一種基于elisa檢測dna-蛋白交聯(lián)體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學領(lǐng)域，具體涉及一種與診斷相關(guān)的基于ELISA方法檢測在某些理化因素作用下，直接或間接產(chǎn)生的DNA-蛋白交聯(lián)物。
【背景技術(shù)】
[0002]生物機體中，DNA-蛋白的相互作用，如DNA聚合酶、RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子、DNA損傷修復蛋白等與基因組DNA非共價結(jié)合的相互作用(non-covalent interact1n)，在細胞增殖和維持遺傳基因的完整性等方面發(fā)揮了重要作用。然而，藥/毒物暴露下形成的共價結(jié)合(Covalent interact1n)的交聯(lián)型 DNA-蛋白復合體(DNA-Protein crosslinkingcomplex，DPC)，由于阻礙了DNA的復制和轉(zhuǎn)錄，是一種嚴重的DNA損傷方式。甲醛，輻射，氮芥，順鉑等都可以引起DPC生成，并引起細胞增殖旺盛的組織，如骨髓、腫瘤等的藥物敏感性增加(Wong VC,Cash HL,Morse JL,Lu S,Zhitkovich A: S-phase sensing of DNA-protein crosslinks triggers TopBP1-1ndependent ATR activat1n and p53_mediated cell death by formaldehyde.CelI Cycle 2012,11:2526-37.1de H，Shoulkamy MI,Nakano T,Miyamoto-Matsubara MjSalem AM:Repair and b1chemicaleffects of DNA-protein crosslinks.Mutat Res 2011，711:113-22.) dDPC致細胞損傷和基因突變的毒性效應(yīng)已經(jīng)得到確證(Nakano TjOuchi RjKawazoe JjPack SPjMakino K，Ide H:T7RNA polymerases backed up by covalently trapped proteins catalyzehighly error prone transcript1n.J B1l Chem 2012，287:6562-72.Nakano T，Mitsusada YjSalem AM,Shoulkamy MI,Sugimoto TjHirayama RjUzawa AjFurusawa Y，Ide H:1nduct1n of DNA-protein cross-links by 1nizing radiat1n and theireliminat1n from the genome.Mutat Res 2015，771:45—50.Nakano T,Miyamoto-Matsubara MjShoulkamy MI,Salem AMjPack SPjIshimi YjIde H:Translocat1n andstability of replicative DNA helicases upon encountering DNA-protein cross-links.J B1l Chem 2013,288:4649-58.)，近年來在DPC損傷修復機制上也有一些突破性的進展，如最近《Cell》發(fā)表文章，證實DPC可以通過復制依賴的水解酶修復(Duxin JPjDewar JM,Yardimci H,Wal ter JC: Repair of a DNA-protein crosslink byreplicat1n-coupled proteolysis.Cell 2014，159:346—57.Stingele JjSchwarz MS,Bloemeke NjWolf PGjJentsch S:A DNA-dependent protease involved in DNA-proteincrosslink repair.Cell 2014，158:327-38.)。但總的說來，DPC在作用機制尚有諸多不明之處。較其它的DNA損傷方式，如核酸堿基上加合烷化物、聯(lián)間/內(nèi)交聯(lián)形成等，DPC引起的細胞損傷，突變效應(yīng)更嚴重，修復更加困難。檢測細胞或組織樣本中總DPC(Total DPCJ-DPC)水平對于研究DPC的形成及細胞損傷修復機制，臨床評估藥物敏感性等有重要意義。
[0003]06-甲基轉(zhuǎn)移酶(06_me thy lguanine-DNA methy I transferase，MGMT)，一種 23kDa的蛋白，與DNA烷化損傷修復密切相關(guān)，是目前唯一發(fā)現(xiàn)的在哺乳細胞中能夠直接移除06位點烴化加合物的修復酶，被認為在維持基因組穩(wěn)定性和腫瘤形成中極為重要(Pegg AE:Multifaceted roles of alkyItransferase and related proteins in DNA repair,DNAdamage,resistance to chemotherapy，and research tools.Chem Res Toxicol 2011，24:618-39.) eMGMT是一種有限的消耗性酶，補充緩慢。MGMT在臨床的腫瘤化療，藥物開發(fā)中均有重要作用。有報道，在造血組織高表達外源性MGMT可增加細胞對烷化劑的耐受(Schambach A,BayM C:Vector design for express1n of 06-methylguanine-DNAmethyItransferase in hematopoietic cells.DNA Repair(Amst)2007，6:1187-96.)。這說明MGMT表達水平與細胞的烷化劑耐受密切相關(guān)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在氮芥等雙功能烷化劑作用后，MGMT無法發(fā)揮移除DNA加合物的正常功能，因為此時MGMT被交聯(lián)在DNA上形成MGMT-DNA crosslink(M-DPC)無法釋放。與其它的DPC損傷一樣，M-DPC被證實具有致DNA復制損傷和突變的多重作用。在一些MGMT豐富的組織或細胞中，雙功能烷化劑弓I起的M-DPC的增加被認為是動物/細胞毒性反應(yīng)的重要原因(Kalapila AG1Pegg AE:AlkyItransferase-mediated toxicity of bis—electrophiIes in mammaliancells.Mutat Res 2010,684:35-42.Kisby GE,Olivas A,Park T1ChurchweII M,DoergeD,Samson LD,Gerson SL,Turker MS:DNA repair modulates the vulnerability of thedeveloping brain to alkylating agents.DNA Repair(Amst)2009,8:400-12.)。檢測細胞或組織樣本中M-DPC水平在此情況下有重要意義。
[0004]雖然自上世紀70年代，人們就發(fā)現(xiàn)DPC存在于多種染毒組織、細胞中，但由于相關(guān)技術(shù)在普通實驗室難以開展，針對DPC的檢測難以應(yīng)用，能夠形成DPC的藥物通常伴有大量的非DPC損傷，欲獲得較高純度的DPC樣本通常需要使用超速離心等復雜手段。DPC的檢測技術(shù)近年來有了進步，實現(xiàn)了以DNA加合物快速回收(RADAR，rapid approach to DNA adductrecovery)一狹縫印跡(slot blotting) (RADAR-SB)的聯(lián)合檢測方法，這也為本項目開發(fā)快速檢測DPC的ELISA試劑盒奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)我們對文獻的調(diào)研和分析，DPC檢測技術(shù)的主要發(fā)展歷程如下:
[0005]技術(shù)I ,SDS-KCl檢測法檢測T-DPC。這是一種上世紀70-80年代開發(fā)的方法，簡便易行，但線性范圍窄，靈敏度差。其原理為SDS可以和游離蛋白及DPC上交聯(lián)蛋白結(jié)合，而不和DNA結(jié)合，樣品中加入KCl溶液時DPC和蛋白質(zhì)沉淀下來，而游離的DNA留在上清液中。向沉淀中加入蛋白酶K除去蛋白質(zhì)使DPC中的DNA游離出來，用熒光法測定此DNA的含量以及原液中DNA的含量，計算交聯(lián)DNA和總DNA的比值，進而得出DNA和蛋白質(zhì)的交聯(lián)程度。DPC系數(shù)=交聯(lián)DNA/(交聯(lián)DNA+游離DNA)。
[0006]技術(shù)2，超速離心-熱裂解法檢測特異蛋白交聯(lián)DPC(Michaelson-Richie ED,Loeber RL,Codreanu SG,Ming X1Liebler DC,Campbell C1Tretyakova NY:DNA-proteincross-linking by 1,2,3,4-diepoxybutane.J Proteome Res 2010，9:4356-67.)。是之前主流的DPC檢測方法，該法制備的DPC純度高，交聯(lián)蛋白活性保存好，缺點是步驟繁瑣，需應(yīng)用到超速離心機等昂貴設(shè)備，一般實驗室無法開展。實驗原理為DPC通過氯化銫密度梯度超高速(大于100，000g)長時間離心后，胞核成分被分離在不同的層面上，收集純凈的DPC。將DPC加熱后使交聯(lián)有DPC的堿基從DNA上分離下來，便可以進行HPLC-MS或者WesternBlotting，以分析交聯(lián)蛋白的種類和含量。
[0007]技術(shù)3，F(xiàn)ITC標記檢測T_DPC(ShoulkamyMI ,Nakano T,Ohshima M1Hirayama R,Uzawa A,Furusawa Y,Ide H:Detect1n of DNA-protein crosslinks(DPCs)by noveldirect fluorescence labeling methods: distinct stabilities of aldehyde andradiat1n-1nduced DPCs.Nucleic Acids Res 2012,40: el43.)。Ide，H.等于2012年報道了使用FITC標記DPC中蛋白來檢測T-DPC的方法，該方法對T-DPC的檢測技術(shù)進行了革新。原理為采用超高速密度梯度離心后收集得到DPC樣品，并在pH8.0的硼酸緩沖液中，將DPC上蛋白進行FITC標記，然后續(xù)通過熒光分光光度儀上讀取FITC的熒光數(shù)值，或者slot blotting(狹縫印記)的方法轉(zhuǎn)移到NC膜，通過抗體結(jié)合和顯色確定某一蛋白的水平。
[0008]技術(shù)4，DNAzol 法檢測特異蛋白交聯(lián) DPC(Kiianitsa K ,Maizels N:Ultrasensitive isolat1n, identificat1n and quantificat1n of DNA-proteinadducts by ELISA-based RADAR assay.Nucleic Acids Res 2014,42:el08.KiianitsaK1Maizels N:A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes inliving cel I s.Nucleic Acids Res 2013，41: el04) Jaizels，N.等從 2013 年始，在《Nucleic Acids Res》上接連發(fā)表了2篇文獻，提出了一種創(chuàng)新性的DPC提取、純化以及特異蛋白交聯(lián)DPC的檢測方法，稱之為RADAR-SB聯(lián)合檢測方法。該實驗檢測不需復雜的儀器設(shè)備，方法大為簡化。實驗原理為利用商品化的含異硫氰酸胍的DNA提取試劑(如DNAzol等)處理得到DPC樣本。該方法于2015年被進一步優(yōu)化，即提取過程中添加二氧化硅以增加DPC在溶液中沉積的效率。純化后的DPC通過狹縫印記的方法轉(zhuǎn)移到NC膜，通過抗體結(jié)合、顯色。
[0009]ELISA是一種基于免疫反應(yīng)的方法，具有快速、敏感、簡便、易于標準化等優(yōu)點，在臨床檢驗或者科研實驗中有廣泛應(yīng)用。常用的ELISA類型有，雙抗源/抗體夾心法，間接法測抗體，競爭法，捕獲包被法測抗體。2014年MaizeIs，N.等嘗試了基于ELISA方法檢測DPC，在采用了多種類型的ELISA方法來檢驗DNA拓補異構(gòu)酶T0Pl/T0P2a-DNA交聯(lián)體，發(fā)現(xiàn)都不能很好地檢出，原因在于DPC中的DNA成分影響了交聯(lián)蛋白與ELISA板上包被抗體的結(jié)合能力。采用核酸酶消化DPC中DNA后，再進行DPC的檢測，信號大大提高(Kiianitsa K1Ma