液酸化糖鏈占有率的方法及其在肝癌標志物篩選中的應用。首先取同一種狀態(tài)下含糖蛋白的生物樣品等量兩份，然后用高碘酸鈉溶液對其分別處理以進行差異氧化，之后利用蛋白層次上的酰肼化學法富集差異氧化后的樣品中的糖蛋白，然后利用不同穩(wěn)定同位素差異標記酰肼微球上的糖肽，再然后用肽糖苷酶PNGase F處理，最后對混合差異標記的N-糖肽進行質譜分析，以定量N-連唾液酸化糖鏈的占有率。本方法可以用于糖基化修飾的蛋白質組學分析，能同時獲取相應的糖蛋白、糖肽和糖基化位點的鑒定結果，尤其可用于人肝癌(HCC)的潛在生物標志物的篩選。本方法簡便，高效。
【專利說明】
-種定量糖蛋白上N-連唾液酸化糖鏈占有率的方法及其 在肝癌標志物篩選中的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白質組學研究方向糖基化蛋白質組學技術領域，具體設及基于酷阱 化學的差異氧化和標記法高通量定量糖蛋白上N-連唾液酸化糖鏈占有率的方法及其在肝 癌標志物篩選中的應用。
【背景技術】
[0002] 蛋白質糖基化作為一種最普遍且最重要的翻譯后修飾，在蛋白質折疊、構象穩(wěn)定 和活性等方面起著重要的作用。糖基化蛋白質（簡稱糖蛋白）參與了細胞與細胞、細胞與細 胞外基質的分子識別、細胞調亡、蛋白質相互作用、免疫應答等生命過程。因此，糖蛋白的異 常變化往往伴隨著許多疾病的發(fā)生和發(fā)展。也就是說，某一疾病中異常的糖蛋白可W作為 該疾病的標志物。目前，臨床上所用的疾病標志物大多是糖基化蛋白質，如甲胎蛋白（AFP) 是肝癌的標志蛋白，癌癥抗原125 (cancer antigen 125)是惡性腫瘤的標志物，W及前列腺 癌的特異抗原等等。因此，對于糖蛋白的深入研究具有非常重要的意義。
[0003] 糖蛋白上N-連唾液酸化糖鏈是一種常見且非常重要的聚糖，唾液酸位于糖鏈的 末端。在細胞中，唾液酸化糖鏈有著諸多重要的生物學功能，包括細胞分子間相互作用， 細胞特征的形成，W及細胞代謝等等。對于運類糖基化蛋白的研究表明，糖蛋白的唾液酸 化的異常與很多癌癥如乳腺癌，結腸癌，白血病，膜腺癌等密切相關，因此，蛋白質組學專 家們對于運類糖蛋白的關注度越來越高。目前已有多種糖蛋白質組學的方法用于唾液 酸化糖蛋白的定性和定量，包括特異的凝集素方法（文獻1. Kubota, K. et al. Analysis of glycopeptides using lectin affinity chromatography with MLDI-TOF mass spectrometry. Analytical chemistry 80,3693-3698,doi:10. 1021/ac800070d(2008).)， 二氧化鏡（文獻 2. Larsen, M.民.，Jensen, S. S.，Jakobsen, L. A. &Heegaard, N. H. Exploring the sialiome using titanium dioxide chromatography and mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics 6, 1778-1787, doi:10. 1074/mcp. M700086-MCP200 (2007)?)和 鑰；（IV)金屬離子親和色譜法（文獻 3. Zhu，J.et al. A simple integrated system for rapid analysis of sialic-acid-containing N-gIycopeptides from human serum.Proteomics 13, 1306-1313, doi: 10. 1002/pmic. 201200367(2013).)，W 及改進 的醜阱化學方法（文獻 4. Zeng, Y.，Ramya, T. N.，Dirksen, A.，Dawson, P. E. &Paulson, J. C. High-efficiency labeling of sialylated glycoproteins on living cells. Nature methods 6,207-209,doi:10. 1038/nmeth. 1305(2009)?文獻 5.Nilsson, J. et al. Enrichment of glycopeptides for glycan structure and attachment site identification. Nature methods 6, 809-811，doi:10. 1038/nmeth. 1392 (2009)?文 南犬 6. Tian, Y.，Esteva, F. J.，Song, J. feZhang, H. Altered expression of sialylated glycoproteins in breast cancer using hydrazide chemistry and mass spectrometry. Mol. Cell?化oteomics，doi : 10. 1074/mcp. Mill. 011403 (2012) ?) D 改進的醜阱化學方法是 指用低濃度的高艦酸鋼溶液在低溫下和短時間內去選擇性氧化唾液酸化的糖蛋白或糖膚， 從而實現(xiàn)對其富集和分析。運些已報道的方法直接比較了疾病樣品和正常樣品間同一個糖 基化位點上唾液酸化的不同，而對于同一種狀態(tài)的樣品中的糖蛋白上的唾液酸化糖鏈的占 有率沒有研究。
[0004] 唾液酸化糖鏈的占有率可定義為一個蛋白質上同一個糖基化位點上唾液酸化糖 鏈占所有糖鏈的摩爾比。研究表明，糖鏈的末端唾液酸可W被低濃度的高艦酸鋼溶液選擇 性氧化，而所有種類的糖鏈可W被高濃度的高艦酸鋼溶液氧化。本發(fā)明首次利用不同濃度 的高艦酸鋼溶液差異氧化同一個生物樣品中的糖蛋白，發(fā)展了一種蛋白層次上高通量定量 糖蛋白上N-連唾液酸化糖鏈占有率的方法。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種可W簡便、準確、高通量定量復雜生物樣品中糖蛋白 上N-連唾液酸化糖鏈占有率的方法。首先取同一種狀態(tài)下含糖蛋白的生物樣品等量兩份， 然后用高艦酸鋼溶液對其分別處理W進行差異氧化，之后利用蛋白層次上的酷阱化學法富 集差異氧化后的樣品中的糖蛋白，再利用不同穩(wěn)定同位素差異標記酷阱微球上的糖膚，然 后用膚糖巧酶PNGase F處理，最后對混合差異標記的N-糖膚進行質譜分析，W定量N-連 唾液酸化糖鏈的占有率。
[0006] 具體包含W下步驟，
[0007] 1)取同一種狀態(tài)下含糖蛋白的生物樣品等量兩份，分別溶解在含6-8M化ea和 50-lOOmM NH4HCO3的緩沖溶液中，沸水加熱失活5-lOmin，用蛋白除鹽柱除去其中的小分子， 全蛋白在緩沖溶液中的濃度為2-lOmg/mL ;
[0008] 2)步驟1)結束后得到的兩份經過處理的樣品，一份用濃度為0. 5-lmM的高艦酸鋼 溶液氧化，另一份用濃度為IO-ISmM的高艦酸鋼溶液氧化，氧化之后的兩個樣品各W蛋白 除鹽柱置換為含濃度為SO-IOOmM NaAC和130-150mM的化Cl的緩沖溶液，向兩個溶液中各 加入預先W此緩沖溶液洗離過2~3次的酷阱微球，室溫震蕩富集10-1化，酷阱微球自身所 占的體積與步驟2)所置換的緩沖溶液的體積比為1:5 ;
[0009] 扣步驟。結束后得到的酷阱微球用濃度為50-lOOmM的畑4肥〇3溶液洗離2~3 次W除去非糖蛋白，然后各分散在含濃度為6-8M的化ea和濃度為50-lOOmM的畑4肥〇3的 緩沖液中，用終濃度為10-20mM的孤T和濃度為20-40mM的IAA各依次處理后，再依次W 80-90% ACN(ACN和&0的體積比），50-lOOmM畑4肥〇3溶液各洗離2~3次，最后均分散在 50-lOOmM畑4肥〇3緩沖液中，酷阱微球自身所占的體積與加入的50-lOOmM畑4肥〇3緩沖液 的體積比為1:5,再各加入膜蛋白酶酶解12-1化，加入的膜蛋白酶的用量與步驟1)所取的 樣品中蛋白質的質量比為1:25;
[0010] 4)步驟3)得到的微球各依次W 1. 0-1. 5M化Cl溶液，80-90 % ACN (ACN和&0的體 積比），50-lOOmM NH4HCO3溶液和水洗去非特異性吸附和非糖膚，并分別分散在200-400 iiL SO-IOOmM TEAB 中，分別取 8-16 y L 4-8wt % CD20/CH20(CD20 和邸2〇 都是 4 % -8 % )和 0. 6-1. 2M NaBHsCN各依次加入到兩種樣品中，室溫反應3-4h W實現(xiàn)糖膚的二甲基重/輕標 記，4-8 % 〇2〇/邸2〇與微球自身體積比為2:25-4:25,0. 6-1. 2M NaBHsCN與微球自身的體積 比為 2:25-4:25 ;
[0011] 5)在用水洗離步驟4)得到的酷阱微球2~3次后，各加入含500-100(KJnites PNGase F的10-20mM畑4肥〇3緩沖液震蕩酶切10-1化，將二甲基標記的N-糖膚酶切 下來，將對應的輕標和重標的樣品W等體積混合，所得的樣品W MLDI-T0F/T0F mass spectrometer或LC-MS/MS分析，W定量N-連唾液酸化糖鏈的占有率；其中加入的含 PNGase F的緩沖溶液的體積與酷阱微球自身所占體積的比例為2:1-4:1。
[0012] 其中，步驟1)所述的除去的小分子為尿素、碳酸氨錠W及樣品中其他分子量小于 7000Da的分子；步驟4)所述的IOOmM TEAB的抑為7. 5-8. 0。
[0013] 本發(fā)明所述的定量糖蛋白上N-連唾液酸化糖鏈占有率的方法可W用于糖基化修 飾的蛋白質組學分析，能同時獲取相應的糖蛋白、糖膚和糖基化位點的鑒定結果，尤其可W 用于人肝癌（HCC)的潛在生物標志物的篩選。
[0014] 所述的基于酷阱化學的差異氧化和標記法用于高通量定量糖蛋白上N-連唾液酸 化糖鏈的占有率，所用的糖蛋白富集材料為商品化的瓊脂糖酷阱微球度io-Rad，CA, USA)。
[0015] 所述的基于酷阱化學的差異氧化和標記法用于高通量定量糖蛋白上N-連唾液酸 化糖鏈的占有率，所用的定量方法為相對定量法。即用CDzO標記0. 5-lmM高艦酸鋼溶液氧 化后富集的糖膚，用CHzO標記IO-ISmM高艦酸鋼溶液氧化后富集的糖膚，兩者等摩爾量混 合后進行質譜分析。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0017] 本發(fā)明所述方法具有明顯的優(yōu)點：簡便，高效，高通量?？嶷寤瘜W法富集糖膚已在 糖蛋白質組學分析中廣泛應用，它具有材料易得，操作簡便，富集特異性高，高效等優(yōu)點。本 發(fā)明的實驗流程是在蛋白層次上運用酷阱化學法，使得一個樣品的整個操作流程可W在一 個樣品管中完成，大大簡化了操作，節(jié)省了時間。本發(fā)明首次利用酷阱化學法中不同濃度的 高艦酸鋼溶液差異氧化同一個糖蛋白上的末端是唾液酸的糖鏈和全部類型的糖鏈，再利用 輕重同位素標記和高分辨率的RPLC-MS/MS分析，從而實現(xiàn)對分析樣品中N-連唾液酸糖鏈 占有率的高效、高通量定量。
【附圖說明】
[0018] 下面結合附圖及實施方式對本發(fā)明作進一步詳細的說明：
[0019] 圖1為所述基于酷阱化學的差異氧化和標記法高通量定量糖蛋白上N-連唾液酸 化糖鏈占有率的實驗流程圖。
[0020] 圖2A為所述基于酷阱化學的差異氧化和標記法用于特異性富集、定量標準糖蛋 白一人血清轉鐵蛋白（Transferrin from human blood plasma, HT)上N-連唾液酸化糖 鏈占有率的MLDT-TOF質譜圖；圖2B為所述基于酷阱化學的差異氧化和標記法用于特異 性富集、定量標準糖蛋白一部分去唾液酸化的人血清轉鐵蛋白（Asialo transferrin化om human blood plasma, AHT)上N-連唾液酸化糖鏈占有率的MALDT-TOF質譜圖。
[0021] 圖3A為所述基于酷阱化學的差異氧化和標記法定量到的人肝癌組織（肥C)和正 常肝組織（Normal)中糖蛋白上N-連唾液酸化糖鏈占有率的Lo拓值的分布圖；圖3B為所 述基于酷阱化學的差異氧化和標記法定量到的人肝癌組織（肥C)和正常肝組織（Normal) 中同時存在的糖蛋白上N-連糖基化位點數(shù)圖。
[0022] 圖4為所述基于酷阱化學的差異氧化和標記法定量到的人肝癌組織（肥C)和正常 肝組織（Normal)中同時存在的糖蛋白上N-連唾液酸化糖鏈的占有率的比值的Log2值的 分布圖。
【具體實施方式】 陽〇2引材料與試劑： |；0024]人血清轉鐵蛋白（Transferrin from human blood plasma, HT)，高艦 酸鋼（sodium periodate)，二硫蘇糖醇（I, 4-dithiot虹eitol, DTT)，艦代乙酷胺 (iodacetamide, IAA)，膜蛋白酶（t;rypsin)，2, 5-二徑基苯甲酸化 5-dihy化〇巧1 benzoic acid, D皿）和S乙基碳酸氨錠（triethylammonium bicarbonate buffer, TEAB)緩沖液均 購自 Sigma 公司（]X,U.S.A.)。蛋白除鹽柱狂eba Spin desalting columns)購自 Thermo Scientific 公司（]X,U.S. A.)。瓊脂糖酷阱微球（hy 化azide Se地arose resin)購自 Bio-Rad 公司（CA, U. S. A.)。膚糖巧酶（P巧tide-N-glycosidase F, PNGase 巧和去唾液 酸酶（Neuraminidase)購自化W !England Biol油S公司（MA, U. S. A.)。實驗用水經購自 Millipore公司（MA，U.S.A.)的Milli-Q水處理系統(tǒng)純化。其他試劑均為分析純或更高純 度。 陽O巧]實施例1定量標準糖蛋白上N-連唾液酸化糖鏈的占有率 [00%] 人血清轉鐵蛋白（HT)是一種簡單易得的糖蛋白，它的兩個N-糖基化位點上的糖 鏈末端均是唾液酸（文獻 7. Satomi, Y.,化imonishi, Y. , Hase, T. &Takao, T. Site-specific C曰rbohydr曰te profiling of human transferrin by nano-flow liquid chromatography/ electrospray ionization mass spectrometry. Rapid communications in mass spectro metry:RCM18, 2983-2988, doi: 10. 1002/rcm. 1718(2004).)。末端唾液酸可W被去唾液酸酶 部分去除，得到去唾液酸化的轉鐵蛋白（AHT)(文獻6)。利用本發(fā)明所述的方法定量運兩 種標準糖蛋白上N-連唾液酸化糖鏈占有率的實驗流程如圖1所示。
[0027] 1.兩種標準糖蛋白各取兩份Img，分別溶解在IOOyL含8M化ea和IOOmM畑4肥化 的緩沖液中（pH 8. 2)，在沸水中加熱失活IOmin后，用蛋白除鹽柱除去小分子。接下來的實 驗是對四個樣品分別、平行進行操作。
[0028] 2. HT和AHT各一份用ImM高艦酸鋼氧化，另一份用IOmM高艦酸鋼氧化。四個樣品 各W蛋白除鹽柱置換為含IOOmM NaAc和150mM化Cl的緩沖溶液（pH 5. W后，各加入預先 W此緩沖溶液洗離過兩次的100 y L酷阱微球（微球自身所占體積），室溫震蕩富集過夜。
[0029] 3.酷阱微球用500 y L IOOmM畑4肥〇3 (抑8.。洗離立次W除去非糖蛋白，然后各 分散在500 y L含8M Urea和IOOmM畑4肥〇3的緩沖液中（pH 8. 2)。用終濃度為IOmM DTT 和20mM IAA處理后，再依次W 500 y L 80% ACN，IOOmM畑4肥〇3各洗離立次，最后均分散在 SOOiiL IOOmM畑4肥〇3中，各加入40 yg膜蛋白酶酶解過夜。
[0030] 4.依次W 500 y L 1. 5M化Cl, 80% ACN, IOOmM畑4肥〇3溶液和水洗去非特異性吸 附和非糖膚，并分別分散在400 y L IOOmM TEAB (pH 8.0)中。分別取16 y L 4% CD2O/CH2O 和16 ii L 0. 6M NaBHsCN依次加入ImM/lOmM高艦酸鋼氧化的樣品中，室溫反應Sh W實現(xiàn)二 甲基重/輕標記。 陽03U 5.在用水洗離酷阱微球立次后，各加入200 y L含SOOUnites PNGase F的IOmM 畑4肥〇3緩沖液震蕩酶切過夜，將二甲基標記的N-糖膚酶切下來。將HT和AHT對應的輕標 和重標的樣品各自W等體積混合，所得的兩個樣品，即HT-10mM_L-and-lmM_H和AHT-10mM_ kand-lmM_H。分別 W MALDI-TOF/TOF mass spectrometer 分析。 陽0巧分析結果： 陽03引如圖2A和2B所示，HT中輕重標記的糖膚W相近峰強度被檢出，而AHT中兩個N-連 糖基化位點對應的重標標記的糖膚的峰強度明顯低于輕標標記的糖膚的峰強度。圖2A說 明HT的兩個糖基化位點上N-連唾液酸化糖鏈的占有率接近100 %，運與文獻報道的一致 (文獻7)。圖2B說明N-連唾液酸化糖鏈去唾液酸后，其對應的糖膚的峰強度也隨之降低。 因此，兩種糖蛋白的對應的糖基化位點上N-連唾液酸化糖鏈的占有率可W由重標糖膚的 峰強度比上輕標糖膚的峰強度計算得到（H/L),如表1所示。顯然，本發(fā)明設計的方法可W 簡便、高效的定量糖蛋白上N-連唾液酸化糖鏈的占有率。
[0034] 表1.所述基于酷阱化學的差異氧化和標記法定量到的HT和AHT上N-連唾液酸 化糖鏈的占有率
[0035]
[0036] 實施例2
[0037] 我們將此方法用于分別定量肝癌病人的肝組織和正常人的肝組織中糖蛋白上 N-連唾液酸化糖鏈的占有率，并比較兩種狀態(tài)下糖蛋白上N-連唾液酸化糖鏈的占有率的 變化，從而發(fā)現(xiàn)人肝癌中潛在的生物標志物。
[0038] 本實驗所用的人肝組織樣品由大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院（大連，中國）提供，是 肝細胞癌（肥C)肝臟外周2cm)的非癌癥組織。正常組織部分（Normal)做過病理切 片，樣品的取得和使用完全合法，并符合該院倫理委員會的相關規(guī)定。從肝組織中提取的蛋 白質溶液的處理流程與標準蛋白一樣，如圖1所示。最終，W在兩次及兩次W上質譜重復中 均定量到為標準，從肝癌組織中共定量到334個糖蛋白上496個位點特異性的N-連唾液酸 化糖鏈的占有率；從正常肝組織中共定量到394個糖蛋白上632個位點特異性的N-連唾 液酸化糖鏈的占有率。兩種樣品的N-連唾液酸化糖鏈占有率的Logz值的分布如圖3A所 示。可W看出，正常肝組織中N-連唾液酸化糖鏈的占有率在總體上較癌組織中更高。可W 推測，兩種樣品中某些特定的糖蛋白上的N-連唾液酸化糖鏈的占有率發(fā)生了顯著變化。如 圖3B所示，有284個N-連糖基化位點同時存在于兩個樣品中。我們計算了運284個位點 上N-連唾液酸化糖鏈占有率的比值，圖4給出了運個比值的Logz值的分布。發(fā)現(xiàn)兩個樣 品中共同的76個N-糖基化位點上的唾液酸化糖鏈的占有率有顯著差異，其中37個糖蛋白 上的40個N-連唾液酸化糖鏈的占有率顯著下調，31個糖蛋白上的36個N-連唾液酸化糖 鏈的占有率顯著上調。運些糖蛋白可W用來進一步篩選人肝癌的標志物。
[0039] 結論
[0040] 顯然，本發(fā)明發(fā)展的方法可W簡便、高效、高通量的定量復雜生物樣品中糖蛋白上 N-連唾液酸化糖鏈的占有率，為篩選疾病標志物提供了一種不受蛋白質豐度影響的新思 路，在疾病標志物的研究中將起到重要作用。
【主權項】
1. 一種定量糖蛋白上N-連唾液酸化糖鏈占有率的方法，其特征在于：首先取同一種狀 態(tài)下含糖蛋白的生物樣品等量兩份，然后用高碘酸鈉溶液對其分別處理以進行差異氧化， 之后利用蛋白層次上的酰肼化學法富集差異氧化后的樣品中的糖蛋白，再利用不同穩(wěn)定同 位素差異標記酰肼微球上的糖肽，然后用肽糖苷酶PNGase F處理，最后對混合差異標記的 N-糖肽進行質譜分析，以定量N-連唾液酸化糖鏈的占有率。2. 根據(jù)權利要求1所述的定量糖蛋白上N-連唾液酸化糖鏈占有率的方法，其特征在 于：具體包含以下步驟， 1) 取同一種狀態(tài)下含糖蛋白的生物樣品等量兩份，分別溶解在含6-8M Urea和 50-100mM NH4HC03的緩沖溶液中，沸水加熱失活5-10min，用蛋白除鹽柱除去其中的小分子， 全蛋白在緩沖溶液中的濃度為2-10mg/mL ; 2) 步驟1)結束后得到的兩份經過處理的樣品，一份用濃度為0. 5-lmM的高碘酸鈉溶液 氧化，另一份用濃度為10-15mM的高碘酸鈉溶液氧化，氧化之后的兩個樣品各以蛋白除鹽 柱置換為含濃度為80-100mM NaAC和130-150mM的NaCl的緩沖溶液，向兩個溶液中各加入 預先以此緩沖溶液洗離過2~3次的酰肼微球，室溫震蕩富集10-12h，酰肼微球自身所占的 體積與步驟2)所置換的緩沖溶液的體積比為1:5 ; 3) 步驟2)結束后得到的酰肼微球用濃度為50-100mM的順4!10)3溶液洗離2~3次以 除去非糖蛋白，然后各分散在含濃度為6-8M的Urea和濃度為50-100mM的順 4!10)3的緩沖液 中，用終濃度為10_20mM的DDT和濃度為20-40mM的IAA各依次處理后，再依次以80-90 % ACN(AC_P H20的體積比），50-100mM NH4HC03溶液各洗離2~3次，最后均分散在50-100mM NH4HC0 3中，酰肼微球自身所占的體積與加入的50-100mM NH4HC03緩沖液的體積比為1:5,再 各加入胰蛋白酶酶解12-16h，加入的胰蛋白酶的用量與步驟1)所取的樣品中蛋白質的質 量比為1:25 ; 4) 步驟3)得到的微球各依次以1. 0-1. 5M NaCl溶液，80-90% ACN(ACN和H20的體積 比），50-100mM順4!10)3溶液和水洗去非特異性吸附和非糖肽，并分別分散在200-400 μ L 50-100mM ΤΕΑΒ 中，分別取 8-16 μ L 4-8wt % CD20/CH20(CD20 和 CH20 都是 4 % -8 % )和 0. 6-1. 2M NaBH3CN各依次加入到兩種樣品中，室溫反應3-4h以實現(xiàn)糖肽的二甲基重/輕標 記，4-8 % D20/CH20與微球自身體積比為2:25-4:25,0. 6-1. 2M NaBH3CN與微球自身的體積 比為 2:25-4:25 ; 5) 在用水洗離步驟4)得到的酰肼微球2~3次后，各加入含500-1000Unites PNGase F的10-20mM NH4HC0#1沖液震蕩酶切10-12h，將二甲基標記的N-糖肽酶切下來，將對應 的輕標和重標的樣品以等體積混合，所得的樣品，以MALDI-TOF/TOF mass spectrometer或 LC-MS/MS分析，以定量N-連唾液酸化糖鏈的占有率；其中加入的含PNGase F的緩沖溶液 的體積與酰肼微球自身所占體積的比例為2:1-4:1。3. 根據(jù)權利要求2所述的定量糖蛋白上N-連唾液酸化糖鏈占有率的方法，其特征在 于：步驟1)所述的除去的小分子為尿素、碳酸氫銨以及樣品中其他分子量小于7000Da的分 子。4. 根據(jù)權利要求2所述的定量糖蛋白上N-連唾液酸化糖鏈的占有率的方法，其特征在 于：步驟4)所述的lOOmM TEAB的pH為L 5-8. 0。5. -種權利要求1所述的定量糖蛋白上N-連唾液酸化糖鏈占有率的方法的應用，其特 征在于：該方法可以用于糖基化修飾的蛋白質組學分析，能同時獲取相應的糖蛋白、糖肽和 糖基化位點的鑒定結果。6.根據(jù)權利要求5所述的定量糖蛋白上N-連唾液酸化糖鏈占有率的方法的應用，其特 征在于：該方法尤其可以用于人肝癌（HCC)的潛在生物標志物的篩選。
【文檔編號】G01N27/62GK105987945SQ201510060851
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月5日
【發(fā)明人】鄒漢法, 張章, 葉明亮
【申請人】中國科學院大連化學物理研究所