一種固相萃取劑富集人血漿中前白蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物蛋白分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種固相萃取劑富集人血漿中 前白蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 石墨烯(Graphene)，一種由單層碳原子致密堆積成的二維蜂窩晶格結(jié)構(gòu)，最近引 發(fā)了大量的研究興趣。它獨(dú)特結(jié)合了電化學(xué)性能和量子效應(yīng)，具有優(yōu)異的熱學(xué)性能和機(jī)械 性能。值得注意的是，石墨烯是一個雙面多環(huán)芳烴，超高的比表面積使其具有成為高吸附材 料的潛能。而皺褶石墨烯球仍然具有η共輒結(jié)構(gòu)，因此仍然與多環(huán)芳烴具有較強(qiáng)的親和力， 重要的是，皺褶的球狀石墨烯與片層石墨烯相比，具有抗壓抗團(tuán)聚的性能，因此，皺褶的球 狀石墨烯與片層石墨烯相比，更適合作為SPE填料，具有更好的萃取性能。
[0003] 前白蛋白0^&113111^11，？六），分子量為5.4萬，由肝細(xì)胞合成，在電泳分離時，常顯 示在白蛋白的前方，故稱為前白蛋白。肝臟疾病時前白蛋白更敏感，有30%白蛋白正常的肝 病患者的前白蛋白減少，壞死后肝硬化幾乎是零。肝硬化肝細(xì)胞壞死較輕，前白蛋白變化不 大，當(dāng)病情改善時，前白蛋白亦迅速升高。因此，測定前白蛋白在血漿中的濃度對于了解蛋 白質(zhì)的營養(yǎng)不良、肝功能不全、比之白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白具有更高的敏感性。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)提 純方法主要包括電泳、離子交換層析分離、親和層析和有機(jī)溶劑沉淀法，這些方法要么成本 很高，要么過程復(fù)雜且靈敏度低，難以達(dá)到滿意效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種固相萃取劑富集人血漿中前白蛋白的方 法，該方法基于石墨烯球作為SPE填料，并結(jié)合超高效液相色譜，耗時較少，能夠方便、快捷、 高劑量的從反應(yīng)體系中吸附分離出前白蛋白；本發(fā)明所使用的原材料廉價(jià)易得，所制得的 石墨烯微球具有抗壓性、抗團(tuán)聚性，有較大比表面積和豐富的活性基團(tuán)，具有后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn) 分析的潛力。
[0005] 本發(fā)明的一種固相萃取劑富集人血漿中前白蛋白的方法，包括：
[0006] (1)將氧化石墨烯分散液超聲霧化，在N2驅(qū)動下通過400 °C~450 °C的石英管，收 集，干燥，得到石墨稀微球固相萃取劑;其中，石墨稀微球的粒徑為lwn~3μηι;
[0007] (2)將固體氯化鈉加入到含有前白蛋白的純血漿中，然后加入苯酚溶液，攪拌，靜 置，離心，得上清液;其中，加入氯化鈉后血漿中氯化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%~30% ;
[0008] (3)將步驟（1)中的石墨烯微球加入到固相萃取柱，然后活化固相萃取柱，然后將 步驟(2)中的上清液進(jìn)行稀釋后通過固相萃取柱，經(jīng)過淋洗，真空栗抽至進(jìn)干，洗脫，氮吹濃 縮，進(jìn)入HPLC分析檢測。
[0009] 所述步驟（1)中氧化石墨烯分散液的制備方法:將超純水加入到氧化石墨中，攪 拌，超聲，即得;氧化石墨稀分散液的濃度為4wt%~6wt%。
[0010] 所述步驟(1)中超聲霧化過程中超聲波頻率為1.5MHz~2.0MHz。
[0011] 所述步驟（1)中收集為末端濾膜收集;濾膜為PTFE膜，其中，孔徑為0.22μπι~0.45μ m〇
[0012] 所述步驟(1)中干燥為:室溫下干燥4h，然后放入真空干燥器中70 °C干燥24h。
[0013] 所述步驟(2)中苯酚溶液的體積與氯化鈉加入到血漿后得到的溶液的體積比為1: 1;苯酚溶液的體積分?jǐn)?shù)為5.0%-6.0%。
[0014] 所述步驟(2)中離心轉(zhuǎn)速為8000rpm-10000rpm，離心時間為10min_15min;靜置為4 。(:靜置 20h-25h。
[0015] 所述步驟(3)中活化固相萃取柱為：用體積百分比為40%-60%的甲醇溶液對柱體 進(jìn)行活化處理，控制流速為〇. 8ml/min;固相萃取柱體積為3ml。
[0016] 所述步驟(3)中淋洗為甲醇淋洗液；甲醇淋洗液的體積百分比為5%~10%，洗脫 液體積3ml_5ml，洗脫流速為0. lml/min~0.3ml/min;氮吹時間5min~lOmin，氮吹溫度50°C ~55。。。
[0017] 所述步驟(3)中HPLC的柱溫30°C_35°C，流速1.0ml/min-1.5ml/min，有機(jī)相梯度變 化0min-20min: 5 % -30 %，20min-22min: 30 % -5 %，22min-30min: 5 % -5 %，進(jìn)樣量 15μ1-20μ 1，檢測波長為280nm;選擇Agilent C18色譜柱，有機(jī)相為含0.08%-0.1%三氟乙酸的乙腈 作，水相為含〇. 1 %-〇. 15 %三氟乙酸的超純水，濾膜孔徑0.2μηι-0.4μηι，流動相超聲時間 20min-30min〇
[0018] 本發(fā)明提供了一種固相萃取劑富集人血漿中前白蛋白的方法，利用石墨烯微球本 發(fā)明制得的石墨烯微球抗壓，抗團(tuán)聚，擁有較大比表面積和豐富的活性基團(tuán)，能夠方便、快 捷、高劑量的從反應(yīng)體系中吸附分離出前白蛋白；并利用固相萃取易于結(jié)合高效液相色譜 聯(lián)用，建立了一種分析濃縮富集前白蛋白的方法，為前白蛋白的快速提取提供了可能。為達(dá) 到最佳萃取效果，本發(fā)明考察了柱長、上樣速度、樣品溶液的離子強(qiáng)度和pH值、洗脫劑用量 和時間等因素對萃取效率的影響，優(yōu)選出最佳固相萃取條件，然后，對在最佳固相萃取條件 下得到的濃縮液，進(jìn)行高效液相色譜分析，建立SPE-HPLC濃縮富集、檢測血漿中前白蛋白的 方法，滿足實(shí)際要求。
[0019] 有益效果
[0020] (1)本發(fā)明的石墨烯微球粒徑可控，具有抗壓，抗團(tuán)聚，擁有較大比表面積和豐富 的活性基團(tuán)，能夠方便、快捷、高劑量的從反應(yīng)體系中吸附分離出前白蛋白；
[0021] (2)本發(fā)明基于石墨烯球作為SPE填料并結(jié)合超高效液相色譜，建立一種適用于血 漿中前白蛋白高效快速的濃縮富集、檢測方法，優(yōu)于其它蛋白提純方法，滿足實(shí)際需求； [0022] (3)本發(fā)明所建立的SPE-HPLC串聯(lián)檢測系統(tǒng)，操作簡單，成本較低，吸附率高于其 它吸附劑，顯著提高儀器的檢測限。
【附圖說明】
[0023] 圖1為實(shí)施例1中石墨烯微球固相萃取劑的SEM圖；
[0024] 圖2為本發(fā)明中石墨烯微球作固相萃取劑萃取流程圖；
[0025] 圖3為實(shí)施例3中應(yīng)用固相萃取-高效液相色譜聯(lián)用濃縮富集、測定血漿中前白蛋 白色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
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