影響精子功能的唾液酸酶檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種影響精子功能的唾液酸酶檢測方法。該方法是一種新的評估精子質(zhì)量與功能的實驗室檢測方法，可為臨床原因不明的男性不育患者提供檢測及臨床咨詢。其特征在于：第一步，通過單精子熒光強度分析直觀的量化唾液酸酶在精子中的表達，或者利用顯微鏡下熒光成像直觀的觀察唾液酸酶在精子中的表達；若唾液酸酶在精子中高表達，則進行第二步，利用體外獲能液使精子獲能，并用熒光法檢測唾液酸酶活性。
【專利說明】影響精子功能的唾液酸酶檢測方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)療檢測【技術(shù)領域】，具體涉及一種影響精子功能的唾液酸酶檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著社會工業(yè)的不斷發(fā)展，不育夫婦的總發(fā)病率明顯升高。2004年歐洲生殖學會統(tǒng)計:育齡夫婦I年內(nèi)不能懷孕者占25%，其中15%尋求治療，男方因素引起不育占50%。男性不育的病因有性功能障礙(1.7% )，精索靜脈曲張(12.3% )，生殖道感染(6.6%)，先天性發(fā)育異常(2.1%)后天獲得性疾病(2.6% )，內(nèi)分泌紊亂(0.6%)，免疫性因素(3.1%)，其他異常(3%)，但是高達609^75%的患者找不到原因，稱為特發(fā)性男性不育，他們只表現(xiàn)為少精、弱精或畸形精子癥等精子質(zhì)量異常。不明原因的男性不育可能由于多種因素造成，如長期應激環(huán)境因素引起內(nèi)分泌紊亂、活性氧和基因缺陷等。
[0003]多年來，傳統(tǒng)的精液常規(guī)分析一直是用于判斷男性生育力的最基本臨床指標。臨床上對絕大部分的男性不育患者的真正不育原因仍然不清楚。尤其是臨床上大約有三分之一不育患者，男性的常規(guī)精液分析結(jié)果均正常和接近正常。臨床上把這類患者劃為不明原因不育癥。因此，長期以來，臨床對男性不育的診斷存在很大的困難。最主要的原因是常規(guī)精液分析只測定精子的數(shù)量，存活力，活動率和形態(tài)。這些指標只能反映最基本的精液質(zhì)量，不能反映所有的精子功能，比如，精子核的成熟和DNA損傷，精子與人卵透明帶結(jié)合反應與穿透，頂體狀況和反應及與卵黃膜結(jié)合能力等。因此，需要建立特殊的精子功能試驗才能測定以上這些功能。精子獲能是精卵結(jié)合形成受精卵的必要條件，雖然精子獲能的相關(guān)研究已有一些進展，但仍然存在很多尚未闡明的問題。
[0004]臨床工作中，一部分原發(fā)或繼發(fā)的不育男性病人利用現(xiàn)有的常規(guī)精液質(zhì)量檢查項目提示精子及精液質(zhì)量無異常。目前常用的精子檢測手段為CASA(計算機輔助精子分析Computer aided of semen analysis),以及抗精子抗體等。當今最為廣泛使用的CASA技術(shù)和一些形態(tài)學的相關(guān)檢測，主要能評價精子的活動能力和活精子比率，從而推測其進入女性生殖道的受精能力，而依賴目前的精子功能評價體系，對精子質(zhì)量及功能的評價存在一定的缺陷，以及難于給病人提供相應的臨床咨詢`。事實上，這僅僅是評價精子功能的一個方面，我們應該考慮到可能還有影響精子生殖能力的更多沒有被揭示的因素。
[0005]如文獻“哺乳類動物精子自身的唾液酸酶參與獲能過程中的唾液酸脫落，，(Sialidases on mammalian sperm mediate deciduous sialylationduring capacitation,〈〈The Journal of Biological Chemistry)), 2012 Nov2; 287 (45): 38073-9)，首次報道了精子膜上的唾液酸酶(NEU1/3)是影響精子生殖能力的新因素。唾液酸(sialic acid)在小鼠及人的體外獲能過程中以單個糖分子的方式從精子的細胞膜上脫落，而與此同時，精子膜上的唾液酸酶(NEU1/3)可能由于精子膜的流動性而脫落參與剪切致單個唾液酸分子脫落，文獻證實了抑制NEU3的活性會降低精子的獲能過程中磷酸化ErK的表達，以及少量不明原因性不育的病人精子這兩種酶的低表達。[0006]文獻雖然提出了唾液酸酶可用于評價精子功能，并公開了小鼠和少量人冰凍精子中唾液酸酶的檢測方法。但文獻只公開了唾液酸酶在精子中的表達檢測，并沒有對唾液酸酶的活性檢測作進一步報道；并且，所公開的表達檢測方法無法順利檢測出新鮮精子中的唾液酸酶，還不能適用于臨床應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明為了解決上述技術(shù)問題，提出了一種影響精子功能的唾液酸酶檢測方法。該方法是一種新的評估精子質(zhì)量與功能的實驗室檢測方法，可為臨床原因不明的男性不育患者提供檢測及臨床咨詢。
為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案:
影響精子功能的唾液酸酶檢測方法，其特征在于:第一步，通過單精子熒光強度分析直觀的量化唾液酸酶在精子中的表達，或者利用顯微鏡下熒光成像直觀的觀察唾液酸酶在精子中的表達；若唾液酸酶在精子中聞表達，則進行第_ 步，利用體外獲能液使精子獲能，并用熒光法檢測唾液酸酶活性。
[0008]所述的體外獲能液為HSA (人血清白蛋白)5mg/ml HTF (人輸卵管液)。
[0009]所述的第一步，按照下述步驟，分別進行精子唾液酸酶NEUl和NEU3的表達檢測: A收集新鮮液化精液標本，低速離心分離出精子，PBS (磷酸緩沖液)洗滌精子，充分除
去殘留的精漿成分；
B計數(shù)精子數(shù)量，冰上置2(T30 min，用于制動精子，便于后續(xù)的操作；` C采用0.1%的Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)對精子進行預處理，PBS洗滌精子后，用3%的PFA (多聚甲醛)再次對精子進行預處理；
D當檢測NEUl時，采用1%的BSA (牛血清白蛋白)-PBS溶液進行封閉；或者，當檢測NEU3時，采用甲醇固定；
E采用lug/ul的抗人NEUl抗體孵育廣3 h，充分保證抗原-抗體結(jié)合時間，PBS洗滌精子；
F在常溫下，精子在1:1000的常規(guī)熒光二抗中孵育廣2 h ；
G采用流式細胞儀檢測或熒光顯微鏡制作精子的細胞涂片，觀察唾液酸酶在精子中的表達。
[0010]所述的第二步，具體操作步驟如下:
A新鮮液化精液標本收集，低速離心分離精子，保持精子完整性與活力；
B采用上游法，在5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)精子，收獲上游精子，進一步獲取活力優(yōu)良的精子，采用Bffff (Biggers, Whitten, and Whittinghamreedit)培養(yǎng)液洗漆精子，充分去除精漿中殘留的蛋白等成分，避免增加非特異性熒光背景和去除一些“去獲能因子”。
[0011]由于精子死后會釋放唾液酸酶，干擾實驗增加非特異性表達，采用上游法可保證活力良好的精子獲能，避免死精子。
[0012]C計數(shù)精子數(shù)量，用體外獲能液HAS 5mg/ml HTF,在5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育精子3-4 h ；
D先將經(jīng)上述操作得到的溶液離心分離，收取的上清液再次離心分離，收取上清液，充分去除精子等有形成分，避免增加非特異性熒光背景； E立即將獲能后的上清液用熒光法檢測唾液酸酶活性。
[0013]所述第一、二步的A步驟，以500飛00 g/min的速度低速離心5?6min,以保證精子形態(tài)完整，與精漿分離。
[0014]所述第二步的B步驟，采用上游法于36?37 1:下，在5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10?30min。
[0015]所述第二步的C步驟，計數(shù)精子數(shù)量，調(diào)整為IXlOVml以上，既保證足夠的接近生理的體外獲能環(huán)境，又使其唾液酸酶活性能夠被檢測；
所述第二步的C步驟，用體外獲能液HAS 5mg/ml HTF于36?37 °C下，5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育:T4 h，反應體積10(T200ul。
[0016]因為精子的酶活性相對細菌非常低，所以為了保證的靈敏度，必須控制反應體積為10(T200ul，既保證獲能又保證酶的可測的濃度。
[0017]所述第二步的D步驟，先以500?600 g/min的速度低速離心5?6min,再以500(T6000g/min的速度低速離心10?15min,充分去除精子等有形成分。
[0018]本發(fā)明的有益效果在于:
1、本發(fā)明提供了一種影響精子功能的唾液酸酶檢測方法，是新的評估精子質(zhì)量與功能的實驗室檢測方法，對患者無創(chuàng)，為原發(fā)性不育患者提供更多的檢測指標和臨床解釋。
[0019]2、本發(fā)明使用熒光法來檢測和評估精子中的唾液酸酶，由于從精子上脫落的唾液酸酶在獲能過程中參與了精子表面的唾液酸剪切，因為檢測唾液酸酶的活性理論依據(jù)是用唾液酸酶去剪切帶熒光的唾液酸復合物，如有活性，帶熒光基團分離能產(chǎn)生熒光，所以能檢測和評估其活性。因此，本方法是精子的唾液酸酶活性需要的高靈敏度檢測法。
[0020]3、本發(fā)明在檢測唾液酸酶在精子中的表達時，將精子在冰上置2(T30 min，用于制動精子，使新鮮的液化精子活動靜止，便于后續(xù)的操作。
[0021]4、本發(fā)明在檢測唾液酸酶活性時，采用上游法來獲取活力優(yōu)良的精子，由于精子死后會釋放唾液酸酶，干擾實驗增加非特異性表達，上游法可保證活力良好的精子獲能，避免死精子；同時，采用Bffff培養(yǎng)液洗滌精子，充分去除精漿中殘留的蛋白等成分，避免增加非特異性熒光背景和去除一些“去獲能因子”，保證了實驗的準確性。
[0022]5、本發(fā)明在檢測唾液酸酶活性時，采取兩次離心分離的方法，充分去除精子等有形成分，避免增加非特異性熒光背景。并且，本發(fā)明嚴格控制離心速度，先以500飛00 g/min的速度低速離心5?6min,再以5000?6000g/min的速度低速離心10?15min,進一步充分去除精子等有形成分，避免為檢測帶來干擾。
[0023]6、本發(fā)明在米集精子時，以500?600 g/min的速度低速離心5飛min,以保證精子
形態(tài)完整，與精漿分離完全。
[0024]7、本發(fā)明在檢測唾液酸酶活性時，計數(shù)精子數(shù)量，調(diào)整為IXlOVml以上，既保證足夠的接近生理的體外獲能環(huán)境，又使其唾液酸酶活性能夠被檢測。
[0025]8、本發(fā)明在檢測唾液酸酶活性時，用體外獲能液HAS 5mg/ml HTF于36?37 °C下，5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育:T4 h，控制反應體積為10(T200ul。因為精子的酶活性相對細菌非常低，所以為了保證的靈敏度，必須控制反應體積，既保證獲能又保證酶的可測的濃度?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0026]圖1為唾液酸酶(NEU1/3)在不明原因性男性不育患者的表達。
【具體實施方式】
[0027]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容作進一步詳細的描述。
[0028]實施例1
影響精子功能的唾液酸酶檢測方法，其特征在于:第一步，通過單精子熒光強度分析直觀的量化唾液酸酶在精子中的表達，或者利用顯微鏡下熒光成像直觀的觀察唾液酸酶在精子中的表達；若唾液酸酶在精子中聞表達，則進行第_步，利用體外獲能液使精子獲能，并用熒光法檢測唾液酸酶活性。
[0029]實施例2
影響精子功能的唾液酸酶檢測方法，其特征在于:第一步，通過單精子熒光強度分析直觀的量化唾液酸酶在精子中的表達，或者利用顯微鏡下熒光成像直觀的觀察唾液酸酶在精子中的表達；若唾液酸酶在精子中聞表達，則進行第_步，利用體外獲能液使精子獲能，并用熒光法檢測唾液酸酶活性。
[0030]所述的體外獲能液為HSA 5mg/ml HTF。
[0031]實施例3
本實施例的實施方式與實施例1基本相同，在此基礎上:
按照下述步驟，進行精子唾液酸酶NEUl的表達檢測:
A收集新鮮液化精液標本，離心分離出精子，PBS洗滌精子2次；
B計數(shù)精子數(shù)量，冰上置20 min；
C采用0.1%的Triton X-100對精子進行預處理，PBS洗滌精子2次，用3%的PFA再次對精子進行預處理；
D采用1%的BSA-PBS溶液進行封閉；
E采用lug/ul的抗人NEUl抗體孵育I h，PBS洗滌精子2次；
F在常溫下，精子在1:1000的常規(guī)熒光二抗中孵育I h ；
G采用流式細胞儀檢測或熒光顯微鏡制作精子的細胞涂片，觀察唾液酸酶在精子中的表達。
[0032]實施例4
本實施例的實施方式與實施例1基本相同，在此基礎上:
按照下述步驟，進行精子唾液酸酶NEU3的表達檢測:
A收集新鮮液化精液標本，離心分離出精子，PBS洗滌精子2次；
B計數(shù)精子數(shù)量，冰上置30 min；
C采用0.1%的Triton X-100對精子進行預處理，PBS洗滌精子2次，用3%的PFA再次對精子進行預處理；
D采用甲醇固定；
E采用lug/ul的抗人NEUl抗體孵育3 h，PBS洗滌精子2次；
F在常溫下，精子在1:1000的常規(guī)熒光二抗中孵育2 h ；
G采用流式細胞儀檢測或熒光顯微鏡制作精子的細胞涂片，觀察唾液酸酶在精子中的表達。
[0033]實施例5
本實施例的實施方式與實施例1基本相同，在此基礎上:
按照下述步驟，檢測唾液酸酶活性:
A收集新鮮液化精液標本，離心分離精子；
B采用上游法，在5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)精子，收獲上游精子，采用Bffff培養(yǎng)液洗滌精子。
[0034]C計數(shù)精子數(shù)量，用體外獲能液HSA 5mg/ml HTF,在5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育精子3h ；
D先將經(jīng)上述操作得到的溶液離心分離，收取的上清液再次離心分離，收取上清液；
E立即將獲能后的上清液用熒光法檢測唾液酸酶活性。
[0035]實施例6
本實施例的實施方式與實施例1基本相同，在此基礎上:
按照下述步驟，檢測唾液酸酶活性:
A收集新鮮液化精液標本，離心分離精子；
B采用上游法于36 1:下，在5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 min,收獲上游精子，采用Bffff培養(yǎng)液洗滌精子3次。
[0036]C計數(shù)精子數(shù)量，用體外獲能液HSA 5mg/ml HTF,在5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育精子4 h ;
D先將經(jīng)上述操作得到的溶液離心分離，收取的上清液再次離心分離，收取上清液；
E立即將獲能后的上清液用熒光藍法檢測唾液酸酶活性。
[0037]使用ABCAM的唾液酸酶檢測試劑盒(Fluorometric - Blue) (abl38888),檢測獲能上清液中的唾液酸酶活性。
[0038]采用Ex/Em =?320廠450 nm的熒光酶標儀檢測，按陽性對照標準曲線，計算唾液酸活性，單位為:uUAUS /I X IO6精子(微單位/I X IO6精子)。
[0039]實施例7
第一步，按照下述步驟，進行精子唾液酸酶NEUl的表達檢測:
A收集新鮮液化精液標本，離心分離出精子，以500 g/min的速度低速離心6min, PBS洗滌精子3次；
B計數(shù)精子數(shù)量，冰上置25 min；
C采用0.1%的Triton X-100對精子進行預處理，PBS洗滌精子3次，用3%的PFA再次對精子進行預處理；
D采用1%的BSA-PBS溶液進行封閉；
E采用lug/ul的抗人NEUl抗體孵育2h，PBS洗滌精子3次；
F在常溫下，精子在1:1000的常規(guī)熒光二抗中孵育1.5 h ;
G采用流式細胞儀檢測或熒光顯微鏡制作精子的細胞涂片，觀察唾液酸酶在精子中的表達。
[0040]再按照下述步驟，進行精子唾液酸酶NEU3的表達檢測:
A收集新鮮液化精液標本，離心分離出精子，以500 g/min的速度低速離心6min, PBS洗滌精子3次；
B計數(shù)精子數(shù)量，冰上置25 min；
C采用0.1%的Triton X-1OO對精子進行預處理，PBS洗滌精子3次，用3%的PFA再次對精子進行預處理；
D采用甲醇固定；
E采用lug/ul的抗人NEUl抗體孵育2h，PBS洗滌精子3次；
F在常溫下，精子在1:1000的常規(guī)熒光二抗中孵育1.5 h ;
G采用流式細胞儀檢測或熒光顯微鏡制作精子的細胞涂片，觀察唾液酸酶在精子中的表達。
[0041]流式細胞儀檢測后分析單個精子熒光強度，采用兩種比較方法:a絕對比較:所檢測標本與抗體的同型對照(同型對照是使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性與細胞結(jié)合而產(chǎn)生的背景)b相對比較:同批量檢測標本之間比較單個精子熒光強度。
[0042]本發(fā)明利用單精子熒光強度分析(同型對照/批量對照)可相對直觀的量化唾液酸酶在精子的表達；或者利用顯微鏡下熒光成像可直觀的觀察到唾液酸酶的表達，所以本發(fā)明采用的是一種直觀成像與相對量化的檢測方法來評估精子表達唾液酸酶(NEU1/3)的一種方法。
[0043]上述檢測發(fā)現(xiàn)唾液酸酶NEUl和唾液酸酶NEU3在精子中的高表達，第二步，按照如下操作檢測唾液酸酶活性:
A收集新鮮液化精液標本，離心分離精子，以500 g/min的速度低速離心6min ；
B采用上游法于37 1:下，在5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min,收獲上游精子，采用Bffff培養(yǎng)液洗滌精子3次。
[0044]C計數(shù)精子數(shù)量，用體外獲能液HSA 5mg/ml HTF,在5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育精子3.5h ；
D先將經(jīng)上述操作得到的溶液離心分離，收取的上清液再次離心分離，收取上清液；
E立即將獲能后的上清液用熒光法檢測唾液酸酶活性。
[0045]實施例8
本實施例與實施例7基本相同，在此基礎上:
按照如下操作檢測唾液酸酶活性:
A收集新鮮液化精液標本，離心分離精子，以600 g/min的速度低速離心5min ;
B采用上游法于36.5 1:下，在5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min，收獲上游精子，采用Bffff培養(yǎng)液洗滌精子3次。
[0046]C計數(shù)精子數(shù)量，調(diào)整為I X 107/ml以上，用體外獲能液HSA 5mg/ml HTF,在5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育精子3.5h ；
D先將經(jīng)上述操作得到的溶液離心分離，收取的上清液再次離心分離，收取上清液；
E立即將獲能后的上清液用熒光法檢測唾液酸酶活性。
[0047]實施例9
本實施例與實施例7基本相同，在此基礎上:
按照如下操作檢測唾液酸酶活性: A收集新鮮液化精液標本，離心分離精子，以550 g/min的速度低速離心5.5min ;
B采用上游法于36°C，在5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min,收獲上游精子，采用Bffff培養(yǎng)液洗滌精子3次。
[0048]C計數(shù)精子數(shù)量，調(diào)整為IXlOVml以上，用體外獲能液HSA 5mg/ml HTF于36°C，5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育3.5 h，反應體積IOOul。
[0049]D先將經(jīng)上述操作得到的溶液離心分離，以500 g/min的速度低速離心6min,收取的上清液再次離心分離，以5000g/min的速度低速離心15min，收取上清液；
E立即將獲能后的上清液用熒光法檢測唾液酸酶活性。
[0050]實施例10
本實施例與實施例7基本相同，在此基礎上:
按照如下操作檢測唾液酸酶活性:
A收集新鮮液化精液標本，離心分離精子，以580g/min的速度低速離心5min ；
B采用上游法于37 1:下，在5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 min，收獲上游精子，采用Bffff培養(yǎng)液洗滌精子3次。
[0051]C計數(shù)精子數(shù)量，調(diào)整為IXlOVml以上，用體外獲能液HAS 5mg/ml HTF于370C，5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育3.5 h，反應體積200ul。
[0052]D先將經(jīng)上述操作得到的溶液離心分離，以600 g/min的速度低速離心5 min,收取的上清液再次離心分離，以6000g/min的速度低速離心10 min,收取上清液；
E立即將獲能后的上清液用熒光法檢測唾液酸酶活性。
[0053]實施例11
本實施例與實施例7基本相同，在此基礎上:
按照如下操作檢測唾液酸酶活性:
A收集新鮮液化精液標本，離心分離精子，以520 g/min的速度低速離心5min ;
B采用上游法于36?37 1:下，在5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 min，收獲上游精子，采用Bffff培養(yǎng)液洗滌精子3次。
[0054]C計數(shù)精子數(shù)量，調(diào)整為IXlOVml以上，用體外獲能液HAS 5mg/ml HTF于36.5°C下，5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育3.5 h，反應體積150ul。
[0055]D先將經(jīng)上述操作得到的溶液離心分離，以540 g/min的速度低速離心5.5min,收取的上清液再次離心分離，以5500g/min的速度低速離心12min，收取上清液；
E立即將獲能后的上清液用熒光法檢測唾液酸酶活性。
【權(quán)利要求】
1.影響精子功能的唾液酸酶檢測方法，其特征在于:第一步，通過單精子熒光強度分析直觀的量化唾液酸酶在精子中的表達，或者利用顯微鏡下熒光成像直觀的觀察唾液酸酶在精子中的表達；若唾液酸酶在精子中聞表達，則進行第 步，利用體外獲能液使精子獲能，并用熒光法檢測唾液酸酶活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的影響精子功能的唾液酸酶檢測方法，其特征在于:所述的體外獲能液為HSA 5mg/ml HTF0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的影響精子功能的唾液酸酶檢測方法，其特征在于:所述的第一步，按照下述步驟，分別進行精子唾液酸酶NEUl和NEU3的表達檢測: A收集新鮮液化精液標本，離心分離出精子，PBS洗滌精子； B計數(shù)精子數(shù)量，冰上置2(T30 min； C采用0.1%的Triton X-1OO對精子進行預處理，PBS洗滌精子，用3%的PFA再次對精子進行預處理； D當檢測NEUl時，采用1%的BSA-PBS溶液進行封閉；或者，當檢測NEU3時，采用甲醇固定； E采用lug/ul的抗人NEUl抗體孵育I~3 h，PBS洗滌精子； F在常溫下，精子在1:1000的常規(guī)熒光二抗中孵育廣2 h ； G采用流式細胞儀檢測或熒光顯微鏡制作精子的細胞涂片，觀察唾液酸酶在精子中的表達。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的影響精子功能的唾液酸酶檢測方法，其特征在于:所述的第二步，具體操作步驟如下: A收集新鮮液化精液標本，離心分離精子； B采用上游法，在5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)精子，收獲上游精子，采用Bffff培養(yǎng)液洗滌精子； C計數(shù)精子數(shù)量，用體外獲能液HSA 5mg/ml HTF，在5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育精子3 ~4 h ； D先將經(jīng)上述操作得到的溶液離心分離，收取的上清液再次離心分離，收取上清液； E立即將獲能后的上清液用熒光法檢測唾液酸酶活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或者4所述的影響精子功能的唾液酸酶檢測方法，其特征在于:所述的A步驟，以500~600 g/min的速度低速離心5~6min。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的影響精子功能的唾液酸酶檢測方法，其特征在于:所述的B步驟，采用上游法于36~37 °C，在5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1(T30 min。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的影響精子功能的唾液酸酶檢測方法，其特征在于:所述的C步驟，計數(shù)精子數(shù)量，調(diào)整為IXlOVml以上。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的影響精子功能的唾液酸酶檢測方法，其特征在于:所述的C步驟，用體外獲能液HSA 5mg/ml HTF于36~37 °C，5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育: 4 h，反應體積100~200ul。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的影響精子功能的唾液酸酶檢測方法，其特征在于:所述的D步驟，先以500~600 g/min的速度低速離心5~6min,再以5000~6000g/min的速度低速離心`10 ~15 min。
【文檔編號】G01N33/531GK103454416SQ201310431847
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】馬芳, 許文明, 徐克惠, 岳煥勛, 蔣敏, 歐陽運薇, 林麗 申請人:四川大學華西第二醫(yī)院