一種快速篩選天然產(chǎn)物中拓?fù)洚悩?gòu)酶i抑制劑的方法
【專利說(shuō)明】一種快速篩選天然產(chǎn)物中拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑的方法發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物分析領(lǐng)域，尤其涉及一種快速篩選天然產(chǎn)物中拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑的方法;具體地說(shuō)，本發(fā)明是利用超濾膜技術(shù)與色譜、質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)從天然產(chǎn)物提取物或其單體化合物中快速篩選拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I，是廣泛存在于原核和真核生物體內(nèi)的一種必需酶，其催化部位的酪氨酰殘基攻擊DNA單鏈，使得酶與DNA 3’-磷酸二脂鍵形成共價(jià)連接，造成DNA單鏈的斷裂，從而通過(guò)調(diào)節(jié)超螺旋、連鎖、去連鎖以及核酸解結(jié)作用，影響DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。靶向藥物是目前應(yīng)用于癌癥治療的最先進(jìn)的藥物，它通過(guò)與腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)所必需的特定靶點(diǎn)作用來(lái)阻止腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，拓?fù)洚悩?gòu)酶在腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出不受其他因素影響的高水平表達(dá)，特別是結(jié)腸癌、宮頸癌和卵巢癌等的拓?fù)洚悩?gòu)酶I含量及活性遠(yuǎn)高于正常體細(xì)胞，尤其在S期腫瘤細(xì)胞中活性大幅提高。因此，拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑可選擇性地抑制增殖期腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制，阻止腫瘤細(xì)胞快速增殖，進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞。由于拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑具有眾多優(yōu)越性，美國(guó)國(guó)家癌癥研究所藥物機(jī)制分析電腦網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)已將拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑列為重點(diǎn)研究的六大類(lèi)抗腫瘤藥物之一，該酶已成為設(shè)計(jì)新型抗癌藥物的重要新靶點(diǎn)，對(duì)其抑制劑的研究可為腫瘤的治療提供新的臨床藥物和技術(shù)手段。
[0003]拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑的常規(guī)篩選法一般使用光譜法、表面等離子共振法、X射線散色法、量熱法和核磁共振法等(Chenxi Yao ,Na Na ,Lingyun Huang，Dacheng He ,JinOuyang.Analytica Chimica Acta，2013，79，60—66;Vanisree Mulabagal,Angela 1.Calderon,Analytical Chemistry，2010，82，3616-3621)，上述方法方便快捷，可在一定程度上滿足篩選需求。然而光譜法因存在背景干擾而易產(chǎn)生假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果;核磁共振檢測(cè)過(guò)程不能提供快速交換反應(yīng)中蛋白質(zhì)-配體相互作用的詳細(xì)特征等。超濾質(zhì)譜連用技術(shù)結(jié)合了超濾裝置優(yōu)良的分離功能與質(zhì)譜技術(shù)高速、高靈敏性、高準(zhǔn)確度等特性，具有分析速度快、特異性強(qiáng)和高通量的特點(diǎn)，可便捷地識(shí)別與生物靶分子相結(jié)合的藥物配體，同時(shí)樣品分析用量少、譜圖信息量大，在藥物小分子配體和生物大分子受體相互作用研究方面具有很大的優(yōu)勢(shì)(Shun Xiao,Runru Yu,Ni Ai，Xiaohui Fan.Journal of Pharmaceuticaland B1medical Analysis,2015,104,67-74； Xingxin Yang,Dan Wang,Zhiwei Yang，etal.Journal of Chromatography A，2015，1413，33_46)o

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，提供一種快速篩選天然產(chǎn)物中拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑的方法，可用于分析天然產(chǎn)物提取物或者單體化合物對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶I體外富集率。
[0005]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
本發(fā)明所述的天然產(chǎn)物提取物或者單體化合物對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶I體外富集率是指天然產(chǎn)物提取物或者單體化合物與拓?fù)洚悩?gòu)酶I進(jìn)行孵化和結(jié)合后，受體-配體復(fù)合物經(jīng)有機(jī)溶劑處理使小分子配體釋放出來(lái)，用液相-質(zhì)譜檢測(cè)釋放出來(lái)的活性化合物，計(jì)算各成分與拓?fù)洚悩?gòu)酶I結(jié)合的濃度變化及其比值。
[0006]具體地說(shuō)，本方法包括以下步驟:
所述的超濾質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是指一種將超濾膜技術(shù)與色譜、質(zhì)譜分析方法聯(lián)合使用所形成的一種新的研究手段；
所述的拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑是天然產(chǎn)物提取物或其單體化合物;本發(fā)明優(yōu)選天然產(chǎn)物鼠李提取物、石蒜生物堿提取物、單體化合物重樓皂苷1、11、VI和VII;
①酶結(jié)合反應(yīng)緩沖液的配制
酶結(jié)合反應(yīng)緩沖液包括:
醋酸鉀:50毫摩爾/升，三羥甲基氨基甲烷-醋酸:20毫摩爾/升，
醋酸鎂:10毫摩爾/升，二硫蘇糖醇:I毫摩爾/升；
精確稱取醋酸鉀4907毫克、三羥甲基氨基甲烷-醋酸2422.8毫克、醋酸鎂2144.6毫克和二硫蘇糖醇154.3毫克，使用去離子水溶解至終體積為I升，充分混合后，25°C下pH值為7.9;
②待測(cè)樣品的配制
精確稱取適量待測(cè)樣品，用酶結(jié)合反應(yīng)緩沖液充分溶解，待測(cè)液終濃度為1.0-3.0毫克/暈升；
所述的待測(cè)樣品是鼠李提取物或石蒜生物堿提取物；
③標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
用乙腈將內(nèi)標(biāo)樣品配制成濃度為100微克/毫升的標(biāo)準(zhǔn)母液，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)前加入至待測(cè)樣品液中，終濃度為2.0-5.0微克/毫升；
所述的標(biāo)準(zhǔn)品為異夏佛塔苷或荷葉堿；
④待測(cè)樣品與正常和失活拓?fù)洚悩?gòu)酶I的結(jié)合反應(yīng)
實(shí)驗(yàn)組:在0.2毫升的離心管中依次加入100微升的待測(cè)樣品液與10微升濃度為0.5U/微升的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I，37°C下孵育30分鐘;將反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)移至截留分子質(zhì)量為3萬(wàn)道爾頓的超濾管中，在10000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘;加入200微升緩沖液洗去未結(jié)合成分，并再次在10000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘;重復(fù)上述步驟2次，合并濾液；向超濾管中加入200微升的90%乙腈，室溫下放置10分鐘后，10000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘，釋放配體;重復(fù)上述步驟2次，合并濾液;將上述所得洗脫液吹干并加入50微升的90%乙腈溶解，用于色譜-質(zhì)譜分析；
對(duì)照組:在0.2毫升的離心管中依次加入100微升的待測(cè)樣品液與10微升于沸水中放置10分鐘滅活的濃度為0.5 U/微升的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I，37°C下孵育30分鐘;將反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)移至截留分子質(zhì)量為3萬(wàn)道爾頓的超濾管中，在10000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘；加入200微升緩沖液洗去未結(jié)合成分，并再次在10000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘;重復(fù)上述步驟2次，合并濾液；向超濾管中加入200微升的90%乙腈，室溫下放置10分鐘后，10000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘，釋放配體;重復(fù)上述步驟2次，合并濾液;將上述所得洗脫液吹干并加入50微升的90%乙腈溶解，用于色譜-質(zhì)譜分析；
⑤反應(yīng)樣品的色譜-質(zhì)譜檢測(cè)分析
以內(nèi)標(biāo)法定量，對(duì)步驟④中兩組樣品溶液進(jìn)行高效液相和質(zhì)譜檢測(cè);根據(jù)色譜圖中各峰的峰面積與內(nèi)標(biāo)樣品的峰面積比，計(jì)算各成分相對(duì)濃度； 對(duì)提取物待測(cè)樣品、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品進(jìn)行高效液相色譜和質(zhì)譜檢測(cè):
A、高效液相色譜的分析條件
高效液相色譜儀:Thermo Accela 600 ；
色譜柱:Waters Symmetry C18，規(guī)格為4.6X250毫米，5微米；
流動(dòng)相:A-0.1%甲酸-水;B-乙腈；
梯度洗脫程序:0-5分鐘，20%B ； 5-30分鐘，20-70%B ； 30-35分鐘，70%B ；
流速:0.6毫升/分鐘；
進(jìn)樣量:10微升；
檢測(cè)波長(zhǎng):360納米；
B、質(zhì)譜分析條件
質(zhì)譜儀:TSQ Quantum Access MAX；
離子源:電噴霧電離源負(fù)離子模式；
分子量掃描范圍:150-1500道爾頓；
二級(jí)譜掃描方式:數(shù)據(jù)依賴型掃描；
噴霧電壓:3000伏特；
毛細(xì)管溫度:350 °C;
鞘氣壓:275.8千帕；
輔助氣壓，氮?dú)?55.2千帕；
⑥拓?fù)洚悩?gòu)酶I對(duì)抑制劑的富集率
拓?fù)洚悩?gòu)酶I對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑的富集率，可通過(guò)酶作用前后待測(cè)樣品中各個(gè)色譜峰曲線下截面積(AUC)的變化進(jìn)行計(jì)算評(píng)價(jià)；
分別根據(jù)未處理待測(cè)樣品、與拓?fù)洚悩?gòu)酶I作用前后的實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組中各個(gè)色譜峰曲線下截面積，依據(jù)如下公式計(jì)算拓?fù)洚悩?gòu)酶I對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑的富集率:
EF= (A幾-細(xì)(?)/Α.X 100%
式中，EF為拓?fù)洚悩?gòu)酶對(duì)I抑制劑的富集率，A幾為樣品與拓?fù)洚悩?gòu)酶I作用后色譜峰的截面積，仏?為樣品與滅活拓?fù)洚悩?gòu)酶I作用后色譜峰的截面積，A待；I為未與拓?fù)洚悩?gòu)酶I發(fā)生作用的待測(cè)樣品中色譜峰的截面積。
[0007]本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和積極效果:
①將超濾膜技術(shù)與色譜、質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)聯(lián)用方法應(yīng)用到拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑的篩選中，樣品分析速度快、特異性強(qiáng)，可方便地識(shí)別與生物靶分子相結(jié)合的藥物配體；
②同時(shí)樣品分析用量少、譜圖信息量大，可實(shí)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的快速篩選，在藥物小分子配體和生物大分子受體相互作用研究方面具有很大的優(yōu)勢(shì)；
③適用于分析天然產(chǎn)物提取物或者單體化合物對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶I體外富集率。
[0008]
【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1為本發(fā)明的步驟流程圖；
圖2為實(shí)施例1中鼠李提取物經(jīng)超濾步驟后所得活性成分的液相色譜圖，
檢測(cè)波長(zhǎng)360納米，線a表示未與拓?fù)洚悩?gòu)酶I發(fā)生作用的鼠李提取物成分液相色譜圖，線b和線C分別表示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組所得鼠李活性成分的液相色譜圖，內(nèi)標(biāo)品(IS)為異夏佛塔苷；
圖3為實(shí)施例1中液相色譜圖峰3(芹黃素)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)負(fù)離子模式的提取色譜圖，
提取所用離子為母離子269.04，信號(hào)強(qiáng)度為7.14 X 17;
圖4為實(shí)施例1中液相色譜圖峰4(槲皮素)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)負(fù)離子模式的提取色譜圖，
提取所用離子為母離子301.00,信號(hào)強(qiáng)度為3.72X 16;
圖5為實(shí)施例1中液相色譜圖峰5(鼠李檸檬素)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)負(fù)離子模式的提取色譜圖，提取所用離子為母離子298.90，信號(hào)強(qiáng)度為1.69 X 16;
圖6為實(shí)施例1中液相色譜圖峰6(櫻花素)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)負(fù)離子模式的提取色譜圖，
提取所用離子為母離子284.99，信號(hào)強(qiáng)度為1.06 X 17;
圖7為實(shí)施例1中液相色