用于檢測硫酸化寡糖的分析方法
【專利說明】用于檢測硫酸化寡糖的分析方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 不適用
【背景技術(shù)】
[0003] 類肝素（肝素及硫酸乙酰肝素Ofeparansulfate))是多個重要生物過 程中已知的調(diào)節(jié)介質(zhì)。類肝素及其衍生物低分子量肝素（low-molecularweight heparin，LMWH)已在外科手術(shù)及腎透析期間用作臨床抗凝血藥物。例如，磺達(dá)肝素鈉 (CAS114870-03-0)是化學(xué)名稱為0- [2-脫氧-6-0-磺酸基-2-(磺酰胺基）-a-D-吡 喃葡萄糖]-(1-4) -0- (β-D-吡喃葡萄糖醛酸）-(1-4) -0- [2-脫氧-3，6-二-0-磺酸 基-2-(磺酰胺基）-a-D-吡喃葡萄糖]-(1-4)-0-(2-0-磺酸基-a-L-吡喃艾杜糖醛 酸）-(1-4) -0- [2-脫氧-1-0-甲基-6-0-磺酸基-2-(磺酰胺基）-a-D-葡萄吡喃糖苷] 十鈉鹽的寡糖/肝素中的一員，由Choay，S.A.研發(fā)（參見美國專利第4,818,816號）。該 化合物是一合成的戊多糖因子Xa抑制劑，其用作預(yù)防經(jīng)骨外科手術(shù)的患者的深層靜脈栓 塞以及治療深層靜脈栓塞及肺栓塞的抗凝血藥物?；沁_(dá)肝素鈉于2001年經(jīng)美國食品藥物 管理局批準(zhǔn)，以商品名Arixtra?出售。磺達(dá)肝素鈉為皮下用藥。
[0004] 肝素及硫酸乙酰肝素分析方法在傳統(tǒng)上涉及逆相層析及質(zhì)譜（MS)技術(shù)，但因硫 酸乙酰肝素的高極性、結(jié)構(gòu)多樣性及硫酸鹽不穩(wěn)定性而存在限制。例如，使用MS對于合成 的多硫酸化寡糖進(jìn)行定量受到限制，因?yàn)槎嗔蛩峄烟请x子化時(shí)易于形成多種類型硫酸根 基團(tuán)損失的片段及金屬陽離子偶合加成物，這會導(dǎo)致更大的質(zhì)譜復(fù)雜性及信號分裂。另外， 在分析期間難以顯示硫酸根基團(tuán)的損失程度，因?yàn)槠淙Q于硫酸化寡糖的濃度及電荷態(tài)。 改良的多硫酸化寡糖分析方法是多組研究團(tuán)隊(duì)的目標(biāo)。
[0005] Catalin等人（Anal.Chem. 2009,81，3485)及Tatiana等人（Anal.Chem. 2006， 78,1774)已分別闡述了通過使用電噴灑游離質(zhì)譜（ESI-MS)及基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜 (MALDI-MS)來表征多硫酸化寡糖。然而，目前使用液相層析（LC)與質(zhì)譜偶聯(lián)的方法無法提 供在線過程內(nèi)層析峰的解析/分離且因此在產(chǎn)生合成的多硫酸化寡糖期間無法建立結(jié)構(gòu) 相關(guān)雜質(zhì)的鑒定和/或多硫酸化寡糖的定量。
[0006] Imanari等人（J.Chromatogr.，A1996, 720, 275.)及Rice等人（J.Anal. Biochem. 1985,150, 325.)闡述了借助強(qiáng)陰離子交換層析（SAX)分析多硫酸化寡糖的方法。 此方法使用電荷密度差異來分離高度硫酸化寡糖，但因在流動相組合物中使用非揮發(fā)性鹽 類，故仍難以直接將SAX與像MS的檢測方法偶聯(lián)。
[0007] 與多硫酸化寡糖分析方法相關(guān)的另一些問題是因多硫酸化寡糖的非發(fā)色特性 (極低UV吸收）所致，此會限制傳統(tǒng)UV檢測器的使用。其他通用檢測器（例如折射率（RI) 檢測器及蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD))亦對多硫酸化寡糖缺乏足夠檢測靈敏度。
[0008] 盡管已公開了一些多硫酸化寡糖檢測方法，但仍存在多種限制。因此，仍需要改良 用于多硫酸化寡糖的分離、定量及質(zhì)量（mass)鑒定的方法。本文所公開的穩(wěn)定、靈敏且過 程中控制（in-processcontrol，IPC)方法解決了此需要及其他需要。 發(fā)明概要
[0009] 本文提供使用與電離子檢測器（chargedaerosoldetector，CAD)或質(zhì)譜儀（MS) 偶聯(lián)的親水性相互作用超高效液相層析儀（HILIC-UPLC)檢測多硫酸化寡糖的方法。本文 所提供方法使得峰分辨率改良，因而允許樣品中多硫酸化寡糖和/或雜質(zhì)的后續(xù)定量。
[0010] HILIC的使用克服了滯留及分離極端極性寡糖的挑戰(zhàn)。HILIC的滯留機(jī)制極為復(fù) 雜且為液液分配、吸附、離子相互作用及疏水性相互作用的多模式組合。因此，與逆相液相 層析（RPLC)相比，HILIC提供獨(dú)特的選擇性及滯留特性。
[0011] 如本文所述，在一組實(shí)施例中，用于HILIC管柱中的固定相是酰胺鍵合固定相。
[0012] 在另一實(shí)施例中，用于HILIC管柱中的流動相包含鹽類。在一組實(shí)施例中，該鹽類 為甲酸銨。與甲酸吡啶鑰鹽及乙酸銨相比，甲酸銨的使用對滯留、選擇性提供更佳的性能及 低噪聲基線。
[0013] 在一些實(shí)施例中，鹽類濃度高于50mM。在一些所選實(shí)施例，濃度高于100mM。通常， 流動相組合物中鹽添加劑的摩爾強(qiáng)度會對層析滯留、選擇性及靈敏度具有顯著影響。隨著 鹽添加劑的摩爾濃度增加，液液分配相互作用壓制了流動相與溶質(zhì)的離子強(qiáng)度，其支配了 滯留機(jī)制而非離子交換作用。然而，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在酸性分析物（例如多硫酸化寡糖）的情形 下，滯留隨著鹽添加劑的摩爾濃度增加而增強(qiáng)。具體而言，峰分辨率由于鹽濃度自50mM增 加至約200mM而得以進(jìn)一步改良。
[0014] 在一組實(shí)施例中，用于HILIC管柱中的流動相的溶劑為乙腈。
[0015] 在一些實(shí)施例中，用于定量多硫酸化寡糖的檢測器是電離子檢測器（CAD)。在使 用CAD進(jìn)行分析期間，用電離氣體（通常為氮?dú)猓┦轨F化粒子帶電。在去除高流動性粒子 (主要為過量N2離子）后，對霧化粒子實(shí)施電測量。最重要的是，已證實(shí)該方法對非揮發(fā)性 分析物提供獨(dú)立于其性質(zhì)的均一響應(yīng)。因此，⑴HILIC或HILIC-UPLC的分離技術(shù)與（2)諸 如MS或CAD的檢測技術(shù)的組合使得多硫酸化的檢測、鑒定和/或定量能夠進(jìn)行，因而提供 用于分析合成多硫酸化寡糖的有效方式。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例，借助本文所述方法檢測和/或定量的多硫酸化寡 糖為磺達(dá)肝素鈉。
【附圖說明】
[0017] 圖 1 (a)提供使用Merck,SequantZic?-Hi丨ic(3. 5um2. 1X250mm)的橫達(dá)肝素 鈉的HILIC-CAD色譜圖。
[0018] 圖 1 (b)提供使用Merck,SequantZidpHilie(5um4. 6X150mm)的橫達(dá)肝素鈉 的HILIC-CAD色譜圖。
[0019] 圖 1 (c)提供使用Phenomenex,SynergiPolar-RP(4um4. 6X250mm)的橫達(dá)肝素 鈉之HILIC-CAD色譜圖。
[0020] 圖 1 (d)提供使用Phenomenex,SynergiFusion-RP(4um4. 6X150mm)的橫達(dá)肝素 鈉的HILIC-CAD色譜圖。
[0021] 圖 1 (e)提供使用SepaxPolar-Pyridine(1. 8um2. 1X150mm)的橫達(dá)月干素鈉的 HILIC-CAD色譜圖。
[0022] 圖 1 (f)提供使用ES，EpicDiol(1. 7um2· 1X150mm)的磺達(dá)肝素鈉的HILIC-CAD 色譜圖。
[0023] 圖 1 (g)提供使用Waters,AcquityBH1HILIC(1. 7um2. 1X150mm)的磺達(dá)肝素鈉 的HILIC-CAD色譜圖。
[0024] 圖 1 (h)提供使用Waters,AcquityΒΕ?Amide(1. 7um2. 1X1 50mm)的橫達(dá)肝素鈉 的HILIC-CAD色譜圖。
[0025] 圖2提供使用Waters,ΒΕ?Amide管柱（a)全圖及（b)局部放大圖的磺達(dá)肝素鈉 的色譜圖。
[0026] 圖3提供了使用不同類型鹽（a) 50mM甲酸銨（b)lOOmM甲酸銨（c)lOOmM甲酸吡啶 鑰鹽及（d)50mM乙酸銨進(jìn)行分析的藥物成分的局部放大色譜圖。
[0027] 圖4提供了使用不同濃度甲酸銨（以局部放大圖表示）（a) 50mM(b)lOOmM(c) 125m M(d)150mM(e)175mM及（f)200mM進(jìn)行分析的藥物成分局部放大色譜圖（以局部放大圖表 示）。
[0028] 圖5提供了對流動相使用不同有機(jī)溶劑（a)流動相A: 200mM甲酸銨；流動相B:丙 酮及乙腈，1/1 (b)流動相A:200mM甲酸銨；流動相B:乙腈作為流動相進(jìn)行分析的藥物成分 色譜圖（以局部放大圖表示）。
【具體實(shí)施方式】
[0029] I.槪述
[0030] 本文提供針對多硫酸化寡糖研發(fā)的簡明過程中分析方法，其涉及分別應(yīng)用 HILIC-UPLC、CAD及MS進(jìn)行分離、定量及質(zhì)量鑒定。在制造期間的過程中控制（inprocess control,IPC)對于在高度硫酸化寡糖的全合成中確保質(zhì)量控制至關(guān)重要。本文所述分析方 法可用作IPC方法。有利地，本文所述分析方法穩(wěn)定、易于使用、靈敏，且在期望產(chǎn)率內(nèi)確保 有質(zhì)量的化學(xué)實(shí)體的制造。
[0031] II.本發(fā)明實(shí)施例
[0032] 鑒于上文，本文提供用于檢測及定量樣品中一或多種多硫酸化寡糖的方法，該方 法包含：
[0033] (a)在與電離子檢測器（CAD)或質(zhì)譜儀（MS)偶聯(lián)的親水性相互作用超高效液相層 析儀（HILIC-UPLC)管柱上對該樣品實(shí)施層析，其中用于HILIC管柱中的固定相為酰胺鍵合 固定相；及
[0034] (b)測定該樣品中多硫酸化寡糖的量。
[0035] 用于本方法中的樣品通常是多硫酸化寡糖的合成制造方法的產(chǎn)物。因此，可根據(jù) 本方法借助選擇反應(yīng)混合物的試樣來分析合成程序中最終步驟的樣品。反應(yīng)混合物的取樣 允許雜質(zhì)和/或多硫酸化寡糖的檢測和/或定性和/或定量。反應(yīng)混合物的取樣亦允許反 應(yīng)的完成程度的測定?？蛇x地，可對最終產(chǎn)物實(shí)施本方法以確定是否需要進(jìn)一步純化。
[0036] 使用親水性相互作用超高效液相層析儀的層析條件將通常涉及本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的那些條件，包括（但不限于）管柱選擇（大小、長度及固定相）以及流動相和/或流 動相的pH。
[0037] 管柱的選擇將通常涉及自市售管柱（例如那些購自Waters,ThermoFisher,Merck ，Phenomenex,Shodex,Nucleosil,和Sepax)的選